Summary
Qui ci dettaglio un metodo per cultura germi denti in fette mandibola con un chopper tessuto. Questo metodo consente l'accesso esclusivo al dente durante lo sviluppo, fornendo un'ottima opportunità per la manipolazione e lignaggio tracing, non disponibile utilizzando metodi di coltura più tradizionali.
Abstract
Cultura espianto permette la manipolazione di sviluppare organi in punti temporali specifici ed è quindi un metodo importante per il biologo dello sviluppo. Per molti organi è difficile accedere tessuto sviluppo per consentire il controllo nelle ex vivo cultura. Il metodo di coltura fetta permette l'accesso al tessuto in modo che i movimenti morfogenetici possono essere seguiti e specifiche popolazioni cellulari possono essere oggetto di manipolazione o lineage tracing.
In questo articolo descriviamo un metodo di cultura fetta che ha avuto molto successo per la cultura di germi denti in una vasta gamma di specie. Il metodo fornisce un eccellente accesso ai germi dei denti, che si sviluppano a un ritmo simile a quello osservato in vivo, circondato da altri tessuti della mascella. Questo permette interazioni tessuto tra il dente e del tessuto circostante da monitorare. Sebbene questo documento si concentra sulla germi dei denti, lo stesso protocollo può essere applicato a seguire lo sviluppo di un numerodi altri organi, come ad esempio le ghiandole salivari, cartilagine di Meckel, ghiandole nasali, lingua e orecchie.
Introduction
Per una serie di esperimenti è importante essere in grado di coltura di tessuti ex vivo per seguire lo sviluppo. Cultura di sviluppo del tessuto fornisce l'accesso a determinati periodi di sviluppo e permette la manipolazione dei geni con l'aggiunta di fattori al terreno di coltura, o microsfere caricate, e con l'uso di trasfezione e elettroporazione 1. Per molti esperimenti è importante essere in grado di visualizzare il tessuto come cresce, per esempio, per seguire il destino di cellule della linea etichettato come il tessuto subisce morfogenesi. Questo può essere particolarmente problematico per i tessuti che si sviluppano in profondità all'interno dell'embrione, che non sono evidenti quando un blocco di tessuto dall'embrione è coltivato. I denti sono buoni esempi di questo, come si sviluppano all'interno del processo nasale della mandibola, mascellare e frontale. Quando tutta la mandibola viene coltivato le strutture superficiali del dente possono essere visualizzati ma cambiamenti nella morfologia possono essere analizzati solo dopo il sezionamento di tessuto fissato
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Protocol
1. Avviare
- Affinare gli strumenti di dissezione (utilizzando una pietra per affilare lubrificato con olio minerale) e sterilizzare prima di utilizzare per la cultura d'organo con un spruzzo di etanolo al 70% e la sterilizzazione a calore secco. Contrasta gli aghi di dissezione mediante elettrolisi a 2 M di idrossido di sodio con una alimentazione a 12 V.
- Preparare il terreno di coltura utilizzati per la dissezione e la cultura di organi embrionali, costituito Modified Eagle Medium F12 Advanced Dulbecco (DMEM F12) supplementato con 1% GlutaMAX e 1% di penicillina-streptomicina.
2. Embrione dissezione
- Abbattere una donna incinta a tempo accoppiato con un metodo programma uno come approvato dal Ministero degli Interni o di altro organo di governo. Sezionare via la pelle intorno al basso ventre, e tagliare aprire l'addome con le forbici. Individuare i due corni uterini, che collegano insieme alla linea mediana inferiore.
- Sezionare l'utero e posto in un tubo riempito con il mezzo sul ghiaccio. When su ghiaccio, il tessuto può essere lasciato per diverse ore.
- Rimuovere l'utero e posto in una capsula di Petri in mezzo al microscopio. Ove possibile dissezioni embrionali dovrebbero essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per minimizzare la contaminazione.
- Sezionare gli embrioni dall'utero e liberarli dai loro tessuti extraembrionali.
- Decapitare gli embrioni usando un ago di tungsteno e trasferire le teste in un fresco piatto di mezzo.
- Isolare le mandibole dalle teste inserendo un ago nella cavità orale e tagliare verso la parte posteriore della testa (Figure 1A e 1B). Isolato mandibole possono essere memorizzati temporaneamente in mezzo su ghiaccio durante l'attesa per tritare.
- Per intere fette mandibola stadi E11.5-E15.5 sono ideali per la cultura dente germe. Dopo E15.5 l'osso nella mandibola di sviluppo è troppo difficile per tritare. Fette dente può ancora essere apportate ma l'osso (dentario e formare l'osso alveolare) devono prima essere rimossila dissezione prima tagliare il 9. Rimuovere accuratamente osseo con aghi di tungsteno e pinze.
3. Embrione affettare
- Preparare le fette di tessuto mandibola con un chopper tessuto tabella standard (Figura 1C). Utilizzare una lama fresca dopo circa 200 mandibole, e assicurarsi che si trova a filo con il disco di montaggio quando cade.
- Pulire il disco di montaggio e lama con il 70% di etanolo prima dell'uso. Bisogna fare attenzione quando si utilizza la macchina, in quanto la lama è molto tagliente.
- Impostare il chopper ad una distanza di taglio tra 200-400 micron a seconda dell'età del campione, ea seconda se è necessaria l'intero germe dente. Impostare la pressione della lama al massimo.
- Trasferire una mandibola al disco di montaggio in plastica con una pipetta o pinze. Disporre la mandibola sulla realizzazione del disco che l'orientamento è ancora chiaro. La linguetta di sviluppo può essere utilizzato come punto di riferimento utile per determinare l'orientamento. Per molari uso afRontal / orientamento trasversale (vedi piano di taglio in Figura 1B), mentre per incisivi utilizzare una fetta sagittale attraverso la mandibola per riflettere il diverso orientamento di questi denti crescono (vedi piano di taglio nella Figura 2A).
- Rimuovere l'eccesso di terreno da tutto il tessuto su carta da filtro in modo da asciugare leggermente la mandibola sul disco di montaggio.
- Subito dopo l'essiccazione, posizionare il disco sul tavolo in acciaio inox circolare del chopper. Accendere la macchina e premere start. La tabella attraversa automaticamente da sinistra a destra, mentre allo stesso tempo il braccio taglio portando la lama è sollevato e lasciato cadere fino a 200 colpi / min.
- Spegnere la macchina una volta che il tessuto è stato completamente tranciato. Assicurarsi che il braccio lama è in posizione sollevata e rimuovere il disco. Non mettere le dita sotto il braccio lama o lasciare la macchina incustodita quando tagliare.
- Prendete il disco di montaggio e aggiungere immediatamente medie to le fette sul disco al fine di evitare un eccessivo essiccamento. Rimuovere accuratamente il tessuto tranciato dal fondo del disco utilizzando un ago di tungsteno e poi pipetta in una piccola capsula di Petri di media (Figura 2A).
- Separare le fette usando un ago e quindi selezionare le fette di tessuto contenenti il tessuto di interesse allo stereomicroscopio (Figure 1D, 1E, e 2B). Mettere le fette selezionati in piatti di coltura fresco con il mezzo.
4. Fetta Cultura
- Preparare organo coltura piatti centrali pozzetti pronti per cultura aggiungendo circa 2 ml di acqua autoclavato per pozzetto esterno per prevenire la disidratazione, e posizionando una griglia metallica attraverso il centro del piatto (Figure 3A e 3B).
- Preparare le griglie metalliche tagliando strisce di circa 4 cm x 1.5 cm da fogli di maglia di acciaio inossidabile. Utilizzare un pugno buco per fare un buco al centro e piegarei lati per creare un fine sfalsata. La griglia dovrebbe adattarsi perfettamente sulle pozzetto centrale, situata parallelamente al fondo del piatto (Figure 3A e 3B). Autoclave le griglie per la sterilizzazione prima dell'uso.
- Tagliare un pezzo di polietilene tereftalato trasparente (PET) membrana (dimensione dei pori 0,4 micron) sufficiente a coprire il foro nella griglia. Posizionare la membrana tagliata nel piatto con la fetta selezionata.
- Posizionare la fetta in cima alla membrana e poi sollevare con cura la membrana fuori del mezzo, con fetta appiattita nel centro.
- Posizionare il filtro sulla griglia sopra il foro circolare al centro, e aggiungere circa 1 ml di terreno di coltura al pozzo, fino al livello della membrana.
- Per manipolazioni aggiungere proteine o piccole molecole inibitrici al mezzo (ad esempio 8).
- Fotografare la fetta per un record di morfologia al giorno 0 della cultura.
- Porre le capsule in atmosfera umidificata al 5% CO
- Fotografare le culture a intervalli regolari per in media 7 giorni. Modificare il terreno di coltura ogni 48-72 ore. Per photography visualizzare le fette con una sorgente di luce da sotto (Figure 2C-E).
5. Lineage Tracing
Se è necessario lignaggio tracing, coloranti lipofili come DII o DiO possono essere iniettati nel germe del dente prima del punto 4, della cultura fetta.
- Tirare aghi capillari di vetro con un estrattore ago.
- Rompere la punta dell'ago con pinze e inserire la punta verso il basso nella soluzione colorante. Lasciare agire per qualche minuto, mentre il colorante riempie la punta per azione capillare.
- Posizionare l'ago riempito in un supporto e collegare tramite tubi ad un iniettore o alla bocca di aspirazione.
- Posizionare la punta dell'ago nel mezzo di coltura di toccare la superficie della fetta a causa di etichettatura. Applicare una pressione dell'aria di spostare una piccola quantità di colorante fuori un agoD sul tessuto.
- Rimuovere l'ago e controllare l'etichettatura in fluorescenza.
- Fette etichettati correttamente possono essere trasferiti ai filtri e coltivate come descritto nel passaggio 4.
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Representative Results
Al fine di seguire il movimento del primo follicolo dentale molare, 250 micron fette frontali sono stati prelevati attraverso una mandibola con il metodo sopra descritto. Il follicolo dentale è lo strato di mesenchima che circonda lo smalto epitelio esterno (OEE) del dente di sviluppo, ed è stato già dimostrato di partecipare alla formazione di tessuto del periodonto 6. Mandibole sono stati sezionati a E14.5, nella fase tappo dello sviluppo dei denti. Nella fetta il contorno dell'epitelio dentale era chiaro, e mesenchima dentale condensazione potrebbe essere identificato come un anello scuro intorno al (Figura 4A) dente dell'epitelio. DII è stato iniettato nel mesenchima accanto allo smalto epitelio esterno della fetta dente sul lato linguale (Figura 4A). Dopo etichettare le fette sono state coltivate per 4 giorni e fotografati ad intervalli (figure 4b e 4c). In vivo i germi dei denti avrebbe raggiuntola fase campana da E18.5, e una forma distinta fase campana è stata osservata in fette, indicando una progressione simile in questo periodo di tempo. Lo spot di DII fu visto estendersi in una fascia di celle che si estendono intorno al epitelio dentale esterna del dente cresciuto (Figure 4B e 4C).
Figura 1. Formazione di fette vivi. (A) E14.5 embrione. Le linee tratteggiate indicano i piani di taglio con un ago dissezione, partendo con il taglio inferiore per decapitazione. (B) Dissected mascella inferiore. La lingua è rivolta verso il basso. Il piano di sezione per il chopper tessuto è mostrato utilizzando linee tratteggiate. (C) Tissue chopper mostrando braccio lama (BA) e disco di montaggio bianca (MD) con il campione preparato (freccia). (D) fetta rappresentativa attraverso il molareregione. Le frecce indicano i germi dei denti molari. (E) vista alto potere di una fetta molare. L'epitelio dente germe è delineato con macchie nere. Immagini affilano con Photoshop. T = Tongue, DB = dentario osso, cartilagine di Meckel = MC. Bar Scala in A = 3 mm. Bar Scala in B & D = 1 mm. Bar Scala in E = 500 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Incisivo e la cultura della ghiandola. (A) E12.5 mandibola che è stato tagliato sagittalmente. Incisivi in via di sviluppo (macchie delineati bianche con asterisco) e ghiandole sottomandibolari (delineati con macchie nere e dalle frecce) possono essere appena fatto fuori. (B) stessa mandibola mostrando centrali 4 fette separate fuori. Lo sviluppo della ghiandola sottomandibolare cun essere visto come un bocciolo circondato da mesenchima condensato (punte di freccia) nelle due sezioni più laterali (top dell'immagine). Il mesenchima condensazione attorno alla ghiandola è delineato in rosso. Gli incisivi sono in fase di ispessimento epiteliale (asterix) nei due fette centrali (inferiore dell'immagine). (C) fetta sagittale attraverso un incisivo a E14.0 il giorno 0. (D) La stessa fetta 1 giorno dopo. (E) stessa fetta dopo 3 giorni di coltura. (CE) freccia incisivi e formando anello cervicale labiale. Arrowhead punta a sviluppare ghiandola sottomandibolare. Nella cultura il germe dente estende all'indietro anse cervicali crescono, mentre la ghiandola salivare continua il branching morfogenesi e formazione lumen. Immagini affilano con Photoshop. T = Tongue, cartilagine di Meckel = MC. Bar Scala in A & B = 1 mm. Barra della scala in C, D, E = 500 micron. Clicca quiper ingrandire la figura.
Figura 3. Metodo di coltura. (A) fetta coltivate. La cultura si siede su un filtro trasparente sospeso su medio attraverso una griglia metallica. Un foro nella griglia permette la fetta di essere visualizzato con luce dal basso. (B) Schema del metodo di coltura.
Figura 4. Etichettatura DII del follicolo dentale. (AC) uniti leggeri e di campo scuro immagini che mostrano lo sviluppo molare germe del dente e la posizione dell'etichetta lignaggio DII. (A) Giorno 0. Il germe del dente (freccia) è in fase di tappo. DII etichette cellule del follicolo dentale sul lato linguale del dente. (B (C) Giorno 4. Il germe del dente ha raggiunto la fase campana e le cellule DII marcate sono visti a diffondersi in un arco intorno alla sviluppo esterno dello smalto epitelio. Le immagini sono state affilate in Photoshop dopo la fusione strati utilizzando la modalità a tutto schermo. Epitelio del dente delineato con macchie nere. DP = papilla dentale che si trova all'interno dello smalto epitelio interno. DF = follicolo dentale, che corre intorno lo smalto epitelio esterno. MC = cartilagine di Meckel. Barra della scala in A, B, C = 500 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Questo metodo di coltura dente ha il vantaggio che l'accesso al germe dente è eccellente, consentendo lignaggio accurato tracciamento e posizionamento di perline all'interno dell'epitelio o mesenchima. Regioni definite del dente di sviluppo germe possono quindi essere specificamente mirati. Durante la coltura morfologia mutevole del germe dente può essere seguito, e l'effetto di manipolazioni valutato rapidamente.
Il metodo, tuttavia, è adatto solo per giovani germi dente prima formazione sostanziale di tessuti duri, come smalto e dentina, in quanto questi non possono essere tagliate con precisione. Per mandibole dopo E15.5 è necessario rimuovere l'osso prima tagliere. Questo ha lo svantaggio di potenzialmente danneggiare il germe del dente, che è strettamente associato con l'osso da E16.5. Abbiamo affettato successo germi dente sezionato fino al giorno postnatale 4, dopo che il dente diventa troppo duro per il chopper per tagliare a causa della deposizione di smalto. La fetta metodo funziona bene su germi dei denti da E13.5, cioè lo stadio gemma 1,6. Prima di questo tempo-punto, quando il dente è in fase di ispessimento epiteliale, i germi dei denti fanno sviluppare ma il tasso di successo è ridotto e la morfologia possono essere influenzati nel lungo termine.
Uno svantaggio principale di questo metodo è che la trinciatura avviene a caso attraverso il dente. In alcune fette tutta una germe del dente si troverà all'interno di una sezione, mentre in altri l'elicottero potrebbe tagliare il germe del dente attraverso il centro. Ciò significa che può essere difficile ottenere un gran numero di fette identici. Per combattere questo problema, è possibile dividere una fetta a metà e usare il lato destro e sinistro come sperimentale e di controllo. Per questo, però, la mandibola deve essere accuratamente posizionato sul disco tagliere per garantire la fetta viene tagliata simmetricamente. Per alcuni esperimenti è un vantaggio avere sezioni che sezionano il dente in modo che le strutture interne, come lo smaltonodo, si può accedere per l'etichettatura lignaggio 4. Il germe del dente appare molto robusto e tali germi dente mezzo sono in grado di sviluppare bene in cultura, come precedentemente illustrato nella dimezzati i germi dei denti molari 12,13.
In alternativa alla affettare cultura, germi dei denti possono essere sezionati della mandibola e coltivate in isolamento 14. Ciò elimina il problema della scarsa nutrizione e ossigenazione associato coltura grandi blocchi di tessuto e porta a buon sviluppo dente ma come conseguenza il dente sviluppa senza interazione con il tessuto circostante. Quando grandi quantità di mesenchima circostanti vengono rimossi il numero di germi denti che formano può essere alterato, mettendo in evidenza l'importanza del mesenchima circostante per il normale sviluppo dei denti 15. Cultura fetta è quindi un buon metodo per studiare le interazioni dei tessuti, come per esempio l'osso e dente interagiscono nella formazione dell'osso alveolare, o come il salivariano ghiandole interagiscono con la lingua e l'epitelio orale, qualcosa che si perde quando questi tessuti sono coltivate in isolamento.
Questo documento evidenzia l'uso di questo metodo per la coltura di germi dente ma lo stesso metodo è anche eccellente per la coltura di sviluppo ghiandole sottomandibolari e sublinguali e seguendo lo sviluppo della struttura come la cartilagine di Meckel (Figura 2).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Sarah A. Alfaqeeh è finanziato dal tipo Saud University College of Dentistry, Ministero dell'Istruzione Superiore, Regno dell'Arabia Saudita.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
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