切片培养法继牙胚在植文化的发展

Summary

在这里，使用组织斩波我们详细的方法在下颌切片文化牙胚。这种方法允许独特的访问牙齿发育过程中，为操作和谱系跟踪，不可使用更传统的培养方法极好的机会。

Abstract

外植体培养，因此可以操纵开发机构在特定的时间点，是对发育生物学家的一个重要方法。对于许多器官也难以进入显影组织，以允许在体外培养过程中监测。切片培养法允许访问的组织，这样形态的动作可以遵循和特定细胞群可以有针对性地进行操作或谱系跟踪。

在本文中，我们描述切片培养的方法，它一直是在一个范围内的物种牙胚的文化非常成功。该方法提供了极好的访问牙胚，它以类似的速度，以在体内观察到的，由其他组织下巴周围发展。这允许要监视的牙齿和周围组织之间的组织的相互作用。虽然本文集中于牙胚，相同的协议可以被应用到遵循的一些发展其他器官，如唾液腺，麦氏软骨，鼻腺，舌和耳。

Introduction

对于一些实验，它能够培养组织体外遵循发展是重要的。发展组织的培养提供了访问在发展的定义期间，允许操纵基因通过添加因子的培养基中，或在负载的珠子，以及通过使用转染和电穿孔^1。许多实验都必须能以可视化的组织，它的增长，例如，遵循谱系标记的细胞的命运的组织形态发生是很重要的。这可以是特别有问题的组织是开发深胚胎内，这是不很明显，当组织从胚胎的块进行培养。牙齿是很好的例子，因为他们的下颌骨，上颌骨和额鼻过程中的发展。当整个下颚被培养在牙的表面上的结构可以被看作但切片固定组织后改变形态只能分析3。这些切片培养已在直接跟随牙的形态发生，并允许不同的组件，如釉质结节与牙乳头和滤泡^1,4-7的谱系追踪是非常有益的。该技术不仅限于小鼠胚胎，并已成功地用于猪的文化活切片和蛇的牙齿组织^8,9。除了具有能够直观牙齿发育的好处，该切片法也具有这样的薄片组织的增加访问营养素从介质和空气从培养箱的优点。这将导致在牙胚，这符合开发在体内 ，并显示invas的改善的生长离子内皮细胞进入乳头^7。相反，在整个下颌骨培养牙胚发育比那些在体内更慢和文化的中心通常是坏死的长期培养物。在切片培养，齿颚片内形成的，其与周围的显影骨和其他组织的相互作用可以被监控。在我们的方法中组织被切除，而无需在支持介质^10,11嵌入和不需要任何系统的组织附着在砧板直后切碎。该方法因此无创，快速，让很多下颌骨在一个会话中切片。

Protocol

1。设置

1. 削解剖工具（使用润滑用矿物油一刃磨石）和灭菌前用70％乙醇喷雾和干热灭菌用于器官培养。使用12 V电源用电解2M的氢氧化钠锐化解剖针。
2. 准备用于胚胎器官的解剖和培养的培养基，其中包括：高级Dulbecco改良的Eagle培养基F12（DMEM F12），补充有1％的GlutaMAX和1％青霉素 - 链霉素。

2。胚胎解剖

1. 扑杀使用调度一种方法核定由内政部或其他监管机构定时交配怀孕的女性。剖析了周围的小腹皮肤，切用剪刀打开腹部。找出两个子宫角，它们共同连接在较低的中线。
2. 解剖出子宫，并装在填充有在冰上介质的管。磨片N于冰上，可将组织放置数小时。
3. 取出子宫并放置在陪替氏培养皿中的培养基显微镜下。在可能的胚胎解剖应在层流罩下进行，以减少污染。
4. 解剖出来自子宫的胚胎，并从他们的胚外组织释放他们。
5. 使用钨针杀头的胚胎和磁头转移到介质的新鲜菜。
6. 通过将针头插入口腔隔离从磁头的下颌骨和切断通过朝向头部的背面（ 图1A和1B）。分离的下颌骨，可暂时储存在冰上介质，同时等待斩波。
7. 对于整个下颌骨片阶段E11.5-E15.5是理想的牙胚文化。 E15.5后下颌骨发育骨太硬切碎。牙片仍然可以提出，但骨（齿骨形成和牙槽骨）必须首先被删除砍⁹前清扫。使用钨针和镊子小心取出骨头。

3。胚胎切片

1. 使用标准表组织斩波器（ 图1C）准备下颌骨组织切片。用新鲜叶片后约200下颌骨，并确保它在于安装盘平齐时，它下降。
2. 清洁安装光盘并在使用前用70％乙醇刀片。护理必须使用本机时，应考虑，因为刀片非常锋利。
3. 根据试样的年龄之间200-400微米的切割距离设定斩波，并且取决于整个牙胚是否是必需的。设置最大的剑锋。
4. 用吸管或镊子转移到下颌骨的塑料安装光盘。安排在光盘制作确认方向仍然是清晰的下颌骨。显影舌可被用作用于确定方位的有用的地标。对于臼齿使用自动对焦rontal /横向取向（参见斩波图1B中的平面），而对于门牙用的矢状切片，通过下颌骨，以反映这些牙齿的不同取向，因为他们成长（参见砍在图2A的平面）。
5. 从各地使用滤纸以稍干上安装盘下颌骨组织去除多余的介质。
6. 立即干燥后，将光盘上的斩波器的圆形不锈钢工作台。打开机器的电源，然后按启动。该表由左到右，而在同一时间的斩波臂承载叶片升高和下降高达200转/分钟进行自动遍历。
7. 关闭机器，一旦组织已经完全切片。确保刀片臂在上升位置，取出光盘。不要将手指下的刀片手臂或切碎时，让机器自行。
8. 拿安装盘，立即加入培养基吨Ø为了光盘上的切片，以防止过度干燥。小心地使用钨针，然后吸移管插入介质的小培养皿中（ 图2A）从盘的底部撞出切片组织中。
9. 用针管分离的切片，然后选择包含在立体显微镜下（ 图1D，1E，和2B）感兴趣的组织的组织切片。将所选切片新鲜培养皿中等。

4。切片文化

1. 通过将大约2毫升灭菌水至外井，以防止脱水，并通过在盘的中心定位的金属网格准备中央孔器官培养皿中准备培养物（ 图3A和3B）。
2. 切割片大约4×1.5cm的从不锈钢网片准备的金属网格。用打孔器，使在中心的孔和弯曲的侧面，以形成交错末端。电网应该适合平板横贯中部不错，躺在平行的菜（ 图3A和3B）的底部。高压灭菌电网使用前消毒。
3. 切下一块的透明聚对苯二甲酸乙酯（PET）膜（孔径0.4微米）大到足以覆盖在网格中的孔。将切膜进入与所选择的切片的菜。
4. 将切片在膜的顶部，然后小心地将膜出来的介质中，用切片展平在中心。
5. 将过滤器上的网格在圆形孔的中心，并加入大约1毫升培养物中至井，直至膜的水平。
6. 为操作添加的蛋白质或小分子抑制剂的培养基（例如^8）。
7. 拍摄片的形态在培养的第0天的纪录。
8. 将菜在5％CO2的潮湿气氛
9. 拍摄的培养，定期为平均7天。改变培养基每48-72小时。对于摄影从下方（ 图2C-E）查看切片用光源。

5。谱系追踪

如果谱系追踪是必需的，亲脂性染料，如DiI荧光或DIO可以在步骤4中，切片培养之前被注入牙胚。

1. 使用针拔出器拉玻璃毛细管针。
2. 打破使用镊子将针的尖端和下入染料溶液放置小费。离开了几分钟，而染料通过毛细管作用填充小费。
3. 将填充针插入支架，并通过管道连接到注射器或口吸气。
4. 放置在培养基中接触片由于被标记的区域中的针的尖端。适用于空气压力使少量的染料出针的的ð到组织中。
5. 卸下针头和检查下荧光标记。
6. 成功标记切片可以转移到过滤器，如步骤4中所述培养。

Representative Results

为了按照第一磨牙牙囊的运动，为250μm额叶切片使用上述的方法通过下颌骨服用。的牙囊是间充质包围的外釉质上皮显影齿的（OEE）的层，并且先前已被证明参与牙周⁶的组织的形成。下颌骨解剖在E14.5，牙齿发育的帽状期。在该切片的牙科用上皮的轮廓是清楚的，并且冷凝牙齿间充质可以被识别为周围的牙上皮细胞（ 图4A）较暗的环。的DiI注射在旁的舌侧（ 图4A）的齿片的外釉质上皮间质。标记后的切片进行培养4天，拍摄间隔（ 图4B和4C）， 在生物体内的牙胚就已经达到钟阶段由E18.5，和一个独特的钟形阶段中观察到的条带，这表明了类似的进展在这个时间段。 DiI荧光的斑点被认为延伸到围绕外牙上皮延伸的牙齿生长（ 图4B和4C）细胞的频带。

图1。形成带电片（A）E14.5胚胎。虚线表示切用解剖针的飞机，开始与斩首的低切。 （二）解剖下颌。舌头朝下。部分，用于将组织切碎机的平面是用虚线示出。 （ 三）组织切碎机刀片显示臂（BA）和白色的安装盘（MD）与试样准备（箭头）。 （D）通过的摩尔代表性切片区域。箭头指向磨牙牙胚。摩尔切片（E）高功率视图。牙胚上皮细胞中都列出了黑点。图片使用Photoshop锐化。 T =舌，DB =齿骨骨，MC =麦氏软骨。比例尺在A = 3毫米。比例尺在B＆D = 1毫米。比例尺在E = 500微米。 点击这里查看大图 。

图2。切牙和腺体的文化。（A）E12.5下颌骨已经被切碎的矢状面。发展中切牙（概述白斑有星号）和颌下腺（概述与黑点和箭头所示），可刚做出来。 （二）同下颌骨展示中部地区4片分离出来。发展颌下腺ç一个被看作是由间质浓缩（箭头）中的两个侧部（图像的顶部）包围的花蕾。腺体周围的间充质冷凝红色概述。门牙是在上皮增厚阶段（星号），在两个中心片（图像的底部）。 （ 三）通过切牙在E14.0在第0天矢状切片。 （ 四）同一切片一天后。 （ 五）在培养3天同片。 （CE），箭头指向切牙，形成唇颈环。箭头指向发展颌下腺。在文化牙胚向后延伸，宫颈环增长，而唾液腺继续进行分支形态和管腔形成。图片使用Photoshop锐化。 T =舌，MC =麦氏软骨。比例尺在A及B = 1毫米。比例尺在C，D，E = 500微米。 点击这里查看大图。

图3。培养方法：（A）培养切片。文化坐在一个透明的过滤器通过金属网格悬浮在介质中。在网格的孔允许切片从下面可视化光。 （B）示意图培养方法。

图4。牙囊的DiI荧光标记。（AC）合并光和暗场图像显示开发磨牙牙胚和DII血统的标签位置。 （A）0天。牙胚（箭头）是在盖的阶段。 DiI荧光标记在牙齿的舌侧的牙囊细胞。 （二三）4天。牙胚已达到喇叭口期和DiI标记细胞被视为分散在各地的发展外釉上皮的弧度。图像已被削尖在Photoshop中使用的屏幕模式合并图层后。牙上皮概述有黑色斑点。 DP =牙乳头内躺着内釉上皮细胞。 DF =牙囊，它到处跑外釉上皮。 MC =麦氏软骨。在比例尺，B，C = 500微米。 点击这里查看大图 。

Discussion

齿培养的本方法具有获得牙胚的优点是优异的，从而允许精确的谱系追踪和内上皮或间质珠放置。显影牙胚的限定的区域，因此可以专门针对。在文化牙胚的形态变化可以遵循，以及操作的效果快速评估。

的方法，然而，这只是适合于大量形成硬组织如牙质和釉质前年轻牙胚，因为这些不能准确地切碎。对于下颌骨后E15.5有必要砍前去除骨头。这具有潜在的破坏性的牙胚，这是密切与E16.5骨相关的缺点。我们已经成功地切片解剖​​牙胚多达4日龄后，该齿变得太硬的斩波削减由于牙釉质的沉积。切片米法认列行之有效从E13.5牙胚， 即萌芽阶段^1,6。在此之前的时间点，当齿是在上皮增厚阶段，牙胚做开发但成功率降低，该形态可影响在长期内。

该方法的一个主要缺点是断续发生在随机穿过牙齿。在一些片整体牙胚将片内找到，而在其他的菜刀可以通过中间切牙胚。这意味着，它可能难以得到大量的相同的片。为了解决这一问题，可以将一个切片拦腰并使用左，右两侧为实验组和对照。对于这一点，但是，下颌骨必须小心地放置在斩波盘，以确保片对称地切割。对于一些实验中它是有一个解剖的齿片的优点，这样的内部结构，如搪瓷结，可访问的谱系标记^4。牙胚显得非常强大，例如半牙胚能够在文化发展好，因为以前在减半磨牙牙胚^12,13所示。

作为替代切片培养，牙胚可解剖出下颌骨和在隔离¹⁴培养的。这将删除与组织培养大块的相关营养不良和氧合的问题，并导致良好的牙齿发育，但作为结果的牙齿没有互动发展与周围组织。当大量的周围间质的除去形成牙胚的数目可以改变，突出周围间质的正常牙齿发育¹⁵的重要性。因此切片培养是研究组织的相互作用，例如在牙槽骨的形成骨骼和牙齿的交互方式，或如何在贝的好方法腺体变化用舌头和口腔上皮细胞，东西丢失时，这些组织都是在隔离培养互动。

本文重点介绍使用这种方法的培养牙胚但是同样的方法也非常适合发展培养颌下腺和舌下腺和结构的发展下，如麦氏软骨（ 图2）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers