Summary
Hier hebben we detail een methode om cultuur tand ziektekiemen in onderkaak plakjes met een tissue chopper. Deze methode maakt het mogelijk unieke toegang tot de tand tijdens de ontwikkeling, het verstrekken van uitstekende gelegenheid voor manipulatie en lineage tracing, niet beschikbaar gebruik van meer traditionele kweekmethoden.
Abstract
Explantaatkweek staat manipulatie van het ontwikkelen van organen op specifieke tijdstippen en is daarom een belangrijke methode voor het ontwikkelings bioloog. Voor veel organen is moeilijk toegankelijk ontwikkeling weefsel controle tijdens het ex vivo kweken mogelijk. De slice cultuur methode maakt het mogelijk de toegang tot weefsel zodat morfogenetische bewegingen kunnen worden gevolgd en specifieke celpopulaties kan worden gericht voor manipulatie of lineage tracing.
In dit artikel beschrijven we een methode slice cultuur die zeer succesvol voor de cultuur van de tand ziektekiemen in een aantal soorten is geweest. De methode biedt een uitstekende toegang tot de tand kiemen, die zich ontwikkelen met een vergelijkbaar percentage met dat waargenomen in vivo, omringd door de andere kaak weefsels. Dit maakt weefsel interacties tussen de tand en het omringende weefsel te controleren. Hoewel dit document richt zich op de tanden kiemen kan hetzelfde protocol worden toegepast om de ontwikkeling van een doorlooptandere organen, zoals speekselklieren, Meckel's kraakbeen, nasale klieren, tong en oren.
Introduction
Bij een aantal experimenten is het belangrijk om te kunnen cultuur weefsel ex vivo ontwikkeling te volgen. Cultuur ontwikkelen weefsel worden bereikt in bepaalde perioden van ontwikkeling en staat manipulatie van genen door de toevoeging van elementen aan het kweekmedium, of beladen kralen, en door middel van transfectie en elektroporatie 1. Voor veel experimenten is het belangrijk om het weefsel te visualiseren als het groeit, bijvoorbeeld om het lot van afstammings gemerkte cellen volgen het weefsel ondergaat morfogenese. Dit kan bijzonder problematisch zijn voor weefsels die diep in het embryo ontwikkelt, die niet duidelijk wanneer een blok van weefsel van het embryo gekweekt. Tanden zijn goede voorbeelden van deze, als ze zich ontwikkelen in de onderkaak, bovenkaak en frontaal nasale proces. Wanneer de gehele onderkaak wordt gekweekt de oppervlakkige structuren van de tand kan worden bekeken, maar veranderingen in morfologie kunnen alleen worden geanalyseerd na het snijden van vaste weefsels
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instellen
- Slijp de dissectie-instrumenten (met behulp van een slijpsteen gesmeerd met minerale olie) en steriliseren vóór gebruik op orgelcultuur met behulp van een 70% ethanol spray en droge warmte sterilisatie. Slijp de dissectie naalden met behulp van elektrolyse in 2 M natriumhydroxide met een 12 V voeding.
- Bereid het kweekmedium voor de dissectie en kweek van embryonale organen, bestaande uit geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) aangevuld met 1% GlutaMAX en 1% penicilline-streptomycine.
2. Embryo Dissection
- Cull een getimede gepaard zwangere vrouw met behulp van een schema een methode goedgekeurd door het ministerie van Binnenlandse Zaken of ander bestuursorgaan. Ontleden weg de huid rond de onderbuik, en opengesneden de buik met een schaar. Zoek de twee baarmoederhoorns, die met elkaar te verbinden op de lagere middellijn.
- Ontleden de baarmoeder en in een buis gevuld met medium op ijs. When op het ijs, kan het weefsel worden gelaten voor meerdere uren.
- Verwijder de baarmoeder en in een petrischaal in medium onder de microscoop. Waar mogelijk embryo dissecties in een laminaire stroming kap worden uitgevoerd om besmetting te minimaliseren.
- Ontleden de embryo's uit de baarmoeder en hen bevrijden van hun extra-embryonale weefsels.
- Onthoofden de embryo's met behulp van een wolfraam naald en breng de hoofden in een verse schotel van medium.
- Isoleer de kaken van de koppen door een naald in de mondholte en doorsnijden naar de achterkant van het hoofd (Figuren 1A en 1B). Geïsoleerde kaken kan tijdelijk worden opgeslagen in medium op ijs tijdens het wachten voor het hakken.
- Voor gehele onderkaak plakjes stadia E11.5-E15.5 zijn ideaal voor tandkiem cultuur. Na E15.5 de ontwikkelende bot in de onderkaak is te hard voor het hakken. Tand plakken kan nog steeds worden gemaakt, maar het bot (dentary en de vorming van alveolaire bot) moet eerst worden verwijderd metdissectie voordat hakken 9. Verwijder bot voorzichtig met wolfraam naalden en pincet.
3. Embryo Snijden
- Bereid de onderkaak weefsel plakjes met behulp van een standaard tafel weefsel chopper (figuur 1C). Gebruik een nieuw blad na ongeveer 200 onderkaken, en zorg ervoor dat het gelijk ligt met de montageschijf bij het vallen.
- Maak de montageschijf en dozerblad met 70% ethanol voor gebruik. Voorzichtigheid is geboden bij gebruik van de machine, zoals het blad is zeer scherp.
- Stel de chopper op een snij meetbereik van 200-400 micrometer overeenkomstig de leeftijd van het monster, en afhankelijk of het geheel tandkiem vereist. Zet het mes werking op maximum.
- Transfer van een onderkaak om de plastic montage schijf met behulp van een pipet of tang. Schik de onderkaak op de schijf maken het zeker de oriëntatie is nog steeds duidelijk. De ontwikkeling tong kan worden gebruikt als een nuttige landmark voor het bepalen oriëntatie. Voor kiezen gebruik afRontal / dwarsrichting (zie vlak van het hakken in Figuur 1B), terwijl voor snijtanden gebruik een sagittale slice door de onderkaak naar de verschillende oriëntatie van deze tanden reflecteren als ze groeien (zie vlak van het hakken in figuur 2A).
- Verwijder het overtollige medium uit de hele weefsel met behulp van filtreerpapier om enigszins droog de onderkaak op de montageschijf.
- Direct na het drogen, plaats de schijf op de ronde roestvrijstalen tafel van de chopper. Zet het apparaat aan en druk op start. De tabel doorloopt automatisch van links naar rechts terwijl tegelijkertijd de snij arm die het blad omhoog en zette op tot 200 slagen / min.
- Schakel de machine uit zodra het weefsel volledig is gesneden. Zorg ervoor dat het mes arm is in de hoogste stand en verwijder de disc. Steek geen vingers onder het mes arm of laat de machine onbeheerd achter als het hakken.
- Neem de montageschijf en voeg onmiddellijk medium to de plakjes op de schijf, om uitdroging te voorkomen. Voorzichtig los gesneden weefsel van de bodem van de schijf met een wolfraam naald en vervolgens pipet in een kleine petrischaal drager (figuur 2A).
- Scheid de plakjes met behulp van een naald en selecteer vervolgens het weefsel plakjes met het weefsel van belang onder een stereomicroscoop (figuren 1D, 1E, en 2B). Plaats geselecteerde segmenten in verse cultuur gerechten met medium.
4. Slice Cultuur
- Bereid centrale putjes orgaan kweekschalen vinden die cultuur door toevoeging van ongeveer 2 ml geautoclaveerd water om de buitenste goed om uitdroging te voorkomen, en het positioneren van een metalen rooster in het midden van de schaal (Figuren 3A en 3B).
- Bereid metalen roosters door te snijden stroken ongeveer 4 cm x 1,5 cm van platen van roestvrij staal gaas. Gebruik een perforator om een gat in het midden maken en buigde zijkanten om een gespreid einde te maken. Het rooster moet vlak sluiten in de centrale put, die evenwijdig is aan de bodem van de schaal (Figuren 3A en 3B). Autoclaaf de roosters te steriliseren voor gebruik.
- Snijd een stuk transparante polyethyleentereftalaat (PET) membraan (poriegrootte 0,4 pm) groot genoeg is om de opening in het rooster bestrijken. Leg de gesneden membraan in de schaal met de geselecteerde slice.
- Plaats de slice op de top van het membraan en dan til het membraan uit het medium, met slice afgevlakt in het centrum.
- Plaats het filter op het rooster over het cirkelvormige gat in het midden en voeg ongeveer 1 ml kweekmedium de put, tot het niveau van het membraan.
- Voor manipulaties eiwitten of kleine molecule inhibitoren toevoegen aan het medium (bijvoorbeeld 8).
- Fotografeer de slice voor een record van morfologie op dag 0 van de cultuur.
- Leg de schalen in een vochtige atmosfeer van 5% CO
- Fotografeer de culturen regelmatig voor gemiddeld 7 dagen. Verander het kweekmedium elke 48-72 uur. Voor fotografie van de plakjes met een lichtbron van onderaf (Figuren 2C-E).
5. Lineage Tracing
Als lineage tracing nodig is, kan lipofiele kleurstoffen zoals DII of DiO worden geïnjecteerd in de tandkiem vóór stap 4, slice cultuur.
- Trek glazen capillair naalden met behulp van een naald trekker.
- Breek de punt van de naald met behulp van pincet en plaats punt naar beneden in de kleurstof oplossing. Laat enkele minuten terwijl de kleurstof vult de tip door capillaire werking.
- Plaats de gevulde naald in een houder en bevestig via slang aan een injector of mond afzuiger.
- Plaats de punt van de naald in het kweekmedium het gebied van het segment zal worden geëtiketteerd raken. Solliciteer luchtdruk om een kleine hoeveelheid kleurstof verdringen uit de naald eend op het weefsel.
- Verwijder de naald en controleer etikettering onder fluorescentie.
- Succes bestempeld plakjes kan worden overgedragen aan filters en gekweekt zoals beschreven in stap 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de beweging van de eerste molaire tand follikel volgen, werden 250 urn frontale plakjes genomen via een onderkaak met de hierboven beschreven werkwijze. De tandheelkundige follikel is de laag van mesenchym dat de buitenste glazuur epitheel (OEE) van de ontwikkelende tand omringt, en is eerder getoond deelnemen aan de vorming van weefsel van het parodontium 6. Onderkaken werden ontleed op E14.5, de dop stadium van tandontwikkeling. In het segment was de omtrek van de dentale epitheel helder en condensatie dentale mesenchym worden geïdentificeerd als een donkere ring rond de tand epitheel (figuur 4A). Dii werd geïnjecteerd in het mesenchym naast de buitenste glazuur epitheel van de tand segment aan de linguale zijde (Figuur 4A). Na het labelen van de plakjes werden gedurende 4 dagen en gefotografeerd met tussenpozen (Figuren 4B en 4C). In vivo de tand kiemen zou hebben bereiktde bel stadium door E18.5, en een duidelijke bell stadium vorm werd waargenomen in de plakken, wat wijst op een soortgelijke progressie gedurende deze periode. De spot van Dil werd gezien om uit te breiden naar een band van cellen die zich rondom de buitenste dentale epitheel als de tand groeide (figuren 4B en 4C).
Figuur 1. Vorming van levende plakjes. (A) E14.5 embryo. Binnen de lijnen geven de vliegtuigen gesneden met een dissectie naald, te beginnen met de onderste snede voor onthoofding. (B) Ontleed onderkaak. De tong naar beneden. Het vliegtuig van de afdeling voor het weefsel chopper wordt getoond met behulp van stippellijnen. (C) Tissue chopper tonen blade arm (BA) en witte montageschijf (MD) met voorbereide monster (pijl). (D) Vertegenwoordiger slice door de molaireregio. Pijlen wijzen naar maaltand ziektekiemen. (E) sterke vergroting van een kies slice. De tandkiem epitheel is geschetst met zwarte vlekken. Afbeeldingen geslepen met behulp van Photoshop. T = Tong, DB = Dentary bot, MC = Meckel's kraakbeen. Schaalbalk in A = 3 mm. Schaal bar in B & D = 1 mm. Schaal bar in E = 500 pm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Snijtand en klier cultuur. (A) E12.5 Kaak die is sagittally gehakt. Het ontwikkelen van snijtanden (geschetst witte vlekken met asterix) en submandibulaire klieren (omlijnd met zwarte vlekken en pijlen) kunnen alleen worden gemaakt. (B) Zelfde onderkaak toont centrale 4 plakjes afgescheiden. De ontwikkeling van glandula klier cEen gezien als een knop omgeven door gecondenseerde mesenchym (pijlen) in de twee laterale gedeelten (boven in beeld). De condenserende mesenchym rond de klier is geschetst in het rood. De snijtanden zijn op de epitheliale verdikking stadium (asterix) in de twee centrale plakjes (onder in beeld). (C) Sagittale slice door een snijtand op E14.0 op dag 0. (D) Zelfde slice 1 dag later. (E) Hetzelfde stukje na 3 dagen in de cultuur. (CE) Pijl wijst naar snijtanden en de vorming van labiale cervicale lus. Pijlpunt wijst op de ontwikkeling van glandula klier. In cultuur breidt de tandkiem achteruit als de cervicale lussen groeien, terwijl de speekselklier blijft ondergaan vertakking morfogenese en de vorming lumen. Afbeeldingen geslepen met behulp van Photoshop. T = Tong, MC = Meckel's kraakbeen. Schaal bar in A & B = 1 mm. Schaal bar in C, D, E = 500 pm. Klik hierom een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Kweekmethode. (A) Gekweekte slice. De cultuur zit op een transparante filter opgehangen boven medium via een metalen rooster. Een gat in het net kan het segment worden gevisualiseerd met licht van onderen. (B) Schematische voorstelling van kweekmethode.
Figuur 4. DII etikettering van de tandheelkundige follikel. (AC) Samengevoegd licht en donker veld beelden die de ontwikkeling maaltand kiem en locatie van Dii lineage label. (A) Dag 0. De tandkiem (pijlpunt) is in de dop podium. Dil labels cellen van de dentale follikel aan de linguale zijde van de tand. (B (C) Dag 4. De tandkiem heeft de bel stadium bereikt en de Dil gelabelde cellen worden gezien om in een boog rond de ontwikkelingslanden buitenste glazuur epitheel te verspreiden. Beelden zijn geslepen in Photoshop na het samenvoegen van lagen met behulp van de schermmodus. Epitheel van tand omlijnd met zwarte vlekken. DP = tandheelkundige papillen liggen binnen de binnenste glazuur epitheel. DF = tandheelkundige follikel, die rond de buitenste glazuur epitheel loopt. MC = Meckel kraakbeen. Schaal bar in A, B, C = 500 pm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode van tand cultuur heeft het voordeel dat de toegang tot de tandkiem uitstekend, waardoor nauwkeurige lineage tracing en plaatsing van parels in het epitheel of de mesenchym. Gedefinieerde gebieden van de ontwikkeling van tandkiem kan dus specifiek worden gericht. Tijdens kweek de veranderende morfologie van de tandkiem te volgen, en het effect van manipulaties snel beoordeeld.
De werkwijze is echter alleen geschikt voor kleine tand kiemen voor aanzienlijke vorming van harde weefsels, zoals dentine en glazuur, omdat deze niet nauwkeurig kan worden gehakt. Voor onderkaken is na E15.5 nodig tot op het bot te verwijderen voordat hakken. Dit heeft het nadeel van de potentieel schadelijke tandkiem, die nauw is verbonden met het been van E16.5. We hebben met succes gesneden ontleed tand kiemen tot postnatale dag 4, waarna de tand wordt te moeilijk voor de helikopter te snijden door de afzetting van email. De slice methode werkt goed op tand kiemen van E13.5, dwz de kiem stadium 1,6. Voor die tijd-punt, wanneer de tand is aan de epitheliale verdikking podium, de tand kiemen doen ontwikkelen, maar het slagingspercentage wordt verminderd en de morfologie kan beïnvloed worden op de lange termijn.
Een groot nadeel van de methode is dat het snij gebeurt willekeurig door de tand. In sommige segmenten zal een hele tand kiem worden gevonden binnen een plak, terwijl in andere de helikopter kan de tandkiem dwars door het midden. Dit betekent dat het moeilijk kan zijn om grote aantallen identieke segmenten vinden. Om dit probleem te bestrijden, is het mogelijk om een plak te verdelen door het midden en de rechter en linker zijden en controlegroep. Hiervoor echter de onderkaak moeten zorgvuldig geplaatst op de snij schijf zorgen segment symmetrisch gesneden. Voor sommige experimenten is het een voordeel dat de segmenten tand ontleden, zodat interne structuren, zoals het glazuurknoop, is toegankelijk voor lineage etikettering 4. De tandkiem lijkt zeer robuust en dergelijke half tand ziektekiemen kunnen zich goed ontwikkelen in de cultuur, zoals eerder in gehalveerde maaltand kiemen 12,13 getoond.
Als alternatief voor cultuur snijden, kan tand ziektekiemen worden ontleed uit de onderkaak en gekweekt afzonderlijk 14. Hierdoor wordt het probleem van slechte voeding en oxygenatie verbonden kweken van grote blokken weefsel en leidt tot goede tandontwikkeling, maar als gevolg van de tand ontwikkelt zonder interactie met het omringende weefsel. Als grote hoeveelheden van het omringende mesenchym verwijderd het aantal tand kiemen die vorm kan worden gewijzigd, met de nadruk op het belang van de omringende mesenchym voor de normale tandontwikkeling 15. Plak cultuur is daarom een goede methode voor het bestuderen van de interactie van weefsels, bijvoorbeeld hoe de bot en tanden samenwerken in de vorming van het alveolaire bot, of hoe de salivariëren klieren interactie met de tong en orale epitheel, iets dat verloren gaat als deze weefsels worden gekweekt in isolement.
Deze paper is het gebruik van deze methode voor het kweken van de tand kiemen maar de methode is ook uitstekend voor het kweken ontwikkelen submandibulaire en sublinguale klieren en na de ontwikkeling van de structuur zoals Meckel kraakbeen (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Sarah A. Alfaqeeh wordt gefinancierd door Kind Saud University College of Dentistry, ministerie van Hoger Onderwijs, Koninkrijk Saoedi-Arabië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
