פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Summary

כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר.

Abstract

תרבות explant מאפשרת מניפולציה של פיתוח איברים בנקודות זמן ספציפי ולכן שיטה חשובה לביולוג התפתחותי. לאיברים רבים שקשה לגשת לפיתוח רקמות על מנת לאפשר ניטור בזמן vivo התרבות לשעבר. שיטת התרבות הפרוסה מאפשרת גישה לרקמה, כך שיכולות להיות אחרי תנועות morphogenetic ואוכלוסיות תאים ספציפיות יכולות להיות ממוקדות עבור מניפולציה או התחקות שושלת.

במאמר זה אנו מתארים שיטה של ​​התרבות הפרוסה שהייתה מוצלח מאוד לתרבות של חיידקי שן במגוון מינים. השיטה מספקת גישה מצוינת לחיידקי השן, אשר לפתח בקצב דומה לזה שנצפה בvivo, מוקף ברקמות לסת האחרות. זה מאפשר אינטראקציות רקמות בין השן והרקמה שמסביב כדי להיות במעקב. למרות שמאמר זה מתמקד בחיידקי שן, באותו הפרוטוקול ניתן ליישם כדי לעקוב אחר התפתחותם של מספרשל איברים אחרים, כגון בלוטות רוק, סחוס של מקל, בלוטות באף, בלשון, ובאוזן.

Introduction

עבור מספר הניסויים חשוב להיות מסוגלים רקמות תרבות vivo לשעבר לעקוב אחר התפתחות. תרבות של פיתוח רקמה מספקת גישה בתקופות מוגדרות של פיתוח ומאפשרת מניפולציה של גנים על ידי התוספת של גורמים למדיום התרבות, או בחרוזים טעונים, ועל ידי השימוש בtransfection electroporation ^ו1. בניסויים רבים, חשוב להיות מסוגל לדמיין את הרקמה ככל שהוא גדל, לדוגמא, כדי לעקוב אחר גורלם של תאי שושלת מתויגת כרקמה עוברת המורפוגנזה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד לרקמות המתפתחות עמוק בתוך העובר, שאינן ברורים כאשר בלוק של רקמות מן העובר הוא תרבותי. שיניים הן דוגמאות טובות לכך, כפי שהם מפתחים בתוך תהליך האף הלסת התחתונה, הלסת העליונה וקדמי. כאשר כל הלסת התחתונה היא בתרבית ניתן לראות המבנים השטחיים של השן אך ניתן לנתח שינויים במורפולוגיה רק ​​לאחר חתך של רקמה קבועה 3. תרבויות הפרוסה אלה היו מאוד שימושיות באופן ישיר הבא המורפוגנזה של השן, ומאפשר איתור שושלת של רכיבים שונים, כגון קשר האמייל ואת הגבשושיות וזקיק ^1,4-7 שיניים. הטכניקה אינה מוגבלת לעוברי עכברים והצלחה כבר בשימוש לפרוסות תרבות חיות של חזיר ^ו8,9 רקמות שיניים נחש. בנוסף ליתרון של להיות מסוגל לדמיין התפתחות שן, שיטת פרוסה גם יש את היתרון שהפרוסות הדקיקות של רקמה הגדילו את הגישה לחומרים מזינים מבינונית ואוויר מהחממה. התוצאה היא צמיחה משופרת של חיידקי השן, אשר תואם את פיתוח in vivo, וinvas המופעיון של תאי האנדותל לפטמית ^7. לעומת זאת, חיידקי שן בתרבויות לסת תחתונה כולו לפתח איטיים יותר מאלה in vivo ומרכז התרבות הוא לעתים קרובות נמקים בתרבויות לטווח ארוך. בתרבות הפרוסה, השן מתפתחת בתוך פרוסה של הלסת, והאינטראקציה שלה עם העצם מתפתח סביב ורקמות אחרות יכולה להיות במעקב. בשיטה שלנו הרקמה קצוצה ישר אחרי נתיחה ללא צורך להטביע במדיום תמיכת ^10,11 ואין צורך בכל מערכת לצרף את הרקמה לקרש החיתוך. השיטה היא לכן לא פולשנית ומהירה, המאפשרת ללסתות רבות להיות מחולקים בפגישה אחת.

Protocol

1. להקים

1. חידוד המכשירים לנתיחה (באמצעות אבן השחזה משומנת עם שמן מינרלים) ולעקר לפני השימוש לתרבות איבר באמצעות 70% תרסיס אתנול ועיקור יבש חום. לחדד את המחטים לנתיחה באמצעות אלקטרוליזה ב2 M נתרן הידרוקסידי באמצעות הספקה 12V.
2. הכן את מדיום התרבות המשמש לנתיחה והתרבות של איברים עובריים, בהיקף של F12 של מתקדם השתנה Dulbecco נשר בינוני (F12 DMEM) בתוספת 1% Glutamax ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.

2. Dissection עובר

1. לברור נקבה בהריון הזדווגו מתוזמן באמצעות שיטת לוח זמנים אחד כפי שאושר על ידי משרד הפנים או גוף מנהל אחר. משם לנתח את העור באזור הבטן התחתון, וחתך את הבטן באמצעות מספריים. אתר את שתי קרנות הרחם, אשר מתחברות יחד על קו האמצע התחתון.
2. לנתח את הרחם ואת המקום בצינור מלא בינוני על קרח. When על קרח, הרקמה ניתן להשאיר לכמה שעות.
3. הסר את הרחם ומניחים בצלחת פטרי במדיום מתחת למיקרוסקופ. איפה יש לבצע ניתוחי עובר אפשריים במינרית זרימת מכסה המנוע כדי למזער את הזיהום.
4. לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic.
5. לערוף את העוברים באמצעות מחט טונגסטן ולהעביר את הראשים לתוך צלחת טרי של מדיום.
6. לבודד את הלסתות מראשי על ידי הצבת מחט לתוך חלל הפה ולחתוך לכיוון החלק האחורי של הראש (איורים 1 א ו 1 ב '). לסתות מבודדות יכולות להיות מאוחסנות באופן זמני במדיום על קרח בעת שהמתינו לקיצוץ.
7. לפרוסות לסת תחתונה כל שלבי E11.5-E15.5 הם אידיאלי עבור תרבות נבט שן. לאחר E15.5 העצם מתפתח בלסת התחתונה הוא קשה מדי לקיצוץ. פרוסות שיניים עדיין יכולות להתבצע אך העצם (עצם מכתשיים dentary ויוצרים) חייב להיות ראשון הוסר על ידינתיחה לפני קיצוץ ^9. הסרת עצם בזהירות באמצעות מחטי טונגסטן ומלקחיים.

3. חיתוך עובר

1. הכן את פרוסות רקמת הלסת התחתונה באמצעות מסוק רקמת שולחן סטנדרטי (איור 1 ג). השתמש בלהב חדש לאחר כ 200 לסתות, ולוודא שהוא נמצא מיושר עם דיסק ההתקנה כאשר הוא נופל.
2. נקה את תקליטור ההתקנה ולהב עם אתנול 70% לפני השימוש. יש לנקוט זהירות בעת שימוש במכונה, כפי שהלהב הוא חד מאוד.
3. הגדר את המסוק במרחק חיתוך של בין 200-400 מיקרומטר בהתאם לגיל של הדגימה, ותלויים אם נדרש כל נבט השן. הגדר את כוח הלהב על מקסימום.
4. העבר את לסת תחתונה לדיסק הרכבת הפלסטיק באמצעות פיפטה או מלקחיים. מסדרים את הלסת התחתונה על הדיסק כדי לוודא את הכיוון הוא עדיין ברור. לשון הפיתוח יכולה לשמש ציון דרך שימושית לקביעת כיוון. לaf שימוש טוחנותrontal / נטייה רוחבית (ראה מטוס של קיצוץ באיור 1 ב '), ואילו לחותכות להשתמש פרוסה sagittal דרך הלסת התחתונה על מנת לשקף את הכיוון של שיניים אלה שונים כאשר הם גדלים (ראו מטוס של קיצוץ באיור 2 א).
5. הסר את המדיום העודף מרחבי הרקמות באמצעות נייר סינון על מנת לייבש את הלסת התחתונה על דיסק ההרכבה מעט.
6. מייד לאחר ייבוש, הנח את הדיסק על שולחן הנירוסטה העגול של המסוק. הדלק את המכשיר ולחץ להתחיל. השולחן עובר באופן אוטומטי משמאל לימין ואילו באותו הזמן זרוע ביצוע קיצוץ הלהב עולה וירד במהירות של עד 200 משיכות / דקה.
7. כבה את המחשב ברגע שהרקמה כבר פרוסות לחלוטין. ודא זרוע הלהב היא במצב המורם ולהסיר את הדיסק. אל תניח את אצבעות מתחת לזרוע הלהב או להשאיר את המכונה ללא השגחה כאשר קיצוץ.
8. קח את דיסק ההרכבה ולהוסיף t הבינוני באופן מיידיo את הפרוסות על הדיסק על מנת למנוע ייבוש מוגזם. לעקור בזהירות את הרקמה הפרוס מהחלק התחתון של הדיסק באמצעות מחט טונגסטן ולאחר מכן טפטפת לתוך צלחת פטרי קטנה של מדיום (איור 2 א).
9. הפרד את הפרוסות באמצעות מחט ולאחר מכן בחר את פרוסות רקמה המכילות הרקמות של עניין תחת סטראו (1D דמויות, 1E, ו2B). מניחים פרוסות נבחרות בתרבות מנות טריות עם מדיום.

4. פורסים תרבות

1. הכן מנות התרבות מרכזיות היטב איבר מוכנות לתרבות על ידי הוספה כ 2 מיליליטר של מים autoclaved אל הבאר החיצונית על מנת למנוע התייבשות, ועל ידי מיצוב רשת מתכת על פני מרכז הצלחת (3A דמויות ו3B).
2. הכן את רשתות מתכת על ידי חיתוך רצועות כ 4 סנטימטר x 1.5 סנטימטר מיריעות של רשת הנירוסטה. השתמש ניקוב חורים לעשות חור במרכז ולכופףהצדדים כדי ליצור סוף מעד. הרשת צריכה להתאים שטוחה על פני הבאר המרכזית, שוכבת במקביל לתחתית הצלחת (3A דמויות ו3B). החיטוי הרשתות לעקר לפני השימוש.
3. חותכי חתיכת קרום (PET) (גודל נקבובית 0.4 מיקרומטר) גדול מספיק כדי לכסות את החור ברשת של terephthalate פוליאתילן השקוף. מניחים את הקרום לחתוך לתוך הצלחת עם הפרוסה שנבחרה.
4. מניחים את הפרוסה על גבי הקרום ולאחר מכן הרם בזהירות את הקרום מבינוני, עם פרוסה שיטחה במרכז.
5. הנח את המסנן על הרשת מעל החור העגול במרכז, ולהוסיף כ 1 מיליליטר של מדיום תרבות היטב, עד לרמה של הממברנה.
6. למניפולציות להוסיף חלבונים או מעכבי מולקולה קטנים לבינוניות (לדוגמא ^8).
7. לצלם את הפרוסה לשיא של מורפולוגיה ביום 0 של התרבות.
8. מניחים את הכלים באווירת humidified של 5% CO
9. לצלם את התרבויות במרווחי זמן קבועים בממוצע 7 ימים. לשנות את התרבות בינונית בכל שעה 48-72. לצילום להציג את הפרוסות עם מקור אור מלמטה (איורים 2C-E).

5. איתור שושלת

אם נדרש איתור שושלת, ניתן להזריק לתוך נבט שן צבעי lipophilic כגון DiI או Dio לפני שלב 4, התרבות הפרוסה.

1. משוך מחטי זכוכית נימים באמצעות חולץ מחט.
2. לשבור את קצה המחט באמצעות מלקחיים ומניח את הקצה למטה לתוך תמיסת הצבע. השאר לכמה דקות בזמן שהצבע ממלא את הקצה על ידי פעולת נימים.
3. מניחים את המחט מלאה לבעל ולצרף דרך צינורות אל aspirator מזרק או פה.
4. מקם את קצה המחט במדיום תרבות נגיעה באזור של הפרוסה בשל להיות מתויגים. החל לחץ אוויר כדי לתפוס כמות קטנה של צבע מתוך המחטד על גבי הרקמה.
5. הסר את המחט ולבדוק לתיוג תחת הקרינה.
6. ניתן להעביר פרוסות כותרתו בהצלחה למסננים ותרבותיים כפי שמתואר בשלב 4.

Representative Results

על מנת לעקוב אחר התנועה של זקיק השיניים טוחנת הראשון, נלקחו 250 מיקרומטר פרוסות קדמיות דרך לסת תחתונה בשיטה שתוארה לעיל. זקיק השיניים הוא השכבה של mesenchyme שמקיף את האפיתל האמייל החיצוני (OEE) של השן המתפתחת, ובעבר הוכח לקחת חלק בהיווצרות של רקמה של periodontium ^6. לסתות נותחו בE14.5, שלב הכובע של התפתחות שן. בפרוסה את קווי המתאר של אפיתל השיניים היו ברור, וmesenchyme השיניים העיבוי יכול להיות מזוהה כטבעת כהה מסביב (איור 4 א) אפיתל השן. DiI הוזרק בmesenchyme ליד האפיתל האמייל החיצוני של פרוסת השן בצד הלשוני (איור 4 א). לאחר התיוג את הפרוסות היו בתרבית למשך 4 ימים וצילמו במרווחים (4B דמויות ו4C). בvivo חיידקי השן היה מגיעיםשלב הפעמון על ידי E18.5, וצורת במה פעמון ברורה נצפו בפרוסות, מה שמעיד על התקדמות דומה על פני פרק זמן זה. המקום של DiI נתפס להאריך ללהקה של תאים המשתרעים סביב אפיתל השיניים החיצוני כשן גדלה (4B דמויות ו4C).

איור 1. כינונה של פרוסות חיות. () עובר E14.5. קווים מקווקווים מציינים מטוסים לחתוך עם איזמל מנתחים, מתחילים עם החתך נמוך יותר לעריפת הראש. (ב) גזור לסת תחתונה. הלשון פונה כלפי מטה. מטוסו של הסעיף למסוק הרקמות מוצג באמצעות קווים מקווקווים. (C) מסוק רקמות מראה זרוע להב (BA) ודיסק לבן הרכבה (MD) עם דגימה מוכנה (חץ). פרוסת נציג (ד ') באמצעות טוחנתאזור. חיצים מצביעים על חיידקי שן טוחנות. (ה) מתח גבוה נוכח הפרוסה טוחנת. אפיתל נבט השן מסומן בכתמים שחורים. תמונות חידדו באמצעות Photoshop. ט = לשון, עצם DB = Dentary, סחוס של MC = המקל. סרגל קנה מידה ב= 3 מ"מ. סרגל קנה מידה בB & D = 1 מ"מ. בר הסולם ב E = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. חותך ותרבות בלוטה. () E12.5 לסת תחתון שכבר קצוץ sagittally. חותכות פיתוח (כתמים לבנים שתוארו עם כוכבית) ובלוטות submandibular (מסומנת בכתמים שחורים ומחודד) ניתן פשוט עשו החוצה. (ב) אותו לסת תחתונה מראה 4 פרוסות מרכזיות מופרדת החוצה. פיתוח ג הבלוטה submandibularלהיראות כמו ניצן המוקף mesenchyme תמצית (ראשי חץ) בשני חלקים לרוחב יותר (החלק העליון של תמונה). Mesenchyme העיבוי מסביב לבלוטה מתואר באדום. החותכות נמצאות בשלב עיבוי אפיתל (אסטריקס) בשתי פרוסות מרכזיות (החלק התחתון של תמונה). (C) פרוס sagittal דרך שן חותכת בE14.0 ביום 0. אותו פרוסה (ד ') יום 1 מאוחר יותר. (ה) את הפרוסה אחרי 3 ימים בתרבות. נקודות (CE) לחץ שן חותך ויוצרים לולאה בצוואר הרחם שפתני. ראש חץ מצביע על פיתוח בלוטת submandibular. בתרבות נבט השן משתרע לאחור כלולאות צוואר הרחם לגדול, בעוד שבלוטת הרוק ממשיכה לעבור הסתעפות המורפוגנזה והיווצרות לומן. תמונות חידדו באמצעות Photoshop. ט = לשון, סחוס של MC = המקל. סרגל קנה מידה ובארוחת בוקר = 1 מ"מ. סרגל קנה מידה בC, D, E = 500 מיקרומטר. לחץ כאןכדי להציג דמות גדולה.

איור 3. הפרוסה מתורבתת שיטת תרבות. (). התרבות יושבת על מסנן שקוף התלוי מעל בינוני באמצעות רשת מתכת. חור ברשת מאפשר לפרוסה להיות דמיינו עם אור מלמטה. סכמטי (ב) לשיטת התרבות.

איור 4. תיוג DiI של זקיק השיניים. (AC) שמוזגו תמונות אור ושדה חשוך מראים פיתוח נבט שן טוחנת ואת מיקום של תווית שושלת DiI. () יום 0. נבט השן (ראש החץ) הוא בשלב הכובע. DiI תוויות בתאים של זקיק השיניים בצד הלשוני של השן. (B (ג). נבט השן הגיע שלב הפעמון ותאי DiI שכותרתו נראים להתפזר בקשת סביב אפיתל האמייל החיצוני בפיתוח. תמונות כבר חידדו בפוטושופ לאחר מיזוג שכבות שימוש במצב המסך. האפיתל של שן התווה עם כתמים שחורים. DP = פטמית שיניים שוכבת בתוך האפיתל האמייל הפנימי. DF = זקיק שיניים, אשר פועל ברחבי אפיתל האמייל החיצוני. MC = סחוס של מקל. סרגל קנה מידה בA, B, C = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Discussion

שיטה זו של תרבות שן יש את היתרון שהגישה לניבט השן הוא מצוין, המאפשר ייחוס מדויק באיתור מיקום של חרוזים בתוך האפיתל או mesenchyme. באזורים מוגדרים של נבט השן המתפתח יכולים להיות ממוקדים ולכן באופן ספציפי. במהלך תרבות המורפולוגיה המשתנות של נבט השן יכולה להיות אחריו, ואת ההשפעה של מניפולציות העריכה במהירות.

השיטה, לעומת זאת, מתאימה רק לחיידקי שן צעירים לפני היווצרות משמעותית של רקמות קשות, כגון הדנטין ואמייל, שכן אלה לא ניתן קצוצים בצורה מדויקת. ללסתות לאחר E15.5 יש צורך להסיר את העצם לפני הקיצוץ. זה יש לו את החסרון של אפשרות לפגוע בניבט השן, אשר קשור קשר הדוק עם העצם מE16.5. יש לנו פרוס בהצלחה חיידקי שן גזור עד יום לידה 4, אחרי שהשן הופכת להיות קשה מדי עבור המסוק לחתוך בשל התצהיר של אמייל. מ 'פרוסהethod עובד גם על חיידקי שן מE13.5, כלומר שלב הניצן ^1,6. לפני נקודת זמן זו, כאשר השן היא בשלב עיבוי אפיתל, חיידקי השן לעשות לפתח אבל שיעור ההצלחה הוא מצומצם והמורפולוגיה יכולה להיות מושפעת בטווח הארוך.

חסרון עיקרי אחד עם השיטה הוא שהקיצוץ מתרחש באופן אקראי דרך השן. בכמה פרוסות נבט שן כולה יימצא בתוך פרוסה, ואילו באחרים המסוק עשוי לחתוך את נבט השן דרך האמצע. משמעות הדבר היא כי זה עלול להיות קשה כדי להשיג מספר גדול של פרוסות זהות. כדי להילחם בבעיה זו, ניתן לחלק את הפרוסה באמצע ולהשתמש בימין ובצד שמאל כניסיוני ובקרה. לשם כך, עם זאת, הלסת התחתונה חייבת להיות ממוקמת היטב בדיסק החיתוך כדי להבטיח את הפרוסה נחתך באופן סימטרי. עבור חלק מניסויים זה יתרון שיש פרוסות שלנתח את השן כך שמבנים פנימיים, כגון האמיילקשר, ניתן לגשת לתיוג שושלת ^4. נבט השן מופיע חזק מאוד וחיידקי שן חצי כזה יכולים להתפתח היטב בתרבות, כפי שהראו בעבר בחיידקי שן טוחנות חצויים ^12,13.

כחלופה לפורסת תרבות, יכולים להיות גזורים חיידקי שן מהלסת התחתונה והתרבית בבידוד ^14. פעולה זו מסירה את הבעיה של תזונה לקויה וחמצון הקשורים culturing בלוקים גדולים של רקמה ומובילה להתפתחות שן טובה, אבל כתוצאה מכך השן מתפתחת ללא אינטראקציה עם הרקמה הסובבת. כאשר כמויות גדולות של mesenchyme סביב יוסרו מספר חיידקי שן כי טופס ניתן לשנות, המדגיש את החשיבות של mesenchyme מסביב להתפתחות שן רגילה ^15. התרבות פרוסה לכן שיטה טובה ללימוד האינטראקציות של רקמות, למשל איך העצם ושן האינטראקציה בהיווצרות עצם מכתשיים, או איך סאלילהשתנות בלוטות אינטראקציה עם הלשון ואפיתל האוראלי, משהו שהולך לאיבוד כאשר הרקמות אלה בתרבית בבידוד.

מאמר זה מדגיש את השימוש בשיטה זו לculturing חיידקי השן אך באותה השיטה היא גם מצוינת לculturing בלוטות submandibular וsublingual פיתוח ועוקב אחר התפתחותו של מבנה כמו סחוס של מקל (איור 2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers