Summary
Ici, nous détaillons une méthode de culture des germes de dents dans la mandibule tranches en utilisant un broyeur de tissus. Cette méthode permet un accès unique à la dent au cours du développement, offrant une excellente occasion pour la manipulation et de la lignée de traçage, pas disponible en utilisant des méthodes de culture traditionnelles.
Abstract
culture de l'explantation permet la manipulation de développer des organes à des moments spécifiques et est donc un moyen important pour la biologie du développement. Pour de nombreux organes, il est difficile d'accéder à un tissu en développement pour permettre la surveillance au cours de la culture ex vivo. Procédé de culture de tranche permet l'accès à un tissu de sorte que les mouvements morphogénétiques peuvent être suivies et des populations de cellules spécifiques peuvent être ciblés pour la manipulation ou la lignée de traçage.
Dans cet article, nous décrivons une méthode de culture de la tranche qui a été très fructueuse pour la culture des germes de dents dans une gamme d'espèces. La méthode offre un excellent accès aux germes dentaires, qui se développent à un rythme similaire à celui observé in vivo, entouré par les autres tissus de la mâchoire. Ceci permet des interactions entre tissus situés entre la dent et du tissu environnant à contrôler. Bien que ce document se concentre sur les germes dentaires, le même protocole peut être appliqué à suivre le développement d'un certain nombred'autres organes, comme les glandes salivaires, le cartilage de Meckel, les glandes nasales, de la langue, et l'oreille.
Introduction
Pour un certain nombre d'expériences, il est important d'être en mesure de tissu de culture ex vivo pour suivre le développement. Culture de développer le tissu permet d'accéder à des périodes déterminées de développement et permet la manipulation de gènes par l'addition de facteurs de milieu de culture, ou sur des billes chargées, et par l'utilisation de la transfection et électroporation 1. Pour de nombreuses expériences, il est important d'être capable de visualiser le tissu pendant sa croissance, par exemple, de suivre le sort des cellules de la lignée marqué que le tissu est soumis à la morphogenèse. Cela peut être particulièrement problématique pour les tissus qui se développent plus profond de l'embryon, qui ne sont pas évidentes lorsque un bloc de tissu à partir de l'embryon est mis en culture. Les dents sont de bons exemples de ce qui se développent au sein du processus nasal mandibule, maxillaire et frontal. Lorsque l'ensemble de la mandibule est cultivé les structures superficielles de la dent peut être consulté mais des changements dans la morphologie ne peuvent être analysés après la coupe de tissu fixe
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Set Up
- Aiguisez les instruments de dissection (en utilisant une pierre à aiguiser lubrifié avec de l'huile minérale) et stériliser avant utilisation pour la culture d'organes à l'aide d'un spray d'éthanol à 70% et la stérilisation à chaleur sèche. Affûter les aiguilles de dissection par électrolyse dans de l'hydroxyde de sodium 2 M en utilisant une alimentation de 12 V.
- Préparer le milieu de culture utilisé pour la dissection et la culture d'organes embryonnaires, consistant en la modification F12 Eagle Medium avancée Dulbecco (DMEM F12) complété avec 1% GlutaMAX et 1% de pénicilline-streptomycine.
2. Embryon Dissection
- Abattre une femme enceinte accouplés chronométré en utilisant une méthode horaire un tel qu'approuvé par le Home Office ou autre organe. Disséquer la peau autour de l'abdomen inférieur, et couper ouvrir l'abdomen avec des ciseaux. Repérez les deux cornes utérines, qui relient ensemble à la ligne médiane inférieure.
- Disséquer l'utérus et le placer dans un tube rempli de milieu sur la glace. EPMn sur de la glace, le tissu peut être laissée pendant plusieurs heures.
- Enlever l'utérus et les placer dans une boîte de Pétri en milieu sous le microscope. Où dissections d'embryons possibles doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination.
- Disséquer les embryons de l'utérus et les libérer de leurs tissus extra-embryonnaires.
- Décapiter les embryons en utilisant une aiguille de tungstène et de transférer les têtes dans une nouvelle boîte de milieu.
- Isoler les mandibules de la tête en plaçant une aiguille dans la cavité buccale et couper vers l'arrière de la tête (figures 1A et 1B). Mandibules isolées peuvent être stockés temporairement dans un milieu sur la glace en attendant pour hacher.
- Pour les tranches mandibule ensemble des étapes E11.5 E15.5-sont idéales pour la culture des germes dent. Après E15.5 l'os en développement dans la mandibule est trop dur pour hacher. tranches de dents peuvent encore être apportées, mais l'os (l'os alvéolaire dentaire et la formation) doivent d'abord être éliminés pardissection avant de les hacher 9. Retirez soigneusement os en utilisant des aiguilles de tungstène et une pince.
3. Embryon tranchage
- Préparer les tranches de tissu mandibule en utilisant un broyeur de tissu de table standard (figure 1C). Utilisez une lame neuve après environ 200 mandibules, et assurez-vous qu'il affleure avec le disque de montage quand il tombe.
- Nettoyez le disque de montage et la lame avec 70% d'éthanol avant utilisation. Il faut prendre soin lors de l'utilisation de la machine, comme la lame est très pointue.
- Régler le hacheur à une distance de coupe de 200 à 400 um entre fonction de l'âge de l'échantillon, et selon que l'ensemble du germe dentaire est nécessaire. Réglez la pression de la lame au maximum.
- Transférer une mandibule vers le disque de support en plastique à l'aide d'une pipette ou d'une pince. Organiser la mandibule sur le disque en veillant à l'orientation est toujours clair. La languette de développement peut être utilisé comme un point de repère utile pour déterminer l'orientation. Pour molaires utilisation afRontal / orientation transversale (voir plan de découper la figure 1B), tandis que pour les incisives utiliser un coupe sagittale par la mandibule afin de refléter l'orientation différente de ces dents à mesure qu'ils grandissent (voir plan de découper la figure 2A).
- Éliminer le milieu en excès à travers le tissu en utilisant un papier-filtre afin de sécher légèrement la mandibule sur le disque de montage.
- Immédiatement après le séchage, placez le disque sur le tableau de l'hélicoptère circulaire en acier inoxydable. Allumez la machine et appuyez sur start. Le tableau qui traverse automatiquement à partir de la gauche vers la droite alors que dans le même temps le bras portant la lame de hachage est élevée, et a chuté jusqu'à 200 coups / min.
- Eteignez la machine une fois que le tissu a été complètement tranché. Assurez-vous que le bras de la lame est en position relevée et retirez le disque. Ne pas placer les doigts sous le bras de la lame ou laisser la machine sans surveillance pour hacher.
- Prenez le disque de montage et ajouter immédiatement milieu to les tranches sur le disque afin de prévenir l'assèchement excessif. Dégagez délicatement le tissu en tranches de la partie inférieure du disque à l'aide d'une aiguille de tungstène et la pipette dans une petite boîte de Pétri de milieu (figure 2A).
- Séparer les tranches à l'aide d'une aiguille, puis sélectionnez les tranches de tissu contenant le tissu d'intérêt sous un stéréomicroscope (figures 1D, 1E, et 2B). Placer les tranches sélectionnées dans des boîtes de culture frais avec le milieu.
4. Tranche Culture
- Préparer des boîtes de culture organe central-bien prêts pour la culture en ajoutant environ 2 ml d'eau à l'autoclave pour le bien externe pour éviter la déshydratation, et par le positionnement d'une grille métallique à travers le centre de l'assiette (figures 3A et 3B).
- Préparer des grilles métalliques par des bandes d'environ 4 cm x 1,5 cm à partir de feuilles de treillis en acier inoxydable de coupe. Utilisez une perforatrice pour faire un trou au centre et plierles côtés pour créer une fin en quinconce. La grille doit être bien à plat à travers le puits central, couché parallèlement au fond de la cuvette (figures 3A et 3B). Autoclave pour stériliser les grilles avant de l'utiliser.
- Couper un morceau de téréphtalate de polyéthylène transparent (PET) membrane (taille des pores 0,4 um) suffisamment grand pour recouvrir le trou de la grille. Placer la membrane de coupe dans le plat avec la tranche sélectionnée.
- Placez la tranche au-dessus de la membrane, puis soulevez délicatement la membrane de la moyenne, avec une tranche aplatie dans le centre.
- Placer le filtre dans la grille sur le trou circulaire au centre, et à environ 1 ml de milieu de culture à la source, au niveau de la membrane.
- Pour les manipulations ajouter des protéines ou des inhibiteurs de petites molécules dans le milieu (par exemple 8).
- Photographier la tranche pour un enregistrement de la morphologie au jour 0 de la culture.
- Placez les plats dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO
- Photographier les cultures à intervalles réguliers pour en moyenne 7 jours. Changer le milieu de culture tous les 48-72 heures. Pour la photographie afficher les tranches avec une source de lumière de dessous (figures 2C-E).
5. Lineage traçage
Si lignée traçage est nécessaire, des colorants lipophiles tels que Dil ou DiO peuvent être injectés dans le germe de la dent avant l'étape 4, la culture de la tranche.
- Tirez aiguilles capillaires en verre à l'aide d'un extracteur d'aiguilles.
- Casser l'embout de l'aiguille en utilisant une pince et placer la pointe vers le bas dans la solution de colorant. Laissez agir quelques minutes tandis que le colorant remplit la pointe par capillarité.
- Placez l'aiguille rempli dans un support et fixer par un tuyau à un injecteur ou la bouche aspirateur.
- Positionner la pointe de l'aiguille dans le milieu de culture de toucher la zone de la tranche due à étiqueter. Appliquer une pression d'air pour déplacer une petite quantité de colorant sur la une de l'aiguilleD sur le tissu.
- Retirer l'aiguille et vérifier si l'étiquetage en fluorescence.
- Tranches marquées avec succès peuvent être transférées sur des filtres et cultivées comme décrit dans l'étape 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afin de suivre le mouvement du premier follicule dentaire molaire, 250 um tranches frontales ont été prises au moyen d'un maxillaire inférieur en utilisant la méthode décrite ci-dessus. Le follicule dentaire est la couche de mésenchyme qui entoure l'émail épithélium externe (OEE) de la dent de développement, et a été montré précédemment pour participer à la formation de tissus du parodonte 6. Mandibules ont été disséqués à E14.5, l'étape de bouchon de développement des dents. Dans la tranche le contour de l'épithélium dentaire était clair, et le mésenchyme dentaire condensation pourrait être identifié comme un anneau sombre autour de la dent épithélium (figure 4A). Dil ont été injectés dans le mesenchyme à côté de l'émail épithélium externe de la tranche d'une dent sur le côté lingual (Figure 4A). Après marquage des coupes ont été cultivées pendant 4 jours et on les photographie à des intervalles (Figures 4b et 4c). In vivo les germes dentaires auraient atteintl'étape de la cloche par -18,5, et une forme de stade de cloche distinct a été observée dans les tranches, indiquant une progression similaire au cours de cette période. La place de Dil a été vu pour s'étendre dans un groupe de cellules s'étendant autour de l'épithélium dentaire externe que la dent a augmenté (figures 4B et 4C).
Figure 1. Formation de tranches vivants. (A) d'embryons de E14.5. Les lignes pointillées indiquent les plans découpés avec une aiguille de dissection, en commençant par la découpe inférieure de la décapitation. (B) disséquée mâchoire inférieure. La langue est orientée vers le bas. Le plan de coupe pour le broyeur de tissu est représenté en utilisant des lignes en pointillés. (C) broyeur de tissus montrant bras de lame (BA) et le disque de montage blanc (MD) avec échantillon préparé (flèche). (D) tranche représentative par la molairerégion. Les flèches indiquent les germes dentaires molaires. (E) High puissance d'une tranche molaire. L'épithélium dent de germe est décrite avec des taches noires. Images aiguisé l'aide de Photoshop. T = langue, DB = dentaire os, le cartilage de Meckel = MC. La barre d'échelle dans A = 3 mm. La barre d'échelle dans B & D = 1 mm. La barre d'échelle dans E = 500 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Incisive et de la culture de la glande. (A) E12.5 Mandibule qui a été haché sagittale. Incisives développement (taches blanches décrites avec astérisque) et les glandes sous-maxillaires (décrites avec des taches noires et fléchés) peuvent être fabriqués à partir juste. (B) de la même mandibule montrant centrales 4 tranches séparé. Le développement sous-maxillaire glande cun être considéré comme un bourgeon entouré de mésenchyme condensé (têtes de flèches) dans les deux sections latérales plus (en haut de l'image). Le mésenchyme condensation autour de la glande est entourée en rouge. Les incisives sont au stade de l'épithélium épaississant (astérisque) dans les deux tranches centrales (en bas de l'image). (C) tranche sagittale une incisive à E14.0 au jour 0. (D) de la même tranche un jour plus tard. (E) de la même tranche après 3 jours de culture. (CE) points de flèches pour incisive et formant boucle col de l'utérus labiale. Arrowhead pointe vers le développement glande sous-maxillaire. Dans la culture du germe de la dent s'étend vers l'arrière comme les boucles du col croître, tandis que la glande salivaire continue à subir la morphogenèse de ramification et la formation de lumière. Images aiguisé l'aide de Photoshop. T = la langue, le cartilage de Meckel = MC. La barre d'échelle dans A & B = 1 mm. La barre d'échelle en C, D, E = 500 um. Cliquez icipour agrandir la figure.
Figure 3. La méthode de culture. (A) tranche de culture. La culture est assis sur un filtre transparent suspendu sur support par l'intermédiaire d'une grille métallique. Un trou dans la grille permet à la tranche d'être visualisée avec de la lumière par le dessous. (B) Schéma de la méthode de culture.
Figure 4. Dil étiquetage du follicule dentaire. (AC) a fusionné lumière et le terrain sombre des images montrant le développement de germe de dent molaire et l'emplacement de l'étiquette de la lignée Dil. (A) le jour 0. Le germe de la dent (tête de flèche) est au stade de la PAC. Dil marque les cellules du follicule dentaire sur le côté lingual de la dent. (B (C) Jour 4. Le germe de la dent a atteint le stade de la cloche et les cellules marquées sont Dil vu se propager dans un arc autour du développement de l'émail épithélium externe. Images ont été aiguisé dans Photoshop après la fusion des couches en utilisant le mode de l'écran. Épithélium de la dent décrit avec des taches noires. DP = papille dentaire se trouvant dans l'épithélium adamantin interne. DF = follicule dentaire, qui tourne autour de l'épithélium adamantin externe. MC = cartilage de Meckel. La barre d'échelle en A, B, C = 500 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette méthode de culture de la dent présente l'avantage que l'accès au germe de la dent est excellente, ce qui permet lignée de traçage précis et le placement des billes à l'intérieur de l'épithélium ou du mésenchyme. Régions définies du germe dentaire en développement peuvent donc être spécifiquement ciblées. Au cours de la culture de la morphologie évolution du germe de la dent peut être suivie, et l'effet de manipulations a rapidement évalué.
Le procédé, cependant, ne convient que pour des jeunes germes dentaires avant formation substantielle de tissus durs, tels que la dentine et l'émail, comme ceux-ci ne peuvent pas être coupés avec précision. Pour mandibules après E15.5 il est nécessaire d'enlever l'os avant de les hacher. Ceci a l'inconvénient de potentiellement endommager le germe de la dent, qui est étroitement associée à l'os de E16.5. Nous avons tranché succès germes dentaires disséqués jusqu'à postnatale jour 4, après quoi la dent devient trop dur pour l'hélicoptère à couper en raison du dépôt de l'émail. La tranche méthode fonctionne bien sur les germes des dents de E13.5, soit le stade du bouton 1,6. Avant ce point dans le temps, lorsque la dent est à l'étape d'épaississement de l'épithélium, les germes dentaires font se développer, mais le taux de réussite est réduite et la morphologie peuvent être affectés sur le long terme.
Un inconvénient majeur de cette méthode est que le découpage se produit de façon aléatoire à travers la dent. En quelques tranches tout un germe de dent se trouve dans une tranche, tandis que d'autres l'hélicoptère peut couper le germe de la dent par le milieu. Cela signifie qu'il peut être difficile d'obtenir un grand nombre de tranches identiques. Pour lutter contre ce problème, il est possible de diviser une tranche au milieu et utiliser les côtés droit et gauche comme expérimental et de contrôle. Pour cela, cependant, la mandibule doit être soigneusement placé sur le disque de coupe pour assurer la tranche est découpée symétriquement. Pour certaines expériences, il est avantageux d'avoir des tranches qui découpent la dent de telle sorte que des structures internes, telles que l'émailnoeud, peut être consulté pour l'étiquetage de la lignée 4. Le germe de la dent semble très robuste et ces demi germes dentaires sont en mesure de bien se développer dans la culture, comme montré précédemment dans moitiés germes dentaires molaires 12,13.
Comme alternative à découper culture, germes dentaires peuvent être disséqués hors de la mandibule et on les cultive dans l'isolement 14. Cela supprime le problème de la mauvaise nutrition et l'oxygénation associée à la mise en culture de grands blocs de tissus et conduit à un bon développement des dents, mais comme une conséquence de la dent se développe sans interaction avec le tissu environnant. Lorsque de grandes quantités de mésenchyme entourant sont retirés le nombre de germes de dents qui forment peut être modifiée, en soulignant l'importance du mésenchyme entourant pour le développement de la dent normale 15. Tranche de culture est donc une bonne méthode pour l'étude des interactions des tissus, par exemple comment l'os et de la dent interagissent dans la formation de l'os alvéolaire, ou comment le salivarient glandes interagissent avec la langue et l'épithélium buccal, quelque chose qui est perdue lorsque ces tissus sont cultivés isolément.
Cet article met en évidence l'utilisation de ce procédé de mise en culture des germes dentaires, mais le même procédé est également excellent pour la culture en développement des glandes sous-maxillaires et sublinguales et en suivant l'évolution de la structure tel que le cartilage de Meckel (figure 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Sarah A. Alfaqeeh est financé par Genre Saud University College of Dentistry, Ministère de l'Enseignement Supérieur, Royaume d'Arabie Saoudite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
