Den Slice Kultur Metod för att följa utveckling av Tand bakterier i Explantation kultur

Summary

Här vi detalj en metod att odla tand bakterier i käken skivor med hjälp av en vävnad chopper. Denna metod ger unik tillgång till tanden under utveckling, vilket ger utmärkta möjligheter till manipulation och härstamning spårning, inte tillgänglig att använda mer traditionella odlingsmetoder.

Abstract

Explantation kultur tillåter manipulering av att utveckla organ vid specifika tidpunkter och är därför en viktig metod för utvecklings-biolog. För många organ är det svårt att komma åt att utveckla vävnad för att möjliggöra övervakning under ex vivo kultur. Den bit kultur Metoden ger tillgång till vävnaden så att morfogenetiska rörelser kan följas och specifika cellpopulationer kan måltavlan för manipulation eller härstamning spårning.

I denna uppsats beskriver vi en metod för bit kultur som har varit mycket framgångsrik för odling av tand bakterier i en rad arter. Metoden ger utmärkt tillgång till tand bakterier, som utvecklas i samma utsträckning som den som observerats in vivo, omgiven av de andra käken vävnader. Detta tillåter vävnadsinteraktioner mellan tanden och omgivande vävnaden som skall övervakas. Även om detta dokument koncentrerar sig på tandgroddar kan samma protokoll skall tillämpas för att följa utvecklingen av ett antalav andra organ, t.ex. spottkörtlar, Meckels brosk, nasalkörtlar, tungan och örat.

Introduction

För ett antal experiment är det viktigt att kunna kultur vävnad ex vivo för att följa utvecklingen. Kultur för utveckling av vävnad ger tillgång vid definierade perioder av utveckling och tillåter manipulering av gener genom tillsats av faktorer till odlingsmediet, eller den laddade kulor, och med hjälp av transfektion och elektroporering ^1. För många experiment är det viktigt att kunna visualisera den vävnad som den växer, till exempel, för att följa ödet av härstamnings märkta celler som vävnaden genomgår morfogenes. Detta kan vara särskilt problematiskt för vävnader som utvecklas djupt inuti embryot, som inte är uppenbar när ett block av vävnad från embryot odlas. Tänder är bra exempel på detta, eftersom de utvecklas i underkäken, överkäken och frontala nasala processen. När hela underkäken odlas de ytliga strukturer tanden kan ses, men förändringar i morfologi endast kan analyseras efter sektionering av fast vävnad 3. Dessa skiva kulturer har varit mycket användbara i direkt följande morfogenes av tanden, och tillåter härstamning spårning av distinkta komponenter, såsom emalj knut och den dentala papillen och follikelstimulerande ^1,4-7. Tekniken är inte begränsad till musembryon och har framgångsrikt använts för att kultur levande skivor av gris och orm tandvävnad ^8,9. Förutom fördelen av att kunna visualisera tandutveckling, slice metod har också den fördelen att de tunna skivor av vävnad ha ökad tillgång till näringsämnen från mediet och luft från inkubatorn. Detta resulterar i ökad tillväxt av tand bakterier, vilket motsvarar utvecklingen in vivo, och show invasion av endotelceller in i papilla ^7. Däremot tand bakterier i hela käken kulturer utvecklas långsammare än de som in vivo och centrum för kulturen är ofta nekrotisk i långsiktiga kulturer. I bit kultur, utvecklar tanden inom en del av käken, och dess samspel med det omgivande utveckla ben och andra vävnader kan övervakas. I vår metod vävnaden hackas direkt efter dissektion utan att behöva bädda i ett stödmedium ^10,11 och inget behov av något system för att fästa vävnaden till huggkubben. Metoden är alltså icke-invasiv och snabb, vilket gör att många mandibles som ska snittas i en session.

Protocol

1. Konfigurera

1. Slipa dissektionsinstrument (med en slipsten smörjs med mineralolja) och sterilisera före användning för organkultur med hjälp av en 70% etanol spray och torrvärmesterilisering. Slipa dissektion nålar med hjälp av elektrolys i 2 M natriumhydroxid med hjälp av en 12 V matning.
2. Förbered odlingsmedium som används för dissekering och odling av embryonala organ, bestående av Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) kompletterat med 1% GlutaMAX och 1% penicillin-streptomycin.

2. Embryo Dissection

1. Slakta en tidsinställd parat gravid kvinna med hjälp av ett schema en metod som godkänts av inrikesministeriet eller annat styrande organ. Dissekera bort huden runt nedre delen av magen, och skära upp buken med hjälp av en sax. Lokalisera de två livmoderhornen, som ansluter tillsammans på nedre mittlinjen.
2. Dissekera ut livmodern och plats i ett rör fyllt med medium på is. When på is, kan vävnaden kvar under flera timmar.
3. Ta bort livmodern och lägg i en petriskål i medium under mikroskop. Om möjligt embryo dissektioner bör utföras i ett laminärt flöde huva för att minimera kontaminering.
4. Dissekera ut embryon från livmodern och befria dem från deras extraembryonic vävnader.
5. Halshugga embryon med hjälp av en volfram nål och överföra huvuden i en ny maträtt av medium.
6. Isolera mandibles från huvudena genom att placera en nål i munhålan och skär igenom mot bakhuvudet (figurerna 1A och 1B). Isolerade mandibles kan tillfälligt lagras i medium på is i väntan på att hacka.
7. För hela käken skivor stadier E11.5-E15.5 är idealiska för tand groddar kultur. Efter E15.5 utvecklings benet i underkäken är för svårt för att hacka. Tand skivor kan fortfarande göras, men benet (underkäke och bildar käkbenet) måste först avlägsnas genomdissektion innan hugga ^9. Ta bort ben försiktigt med volfram nålar och pincett.

3. Embryo Skivning

1. Förbered käken vävnadsskivor med en vanlig bords vävnad chopper (Figur 1C). Använd ett nytt blad efter ca 200 mandibles, och se till att den ligger tätt mot monteringsskivan när den faller.
2. Rengör monteringsskivan och bladet med 70% etanol före användning. Man måste vara försiktig när du använder maskinen, eftersom bladet är mycket vasst.
3. Ställ helikoptern på en skär avstånd på mellan 200-400 nm beroende på ålder av provet, och beroende på om hela tanden grodden krävs. Ställ bladet kraft max.
4. Överför en käke till plastmonteringsskivan med hjälp av en pipett eller pincett. Ordna underkäken på skivan och se till att inriktningen är fortfarande tydlig. Framkallnings tungan kan användas som ett användbart landmärke för bestämning av orientering. För molarer användning afrontal / tvärgående riktning (se plan hugga i Figur 1B), medan det för framtänderna använder en sagittal skiva genom underkäken för att återspegla olika orientering av dessa tänder när de växer (se plan hugga i Figur 2A).
5. Avlägsna överflödigt medium från runt vävnaden med användning av filterpapper i syfte att lätt torka underkäken på monteringsskivan.
6. Omedelbart efter torkning, placera skivan på den runda rostfria bord av helikoptern. Sätt på maskinen och tryck på start. Tabellen korsar automatiskt från vänster till höger medan samtidigt den hack armen som uppbär bladet lyfts och släpps vid upp till 200 slag / min.
7. Stäng av maskinen när vävnaden har helt skivas. Se till bladarmen är i upplyft läge och ta ut skivan. Placera inte fingrarna under knivarmen eller lämna maskinen utan uppsikt när hackning.
8. Ta monteringsskivan och omedelbart lägga medel to skivorna på skivan för att förhindra överdriven torkning. Rubba försiktigt skivade vävnaden från botten av skivan med en volfram nål och sedan pipett till en liten petriskål av medium (Figur 2A).
9. Separera skivor med hjälp av en nål och sedan markera de vävnadsskivor innehållande vävnaden av intresse under ett stereomikroskop (figur 1D, 1E, och 2B). Placera utvalda segment i färskt odlingsplattor med medium.

4. Slice Kultur

1. Förbered centrala brunnar organodlingsskålar som är redo för odling genom att tillsätta ca 2 ml autoklaverat vatten till den yttre väl för att förhindra uttorkning, och genom att placera ett metallgaller över mitten av skålen (fig. 3A och 3B).
2. Förbered metallgaller genom att skära remsor ca 4 cm x 1,5 cm från blad av rostfritt stålnät. Använd ett hålslag för att göra ett hål i mitten och böjsidorna för att skapa ett sicksack slut. Gallret bör passa platt över den centrala brunn, som är parallell med botten av skålen (fig. 3A och 3B). Autoklavera gallren att sterilisera före användning.
3. Klipp en bit transparent polyetylentereftalat (PET)-membran (porstorlek 0,4 ^ m) är tillräckligt stort för att täcka hålet i rutnätet. Ställ den avskurna membranet in i skålen med det valda segmentet.
4. Placera skiva på toppen av membranet, och sedan försiktigt lyfta membranet ur mediet, med skiva tillplattad i centrum.
5. Placera filtret på gallret över det cirkulära hålet i centrum, och tillsätt cirka 1 ml odlingsmedium till brunnen, upp till nivån för membranet.
6. För manipulationer lägga proteiner eller små molekylhämmare till mediet (exempelvis ^8).
7. Fotografera segmentet för ett register över morfologi vid dag 0 av kultur.
8. Placera skålarna i en fuktad atmosfär av 5% CO
9. Fotografera kulturer med jämna mellanrum för i genomsnitt 7 dagar. Ändra odlingsmediet varje 48 till 72 timmar. För fotografering se de skivor med en ljuskälla underifrån (fig. 2C-E).

5. Lineage Tracing

Om härstamning spårning krävs kan lipofila färgämnen såsom Dil eller DiO injiceras i tandgroddar före steg 4, skiva kultur.

1. Dra glas kapillär nålar med hjälp av en nål avdragare.
2. Bryt nålspetsen med pincett och placera spetsen ned i färglösningen. Låt stå i några minuter medan färgämnet fyller spetsen genom kapillärverkan.
3. Placera den fyllda nål i en hållare och fäst via rör till en injektor eller mun aspirator.
4. Placera nålspetsen i odlingsmediet att peka på området av den del på grund av att vara märkt. Applicera lufttryck för att förskjuta en liten mängd av färgämnet ur nålen enD på vävnaden.
5. Ta bort nålen och kontrollera om märkning enligt fluorescens.
6. Framgångsrikt märkta skivor kan överföras till filter och odlas enligt beskrivningen i steg 4.

Representative Results

I syfte att följa rörelsen hos den första molar tand follikel var 250 fim frontala skivor tas genom en underkäken med hjälp av den ovan beskrivna metoden. Den dentala follikeln är skiktet av mesenkym som omger den yttre emalj epitelet (OEE) av framkallnings tand, och har tidigare visats att delta i bildningen av vävnad hos periodontium ^6. Mandibles dissekerades vid E14.5, locket skede av tandutveckling. I segmentet var konturerna av tand epitel klar, och den kondensetand mesenkymet kunde identifieras som en mörkare ring runt tanden epitel (Figur 4A). Dil injicerades i mesenkym intill den yttre emalj epitel av tanden skiva på den linguala sidan (Figur 4A). Efter att märka skivorna odlades i 4 dagar och fotograferade med intervall (figur 4B och 4C). In vivo tand bakterier skulle ha nåttbell stadiet med E18.5, och en distinkt klocka skede form observerades i de segment, som visar en liknande fortgång över denna tidsperiod. Fläcken av Dil sågs att sträcka sig in i ett band av celler som sträcker sig runt den yttre tand epitel som tanden växte (figur 4B och 4C).

Figur 1. Bildning av levande skivor. (A) E14.5 embryo. Streckade linjer anger planen skär med en dissekera nål, som börjar med den lägre skuren för halshuggning. (B) dissekerade underkäke. Tungan är vänt nedåt. Planet för sektionen för vävnads chopper visas med hjälp av streckade linjer. (C) Tissue chopper visar bladarmen (BA) och vita monteringsskiva (MD) med preparerade provet (pil). (D) Representant skiva genom den moläraregionen. Pilarna pekar på molära tand bakterier. (E) Högeffekt-vy av en molar slice. Tanden groddar epitel skisseras med svarta fläckar. Bilder slipas med hjälp av Photoshop. T = Tungan, DB = käke ben, MC = Meckels brosk. Scale bar i A = 3 mm. Skala bar i B & D = 1 mm. Skala bar i E = 500 nm. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Incisor och körtel kultur. (A) E12.5 Mandible som har huggit sagittally. Utvecklingsframtänder (skiss vita fläckar med asterix) och submandibular körtlar (som beskrivs med svarta prickar och pilar) kan bara göras ut. (B) Samma käken visar central 4 skivor avskiljs. Den utveckling av submandibular körtel cen ses som en knopp omgiven av kondenserad mesenkym (pilspetsar) i de två sidosektioner (topp i bild). Den kondenserande mesenkym runt körteln skisseras i rött. Framtänderna är på epiteliala förtjockning stadiet (asterisk) i de två centrala skivor (nederst i bild). (C) sagittala skiva genom en framtand vid E14.0 vid dag 0. (D) Samma skiva 1 dag senare. (E) Samma skiva efter tre dagar i odling. (CE) pilen pekar på framtand och bildar labial livmoderhalscancer slinga. Arrowhead pekar på att utveckla submandibular körtel. I kultur tandgroddar sträcker sig bakåt eftersom livmoderhalscancer slingor växa, medan spottkörteln fortsätter att genomgå förgrening morfogenes och lumen bildning. Bilder slipas med hjälp av Photoshop. T = Tungan, MC = Meckels brosk. Skala bar i A & B = 1 mm. Scale bar i C, D, E = 500 um. klicka härför att visa en större bild.

Figur 3. Kultur-metoden. (A) Odlade slice. Kulturen sitter på ett transparent filter upphängd på medel via ett metallgaller. Ett hål i rutnätet tillåter skiva som skall visualiseras med ljus underifrån. (B) Schematisk bild av odlingsmetod.

Figur 4. Dil märkning av tand hårsäcken. (AC) Sammanslagen ljusa och mörka fält bilder som visar utvecklingen av molar tand groddar och placering av Dil härstamning etikett. (A) dag 0. Den tandgroddar (pilspets) är på locket stadiet. Dil etiketter celler av det dentala follikeln på den linguala sidan av tanden. (B (C) Dag 4. Tand grodden har nått klockan stadiet och DII märkta celler förekommer att sprida ut i en båge kring utvecklings yttre emalj epitel. Bilder har skärpt i Photoshop efter att sammanfoga lager med hjälp av skärmläge. Epitel tand som skisseras med svarta fläckar. DP = tand papilla som ligger inom det inre emalj epitel. DF = tand hårsäcken, som löper runt den yttre emalj epitel. MC = Meckels brosk. Skala bar i A, B, C = 500 nm. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Denna metod för tand kultur har den fördelen att tillgång till tandgroddar är utmärkt, vilket tillåter noggrann härstamning spårning och placeringen av pärlorna inom epitelet eller mesenkym. Definierade områden av utvecklingstand grodden kan därför vara särskilt inriktade. Under kultur den förändrade morfologin av tanden grodden kan följas, och effekten av manipulationer snabbt utvärderas.

Metoden är emellertid endast lämplig för unga tand bakterier innan betydande bildning av hårda vävnader såsom dentin och emalj, eftersom dessa inte kan hackas korrekt. För mandibles det är efter E15.5 nödvändigt att ta bort benet innan hugga. Detta har nackdelen att potentiellt skada tandgroddar, som är nära förknippad med benet från E16.5. Vi har framgångsrikt skivad dissekerade tand bakterier upp till postnatal dag 4, varefter tanden blir för svårt för hackaren att skära på grund av nedfallet av emalj. Segmentet mMETOD fungerar bra på tand bakterier från E13.5, dvs knoppstadiet ^1,6. Före denna tid-punkt, när tanden är i epiteliala förtjockning scenen, tand bakterier gör utveckla utan framgång minskar och morfologi kan påverkas på lång sikt.

En stor nackdel med metoden är att den hack inträffar slumpvis genom tanden. På vissa skivor en hel tand grodden kommer att finnas inom ett segment, medan det i andra choppern kan skära tand grodden genom mitten. Detta innebär att det kan vara svårt att erhålla ett stort antal identiska skivor. För att bekämpa detta problem, är det möjligt att dela upp en bit ned i mitten och använda höger och vänster sida som experimentell och kontroll. För detta är emellertid underkäken måste noggrant placeras på huggskivan för att säkerställa en skiva skärs symmetriskt. För vissa experiment är det en fördel att ha skivor som dissekera tanden så att inre strukturer, till exempel emaljknut, kan nås för härstamning märkning ^4. Tanden groddar verkar mycket robust och sådana halv tand bakterier kan utveckla bra i kultur, som tidigare visats i halverade molar tand bakterier ^12,13.

Som ett alternativ till slice kultur kan tandgroddar dissekeras ut av underkäken och odlades i isolering ^14. Detta tar bort problemet med dålig kost och syresättning i samband med odling av stora block av vävnad och leder till god tandutveckling, men som en konsekvens tanden utvecklas utan interaktion med den omgivande vävnaden. När stora mängder av de omgivande mesenkym avlägsnas antalet tand bakterier som bildar kan ändras, betonar vikten av den omgivande mesenkym för normal tandutveckling ^15. Slice kultur är därför en bra metod för att studera interaktionerna av vävnader, till exempel hur benet och tanden samverkar i bildandet av alveolärt ben, eller hur salivarierar körtlar samverkar med tungan och oralt epitel, något som försvinner när dessa vävnader odlas i isolering.

Denna uppsats belyser användningen av denna metod för odling av tand bakterier men samma metod är också utmärkt för odling utvecklings submandibular och sublinguala körtlar och följer utvecklingen av struktur såsom Meckels brosk (Figur 2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers