Summary
Burada detay doku helikopter kullanarak mandibul dilimler kültür diş mikroplar için bir yöntemi biz. Bu yöntem, daha geleneksel kültürü yöntemleri kullanılarak mevcut manipülasyon ve soy izleme, değil mükemmel bir fırsat sağlayarak, gelişimi sırasında dişe eşsiz erişim sağlar.
Abstract
Eksplant kültür belirli zaman noktalarında organ geliştirmeyi ve manipülasyon, bu nedenle gelişimsel biyolog için önemli bir yöntemdir sağlar. Birçok organ için bu ex vivo kültür sırasında izleme sağlamak için gelişmekte olan doku ulaşmak zordur. Dilim kültür yöntemi sağlar dokusu erişim böylece morfogenetik hareketleri takip edilebilir ve belirli bir hücre popülasyonları manipülasyon veya soy izleme için hedef olabilir.
Bu yazıda tür bir dizi diş mikrop kültürü için çok başarılı olmuştur dilim kültürü için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, diğer çene dokular tarafından çevrili in vivo gözlenene benzer bir oranda, en geliştirmek diş mikrop, mükemmel erişim sağlar. Bu, diş ve çevreleyen doku arasında doku etkileşimleri takip edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu kağıt mikropların diş üzerinde yoğunlaşmaktadır de, aynı protokolü bir dizi gelişme takip uygulanabilirBöyle tükürük bezleri, Meckel kıkırdağı, burun bezleri, dil ve kulak gibi diğer organlara,.
Introduction
Deneyler bir dizi için bu kültür dokusu ex vivo gelişimini takip edebilmek için önemlidir. Doku geliştirme Kültür gelişiminin tanımlanmış dönemlerinde erişim sağlayan ve kültür ortamına faktörlerin eklenmesiyle genlerin manipülasyon ya da yüklü boncuklar üzerine ve transfeksiyon ve elektroporasyon 1 kullanılmasıyla sağlar. Birçok deneyleri için o büyüdükçe doku morfolojilerinden maruz soy olarak etiketlenmiş hücrelerin kaderini takip etmek, örneğin, doku görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Bu embriyo bir doku bloğu kültürlenir zaman açık değildir derin embriyo içinde geliştirmek dokular, özellikle sorunlu olabilir. Onlar mandibula, maksilla ve frontal burun süreç içinde geliştirmek gibi Dişler, bu iyi örneklerdir. Bütün çene kültive edildiğinde sabit doku kesit sonra dişin yüzeysel yapıları izlenebilir ancak morfolojisindeki değişiklikler sadece analiz edilebilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kurma
- (Mineral yağ ile yağlanmış bir bileme taşı kullanarak) diseksiyon aletleri keskinleştirmek ve% 70 etanol sprey ve kuru ısı sterilizasyonu organ kültürü kullanmadan önce sterilize edin. 12 V kaynağı kullanarak 2 M sodyum hidroksit elektroliz kullanarak diseksiyon iğneler keskinleştirmek.
- Glutamax,% 1 ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Advanced Modified Eagle Medium F12 (F12 DMEM) 'den oluşan, embriyonik organların diseksiyon ve kültür için kullanılan kültür ortamı hazırlayın.
2. Embriyo Diseksiyon
- Home Office ya da diğer yönetim kurulu tarafından onaylanan bir program bir yöntem kullanarak bir zamanlanmış evlendirdi hamile kadın itlaf. Alt karın çevresinde cilt uzak teşrih ve makas kullanılarak karın açmak kesti. Alt orta hatta birbirine bağlamak, iki rahim boynuzları, bulun.
- Buz üzerinde orta ile dolu bir tüp içinde rahim ve yerde parçalara ayır. When, buz üzerinde, doku birkaç saat bırakılabilir.
- Mikroskop altında ortam içinde bir Petri tabağına rahim ve yer çıkarın. Mümkün embriyo kontaminasyonu en aza indirmek için diseksiyon bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır yerde.
- Rahim embriyolar inceleyin ve onların Extraembryonic dokulardan onları serbest.
- Bir tungsten iğne kullanılarak embriyolar başını kesmek ve ortam taze bir çanak içine kafaları aktarın.
- Ağız boşluğu içine bir iğne koyarak kafaları çenenin izole ve başın arkasında (Şekil 1A ve 1B) doğru kesilmiştir. Doğrama için beklerken İzole çeneler geçici olarak buz üzerinde ortamda saklanabilir.
- Bütün mandibula dilimleri için E11.5-E15.5 diş mikrop kültürü için idealdir aşamaları. E15.5 sonra mandibulada gelişen kemik doğrama için çok zor. Diş dilimleri hala yapılabilir, ancak kemik (dentary ve şekillendirme alveol kemiği) ilk olarak çıkarılması gerekir9 doğrama önce diseksiyonu. Tungsten iğneler ve forseps kullanılarak dikkatlice kemiği kaldırmak.
3. Embriyo Dilimleme
- Standart bir tablo doku kıyıcı (Şekil 1C) kullanarak mandibul doku dilimleri hazırlayın. Yaklaşık 200 mandibulalarındaki sonra taze bir bıçak kullanın ve düştüğünde o montaj diski ile aynı hizada emin olun.
- Montaj Diski temizleyin ve kullanımdan önce% 70 etanol ile bıçak. Makineyi kullanırken bıçak çok keskin olduğu gibi bakım, alınmalıdır.
- Numunenin yaşına göre um 200-400 arasında bir kesme mesafede helikopteri ayarlayın ve bütün diş mikrop gerekli olup olmadığına bağlı. Maksimumda bıçak kuvvet ayarlayın.
- Bir pipet veya forseps kullanarak plastik montaj diske bir çene aktarın. Yönelim hala net olduğundan emin diskin yapımı üzerine mandibulayı düzenleyin. Gelişmekte olan dil yönünü belirlemek için yararlı bir dönüm noktası olarak kullanılabilir. Molarlar kullanım af içinkesici dişler için bunlar (Şekil 2A'da doğrama uçak bakınız) büyüdükçe, bu dişlerin farklı yönüne göre çenenin üzerinden bir sajital dilim kullanırken Rontal / enine yönlendirme, (Şekil 1B doğrama uçak bakınız).
- Biraz montaj diskte mandibulayı kurutmak için filtre kağıdı kullanılarak doku etrafında aşırı ortamı çıkarın.
- Hemen kurutulduktan sonra, helikoptere dairesel paslanmaz çelik bir levha üzerine disk yerleştirin. Makineyi açın ve basın başlangıç. Bu tablo, aynı zamanda bıçak taşıyan kol doğrama yükseltilir ve / dk kadar 200 vuruş da düşmüştür soldan sağa doğru otomatik olarak geçmektedir.
- Doku tamamen dilimlenmiş edildikten sonra makineyi kapatın. Bıçak kolu yükseltilmiş konumda olduğundan emin olun ve diski çıkarın. Bıçak kolunun altında parmaklarınızı yerleştirin veya doğrama zaman gözetimsiz makineyi bırakmayın.
- Montaj diskini alın ve hemen orta t eklemeko sırayla disk üzerinde dilimler aşırı kurumasını önlemek için. Dikkatlice orta küçük bir Petri kabı (Şekil 2A) bir tungsten iğne ve daha sonra bir pipet kullanarak diskin altındaki doku dilimlenmiş çıkarmak.
- Bir iğne kullanılarak dilim ayrı ve daha sonra bir stereo (Şekil 1D, 1E ve 2B) altında, ilgi konusu doku içeren doku dilimleri seçin. Ortam ile taze kültür tabaklarında seçilen dilimleri yerleştirin.
4. Dilim Kültür
- , Su kaybını önlemek için, dış oyuğuna otoklavlanmış suyun yaklaşık 2 ml ilave etmek suretiyle ve çanak merkezinin bir metal ızgara konumlandırılmasıyla kültürü için hazır orta-gözenekli organ kültür kapları hazırlayın (Şekil 3A ve 3B).
- Yaklaşık 4 cm paslanmaz çelik hasır levhalar 1,5 cm x şeritler keserek metal ızgaralar hazırlayın. Merkezinde bir delik yapmak ve bükmek için bir delik yumruk kullanınzikzaklı uç oluşturmak için taraf. Izgara çanak (Şekil 3A ve 3B) dibine paralel olarak uzanan merkezi oyuk boyunca düz oturmalıdır. Kullanmadan önce sterilize etmek ızgaraları otoklavlayın.
- Saydam polietilen tereftalat bir parça ızgara deliği kaplayacak kadar geniş (PET) zan (gözenek boyutu 0.4 um) kesin. Seçilen dilim ile çanak içine kesilmiş membran yerleştirin.
- Zarın üzerine dilim yerleştirin ve daha sonra dikkatli bir şekilde merkezinde yassı dilim ile ortam dışında membran kaldırın.
- Merkezindeki dairesel delik boyunca ızgara üzerinde filtre yerleştirin ve zarın seviyesine kadar, iyi kültür ortamı, yaklaşık 1 ml.
- Manipülasyonlar (örneğin, 8) orta proteinler ya da küçük molekül inhibitörleri eklemek için.
- Kültür 0. günde morfolojisinin bir rekor için dilim fotoğrafını.
- % 5 CO nemli bir atmosferde bulaşıkları yerleştirin
- Ortalama 7 gün boyunca düzenli aralıklarla kültürleri Fotoğraf. Kültür ortamı, her 48-72 saat değiştirin. Fotoğrafçılık için altında (Şekil 2C-E) bir ışık kaynağı ile dilimleri görmek.
5. Lineage İzleme
Soy izleme gerekli ise, bu tür DII veya dio gibi lipofilik boyalar aşama 4, dilim kültür önce diş mikrop içine enjekte edilebilir.
- Bir iğne çektirmenin kullanarak cam kılcal iğneler çekin.
- Forseps kullanılarak iğne ucu kırmak ve aşağı boya çözeltisi içine ucu ile. Boya kılcal hareket ile ucuna doldurur süre birkaç dakika bekletin.
- Bir tutucu içine doldurulur iğne yerleştirin ve bir enjektör ya da ağız aspiratörüne boru yoluyla eklemek.
- Etiketlenecek nedeniyle dilimin dokunmaktan kültür ortamı içinde iğne ucu yerleştirin. Iğne, bir dışarı boya küçük bir miktar yerinden hava basıncı uygulayındoku üzerine d.
- İğneyi çıkarın ve floresan altında etiketleme için kontrol edin.
- Başarıyla etiketli dilimleri filtrelerine aktarılmış ve aşama 4'te tarif edildiği gibi kültüre edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk molar diş kökü hareketini takip etmek amacıyla, 250 um frontal kesitler, yukarıda tarif edilen yöntemi kullanılarak alt çeneye ile alınmıştır. Diş kökü, gelişmekte olan dişin dış emaye epitel (OEE) çevreleyen mezenşimin tabakası olan ve daha önce periodonsiyum 6 dokusu oluşumuna katılmak için gösterilmiştir. Altçeneler E14.5, diş gelişimi kapak aşamasında disseke edildi. Dilim ise diş epitelyumun anahat açıktı ve yoğuşmalı dental mezenşimin diş epitel (Şekil 4A) etrafında bir halka koyu olarak tespit edilebilir. DII lingual tarafına (Şekil 4A) ilgili diş dilimin dış emaye epitel yanındaki mezenşimin enjekte edilmiştir. Etiketleme sonra dilimler 4 gün daha kültürlendi ve aralıkları (Şekiller 4B ve 4C) fotoğraflandı. In vivo diş mikrop ulaşmış olurE18.5 tarafından çan aşamasında, ve ayrı bir aşamada çan şekli bu süre boyunca benzer bir ilerleme gösteren dilim gözlenmiştir. DII nokta, diş (Şekiller 4B ve 4C) arttıkça, dış diş epitel hücrelerinin etrafında uzanan bir bant içine doğru görüldü.
Şekil 1. Canlı dilim oluşumu. (A) E14.5 embriyo. Kesikli çizgiler dekapitasyon için alt kesme ile başlayan, bir kesme iğne ile kesilir uçaklar göstermektedir. (B) alt çene Dissected. Dil aşağıya bakacak. Doku kesici için bölümün düzlemi kesikli çizgiler kullanılarak gösterilmektedir. (C) Hazırlanan numune (ok) ile bıçak kolu (BA) ve beyaz montaj diski (MD) gösteren Doku kıyıcı. Molar ile (D) Temsilcisi dilimbölge. Oklar molar diş mikrop işaret. Molar dilimin (E) Yüksek güç görünümü. Diş germ epitel siyah noktalar ile özetlenmiştir. Görüntüler Photoshop kullanarak bilenmiş. T = Dil, DB = Dentary kemik, MC = Meckel kıkırdak. A = 3 mm Ölçek çubuğu. B & D = 1 mm Ölçek bar. E = 500 mikron Ölçek çubuğu. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Kesici ve bezi kültür. (A) sagittally kıyılmış olmuştur E12.5 Mandible. Gelişmekte kesici dişler (Asteriks ile özetlenen beyaz noktalar) ve submandibular bezleri (siyah noktalar ile özetlenen ve oklu) sadece dışarı yapılabilir. (B) Merkez 4 dilim gösteren aynı mandibula ayrıldı. Gelişmekte submandibuler bezi cBir iki lateral bölümleri (resmin üst) özet mezenşimin (ok başları) ile çevrili bir tomurcuk olarak görülebilir. Bezinin çevresinde yoğunlaştırılması mezenşimin kırmızı gösterilmiştir. Kesici dişler iki merkezi dilim (resmin alt) epitel kalınlaşması aşamasında (asteriks) altındadır. (C) Günlük 0 at E14.0 bir kesici dişin aracılığıyla Sagittal dilim. 1 gün sonra (D) Aynı dilim. Kültür içinde 3 gün sonra (E) aynı dilim. (CE) Ok puan incisor ve dudak servikal döngü oluşturan için. Ok submandibular bez gelişmekte işaret. Servikal döngüler büyüdükçe tükürük bezi morfogenetiğine ve lümen oluşumu dallanma geçmesi devam ederken kültüründe diş tohumu, geriye uzanır. Görüntüler Photoshop kullanarak bilenmiş. T = Dil, MC = Meckel kıkırdak. A & B = 1 mm ölçekli bar. C, D, = 500 mikron E Ölçek çubuğu. buraya tıklayınbüyük rakam görmek için.
Şekil 3,. Kültür yöntemi. (A) Yetiştirme dilim. Kültür, bir metal ızgara vasıtasıyla ortamı üzerinde asılı şeffaf bir filtre üzerinde oturur. Kılavuzunda bir delik dilim alttan ışığı ile görselleştirilmiştir sağlar. Kültür yöntemi (B) şematik.
Şekil 4. Dental folikül DII etiketleme. (AC) molar diş tohumu ve DiI soy etiketin yerini gelişmekte gösteren ışık ve karanlık alan görüntüleri birleştirilmiştir. (A) Gün 0. Diş germ (ok) kapak aşamadadır. DII dişin dile bakan tarafındaki diş folikül hücreleri etiketler. (B (C) 4. Gün. Diş mikrop çan aşamasına ulaşmıştır ve DII etiketli hücreleri gelişmekte olan dış emaye epiteli etrafında bir yay yayılmış görülmektedir. Görüntüler ekran modunu kullanarak katmanları birleştirdikten sonra Photoshop bilenmiş olmuştur. Dişin epitel siyah noktalar ile sıraladı. Iç emaye epitel içinde yatan DP = diş papilla. Dış emaye epiteli çevresinde çalışan DF = diş folikül. MC Meckel kıkırdağı =. Ölçü çubuğu A, B, C = 500 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diş kültürün Bu yöntem diş mikrop erişim avantajı doğru soy epiteli veya mezenşimin içinde izleme ve boncuk yerleştirme sağlayan, mükemmel vardır. Gelişmekte diş mikrop Tanımlı bölgeler dolayısıyla özellikle hedef alınabilir. Kültür sırasında diş mikrop değişen morfoloji takip edilebilir, ve manipülasyonlar etkisi hızlı bir şekilde değerlendirilmiştir.
Bu doğru kıyılmış olamaz gibi bir yöntem olup, bununla birlikte, bu tür dentin ve emaye gibi sert dokular, oluşmadan önce genç dişi mikroplar için uygundur. Mandibulalarındaki için sonra E15.5 bu doğrama önce kemiği kaldırmak için gereklidir. Bu potansiyel yakından E16.5 gelen kemik ilişkili diş mikrop, zarar dezavantajına sahiptir. Biz başarıyla diş nedeniyle mine birikimi kesmek için helikoptere için çok zor olur sonra, doğum sonrası 4. günde disseke diş mikropları dilimlenmiş var. Dilim method tomurcuk aşamasında 1,6, yani E13.5 gelen diş mikroplar üzerinde iyi çalışır. Diş epitel kalınlaşması aşamasında iken bu zaman noktasından önce, diş mikroplar geliştirmek yapmak ama başarı oranı azalır ve morfolojisi uzun vadede etkilenebilir.
Yöntemi ile bir dezavantajı, kesme diş ile rastgele gerçekleşmesidir. Diğerlerinde kıyıcı ortasından diş tohumu kesebilir ederken bazı dilimleri içinde bütün bir diş tohumu, bir dilim içinde bulunacaktır. Bu aynı dilimlerin çok sayıda elde etmek zor olabilir anlamına gelir. Bu sorunla mücadele için, ortasında bir dilim bölmek ve deney ve kontrol olarak sağ ve sol tarafını kullanmak mümkündür. Bunun için, ancak, dikkatli bir şekilde çene dilim simetrik olarak kesilir sağlamak için kesme diski üzerine yerleştirilmelidir. Bazı deneyler için, bu diş incelemek dilim için bir avantajdır, böylece bu tür emaye gibi iç yapılar,düğüm, soy etiketleme 4 ulaşılabilir. Diş mikrop çok sağlam görünen ve daha önce yarıya molar diş mikrop 12,13 gösterildiği gibi yarım diş mikrop, kültürde iyi geliştirmek edebiliyoruz.
Kültürünü dilim bir alternatif olarak, diş mikroplar mandibula ve izolasyon 14 kültür üzerinden disseke edilebilir. Bu doku büyük bloklar kültürleme ile ilişkili kötü beslenme ve oksijenlenme sorunu ortadan kaldırır ve iyi diş gelişimine yol açan ama bir sonucu olarak diş çevresindeki doku ile etkileşimi olmadan gelişir. Çevredeki mezenşimin büyük miktarlarda kaldırıldığında oluşturan diş mikropların sayısı normal diş gelişimi için 15 çevreleyen mezenşimin önemini vurgulayarak, değiştirilebilir. Dilim kültür dolayısıyla kemik ve diş alveolar kemik oluşumu ile nasıl etkileşime örneğin dokuların etkileşimlerin incelenmesinde, ya da ne kadar SalI için iyi bir yöntemdirbezleri dil ve ağız epitel dokular izolasyon kültürlenmiştir kaybolur şey ile etkileşim değişir.
Bu çalışma, diş mikropları kültür için bu yöntemin kullanımını vurgulamaktadır ama aynı yöntem aynı zamanda gelişen submandibuler ve dil altı bezler kültürlenmesi ve bu Meckel kıkırdak (Şekil 2) gibi yapısının oluşması aşağıdaki için mükemmeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Sarah A. Alfaqeeh Diş Hekimliği, Yüksek Eğitim Bakanlığı, Suudi Arabistan Krallığı Kind of Saud University College tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
