The Slice Kultur Metode for følgende utvikling av Tooth Germs I Eksplantering Kultur

Summary

Her har vi detalj en metode for å kultur tann bakterier i kjeven skiver ved hjelp av en vev chopper. Denne metoden gir en unik tilgang til tannen under utvikling, og gir utmerket mulighet for manipulasjon og avstamning tracing, ikke tilgjengelig ved hjelp av mer tradisjonelle kultur metoder.

Abstract

Eksplantering kultur tillater manipulering av å utvikle organer på bestemte tidspunkter og er derfor en viktig metode for utviklingsbiologen. For mange organer er det vanskelig å få tilgang til utvikling av vev for å tillate overvåking under ex vivo kultur. Stykket kultur metoden gir tilgang til vev slik at morphogenetic bevegelser kan følges og spesifikke cellepopulasjoner kan være målrettet for manipulasjon eller avstamning sporing.

I denne artikkelen beskriver vi en metode for skive kultur som har vært svært vellykket for kultur av tann bakterier i en rekke arter. Metoden gir utmerket tilgang til tannen bakterier, som utvikler på et tilsvarende sats til den som ble observert in vivo, omgitt av de andre kjeve vev. Dette tillater vev interaksjoner mellom tannen og omgivende vev som skal overvåkes. Selv om dette dokumentet fokuserer på tann bakterier, kan den samme fremgangsmåte anvendes for å følge utviklingen av en rekkeav andre organer, som for eksempel spyttkjertler, Meckels brusk, nese kjertler, tunge og øre.

Introduction

For en rekke eksperimenter er det viktig å være i stand til kultur vev ex vivo for å følge utviklingen. Dyrkning av utvikling av vev gir tilgang ved definerte perioder med utvikling og tillater manipulasjon av genene ved tilsetning av faktorer til kulturmediet eller på lastet perler og ved bruk av transfeksjon og elektroporering ^1.. For mange eksperimenter er det viktig å være i stand til å visualisere vevet som det vokser, for eksempel, for å følge skjebnen til lineage merkede celler som vevet gjennomgår morphogenesis. Dette kan være spesielt problematisk for vev som utvikler seg dypt inne i embryo, som ikke er åpenbare når en blokk av vev fra embryo dyrkes. Tennene er gode eksempler på dette, som de utvikler i kjeven, overkjeve og frontal nasal prosessen. Når hele kjeven blir dyrket overfladiske strukturer av tannen kan sees, men forandringer i morfologi kan bare analyseres etter snitting av fast vev tre. Disse skive kulturer har vært svært nyttig i direkte følge morfogenese av tannen, og slik avstamning sporing av forskjellige komponenter, for eksempel emalje knute og tann papilla og hårsekken ^1,4-7. Teknikken er ikke begrenset til museembryoer og har med hell blitt brukt til kultur live-skiver av gris og slange dental vev ^8,9. I tillegg til fordelen ved å være i stand til å visualisere tannutvikling, har den skive-metoden har også den fordel at de tynne skiver av vev har økt tilgang på næringsstoffer fra mediet og luft fra inkubatoren. Dette resulterer i forbedret vekst av tann bakterier, som svarer til utvikling av in vivo, og viser invasion av endotelceller i papilla ^7.. I motsetning til dette tann bakteriene i hele kjevebenet kulturer utvikle langsommere enn de som er in vivo, og sentrum av kulturen er ofte nekrotisk i langtidskulturer. I skive kultur, utvikler tannen i løpet av en skive i kjeven, og dets interaksjon med det omgivende ben, og utvikling av andre vev kan overvåkes. I vår metode vevet er hakket rett etter disseksjon uten behov for å bygge inn i en støtte medium ^10,11 og ikke behov for noen system for å feste vevet til hoggestabben. Fremgangsmåten er derfor ikke-invasiv og hurtig, slik at mange kjever for å bli delt i en sesjon.

Protocol

En. Set Up

1. Skjerp instrumentene disseksjon (ved hjelp av en skjerping stein smurt med mineralolje) og sterilisere før bruk for orgel kultur ved hjelp av en 70% etanol spray og tørr-varme sterilisering. Skjerpe disseksjon nåler ved hjelp av elektrolyse i 2 M natriumhydroksid ved hjelp av en 12 V-forsyningen.
2. Forbered kultur medium som brukes for disseksjon og kultur av embryonale organer, som består av Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) supplert med 1% Glutamax og 1% penicillin-streptomycin.

2. Embryo Dissection

1. Cull en tidsbestemt parret gravid kvinne med en tidsplan én metode som er godkjent av the Home Office eller andre styrende organ. Dissekere bort huden rundt nedre del av magen, og skar opp magen med saks. Finn de to livmor horn, som kobles sammen på den nedre midtlinjen.
2. Dissekere ut livmoren og sted i et rør fylt med medium på is. When på is, kan vevet bli liggende i flere timer.
3. Fjerne livmor og plasser i en petriskål i medium under mikroskopet. Der det er mulig embryo dissections bør utføres i en laminær-strømningshette for å minimalisere forurensning.
4. Skjær ut embryoene fra livmoren og fri dem fra deres extraembryonic vev.
5. Halshogge embryoene ved hjelp av en tungsten nål og overføre hodene inn i en frisk fat med medium.
6. Isoler de kjever fra hodene ved å plassere en nål inn i munnhulen, og skjære gjennom mot baksiden av hodet (figurene 1A og 1B). Isolerte underkjever, kan lagres midlertidig i medium på is i påvente av hakking.
7. For hele kjeven skiver iscenesetter E11.5-E15.5 er ideelle for tann bakterie kultur. Etter E15.5 utviklings bein i kjeven er for vanskelig for hakking. Tann skiver kan fortsatt gjøres, men benet (dentary og danner kjevebenet) må først fjernes veddisseksjon før hakking ^ni. Fjern bein forsiktig med wolfram nåler og tang.

Tre. Embryo Kutting

1. Forbered kjeven vev skiver ved hjelp av et standard bord vev chopper (figur 1C). Bruk et nytt blad etter ca 200 underkjever, og sørge for at den ligger i flukt med monteringsplaten når den faller.
2. Rengjør monteringsplaten og blad med 70% etanol før bruk. Hensyn må tas når du bruker maskinen, som bladet er svært skarpt.
3. Sett hakkeren på en skjære avstand på mellom 200 til 400 um i henhold til alderen på prøven, og avhengig av om hele tannspirer er nødvendig. Sett bladet kraft på maks.
4. Overfør en kjeven til plastmonteringsplate med en pipette eller tang. Ordne kjeven på platen å gjøre at orientering er fortsatt tydelig. Fremkallings tungen kan anvendes som et nyttig kjennetegn for bestemmelse av orienteringen. For jeksler bruk afrontal / tverrgående retning (se plan for hakking i figur 1B), mens for fortenner bruke en sagittal skive gjennom kjeven for å reflektere den annen retning av disse tennene som de vokser (se plan for hakking i figur 2A).
5. Fjern det overskytende medium fra hele vev ved hjelp av filterpapir for å tørke litt kjeven på monteringsplaten.
6. Umiddelbart etter tørking, plasserer platen på sirkulær rustfritt stål bordet av helikopteret. Slå på maskinen og trykk start. Tabellen traverser automatisk fra venstre til høyre, mens på samme tid den hakking arm bærer bladet heves og slippes på opp til 200 slag / min.
7. Slå av maskinen etter at vevet har blitt fullstendig skiver. Pass på at bladet armen er i hevet posisjon og ta ut platen. Ikke plasser fingrene under knivarmen eller la maskinen stå uten tilsyn når hakking.
8. Ta monteringsplaten og umiddelbart legge mellom to skivene på platen for å forhindre overdreven uttørking. Løsne forsiktig skiver vev fra undersiden av platen ved hjelp av en wolfram-nål og deretter pipette inn i en liten petriskål av medium (figur 2A).
9. Separer skiver ved hjelp av en nål og deretter velge vev skiver som inneholder vev av interesse under et stereomikroskop (Tall 1D, 1E og 2B). Plasser utvalgte skiver i friske kultur retter med medium.

4. Slice Kultur

1. Forbered sentral-vel organkultur retter klar for kultur ved tilsetning av ca 2 ml autoklavert vann til den ytre godt for å hindre dehydrering, og ved å plassere en metallrist over midten av formen (Fig. 3A og 3B).
2. Forbered metallnett ved å kutte strimler ca 4 cm x 1,5 cm fra ark av rustfritt stål mesh. Bruk en hullmaskin til å lage et hull i midten og bøysidene for å skape en forskjøvet slutten. Risten bør passe flatt over den sentrale godt, liggende parallelt med bunnen av skålen (figurene 3A og 3B). Autoklav ristene å sterilisere før bruk.
3. Skjær ut et stykke av gjennomsiktig polyetylen-tereftalat (PET)-membran (porestørrelse 0,4 mm) store nok til å dekke hullet i nettet. Plasser kuttet membran i formen med den valgte skive.
4. Plasser skive på toppen av membranen og deretter forsiktig løfte membranen ut av mediet, med skive avflatet i midten.
5. Plasser filteret på risten over sirkulært hull i midten, og legge til omtrent 1 ml kulturmedium til brønnen, opp til nivået av membranen.
6. For manipulasjoner legge proteiner eller små molekyl-inhibitorer til mediet (for eksempel ^8).
7. Fotografere stykket for en registrering av morfologi på dag 0 av kultur.
8. Plasser serviset i en fuktet atmosfære av 5% CO
9. Fotografere kulturer med jevne mellomrom for i gjennomsnitt syv dager. Endre kulturen medium hver 48-72 hr. For fotografering vise skivene med en lyskilde fra undersiden (figur 2C-E).

5. Lineage Tracing

Hvis linjen tracing er nødvendig, kan lipofile fargestoffer som DII eller DiO injiseres i tannspirer før trinn 4, skive-kultur.

1. Trekk glass capillary nåler ved hjelp av en nål avtrekker.
2. Bryt spissen av nålen ved hjelp av tenger og plassere spissen ned i fargestoffoppløsningen. La stå i noen minutter mens fargestoff fyller spissen av Kapillarkrefter.
3. Plasser den fylte nål inn i en holder og feste via en slange til en injektor eller munn vifte.
4. Plasser nålespissen i dyrkningsmediet berøre område av skiven som skal merkes. Påfør lufttrykket for å fortrenge en liten mengde fargestoff ut av nålen end på vevet.
5. Fjern nål og se etter merking i henhold fluorescens.
6. Vellykket merket skiver kan bli overført til filter og dyrket som beskrevet i trinn 4..

Representative Results

For å følge bevegelsen av den første molar tann hårsekken, ble 250 mikrometer frontale snitt tatt gjennom en underkjeve med metoden som er beskrevet ovenfor. Tann follicle er laget av mesenchyme som omgir den ytre emalje epitel (OEE) av den tredje tann, og har tidligere blitt vist å ta del i dannelsen av vev av periodontium ^6.. Kjever ble dissekert ved E14.5, hetten stadium av tannutvikling. I stykket omrisset av tann epitel var klar, og den kondenserende tann mesenchyme kan bli identifisert som en mørkere ring rundt tannen epitelet (figur 4A). DII ble injisert i mesenchyme ved siden av det ytre epitel emalje på tannen skive på den linguale side (figur 4A). Når du har merket skivene ble dyrket i fire dager og fotografert i intervaller (Tall 4B og 4C). In vivo tann bakteriene ville ha nåddbell scenen ved E18.5, og en distinkt klokketrinn formen ble ikke observert i de skiver, som indikerer en tilsvarende progresjon i løpet av denne tidsperioden. I stedet for DII ble sett til å strekke seg inn i et bånd av celler som strekker seg rundt den ytre tann epitel som tannen vokste (figurene 4B og 4C).

Figur 1. Dannelse av live-skiver. (A) E14.5 embryo. Stiplede linjene indikerer flyene kuttet med en dissekere nål, starter med lavere kutt for halshogging. (B) dissekert underkjeven. Tungen vender nedover. Flyet av seksjon for vevet chopper er vist ved hjelp av stiplede linjer. (C) Tissue chopper viser blad arm (BA) og hvit monteringsplate (MD) med preparerte prøven (pil). (D) Representative snitt gjennom molarregionen. Pilene peker på molar tann bakterier. (E) Høy effekt visning av en jeksel skive. Tannen bakterie epitel er skissert med svarte flekker. Bilder skjerpet ved hjelp av Photoshop. T = Tongue, DB = Dentary bein, MC = Meckels brusk. Scale bar i A = 3 mm. Scale bar i B & D = 1 mm. Scale bar i E = 500 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Fortann og kjertel kultur. (A) E12.5 Mandible som har blitt hakket sagittally. Utviklings fortenner (skissert hvite flekker med asterix) og submandibular kjertler (skissert med svarte flekker og arrowed) kan bare gjøres ut. (B) Samme kjeven viser sentrale 4 skiver skilles ut. Utviklingslandene submandibular kjertel cen bli sett på som en knopp omgitt av kondensert mesenchyme (pilspisser) i de to sideprofiler (toppen av bildet). Den kondense mesenchyme rundt kjertelen er skissert i rødt. Fortennene er på epithelial fortykkelse scenen (asterix) i de to sentrale skiver (nederst på bildet). (C) Sagittal skive gjennom en fortann på E14.0 ved dag 0. (D) Samme skive en dag senere. (E) Samme skive etter tre dager i kultur. (CE) Arrow poeng å fortann og danner labial livmorhals sløyfe. Arrowhead peker på utvikling submandibular kjertel. I kultur tannen bakterie strekker bakover som cervical sløyfer vokse, mens spyttkjertelen fortsetter å gjennomgå forgrening morfogenese og lumen formasjon. Bilder skjerpet ved hjelp av Photoshop. T = Tongue, MC = Meckels brusk. Scale bar i A & B = 1 mm. Scale bar i C, D, E = 500 mikrometer. Klikk herå se større figur.

Figur 3. Kultur-metoden. (A) Cultured skive. Kulturen sitter på en gjennomsiktig filter suspendert over middels via en metallrist. Et hull i risten gjør det mulig for skiven å bli visualisert med lys nedenfra. (B) Skjematisk av kultur-metoden.

Figur 4. DII merking av tann hårsekken. (AC) Fusjonert lys og mørke feltet bilder som viser utviklingen molar tann spire og plassering av DII avstamning etiketten. (A) Dag 0. Tannen bakterie (pilspiss) er på hetten scenen. DII etiketter celler av dental follicle på den linguale side av tennene. (B (C) Dag 4. Tannen bakterie har nådd bjelle scenen og DII merket celler er sett til å spre seg ut i en bue rundt utvikle ytre emalje epitel. Bilder har blitt skjerpet i Photoshop etter sammenslåing lag bruker skjermmodus. Epitel av tann skissert med svarte flekker. DP = dental papilla liggende innenfor den indre emalje epitel. DF = dental hårsekken, som går rundt den ytre emalje epitel. MC = Meckels brusk. Scale bar i A, B, C = 500 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Denne metoden for tannkulturen har den fordel at tilgang til tannen bakterie er utmerket, slik at nøyaktig avstamning oppsporing og plassering av perler i epitelet, eller mesenchyme. Definerte regioner i utviklings tann bakterie kan derfor være spesielt målrettet. Under kultur skiftende morfologi av tannen bakterie kan følges, og effekten av manipulasjoner raskt vurderes.

Fremgangsmåten er imidlertid bare egnet for små tann bakterier før vesentlig dannelse av hardt vev, for eksempel dentin og emalje, da disse ikke kan hakkes nøyaktig. For underkjever etter E15.5 er det nødvendig å fjerne beinet før hakking. Dette har den ulempe potensielt skade tannspirer, som er nært forbundet med benet fra E16.5. Vi har med hell skiver dissekert tann bakterier opp til postnatal dag 4, hvoretter tannen blir for vanskelig for helikopteret å skjære på grunn av avleiring av emalje. Stykket m-metode fungerer godt på tann bakterier fra E13.5, dvs. fødselen scenen ^1,6. Før denne tid-punkt, når tannen er i epithelial fortykning stadium, tann bakterier gjør utvikle men suksessraten reduseres og morfologi kan påvirkes på lang sikt.

En stor ulempe ved fremgangsmåten er at hakke oppstår tilfeldig gjennom tannen. I noen skiver en hel tann bakterie vil bli funnet i løpet av en skive, mens i andre helikopteret kan kutte tann bakterie gjennom midten. Dette betyr at det kan være vanskelig å oppnå et stort antall av identiske skiver. For å bekjempe dette problemet, er det mulig å dele en bit ned på midten og bruke høyre og venstre side som eksperimentell og kontroll. For dette, men kjeven må være nøye plassert på hakke platen for å sikre at stykket skjæres symmetrisk. For noen eksperimenter er det en fordel å ha skiver som dissekere tannen, slik at interne strukturer, slik som emaljeknute, kan nås for avstamning merking ^fire. Tannen bakterie vises meget robust og slike halv tann bakterier er i stand til å utvikle seg godt i kultur, som tidligere vist i halvert molare tann bakterier ^12,13.

Som et alternativ til skjære kultur, kan tann bakterier blir dissekert ut av kjeven og kultivert i isolasjon ^14.. Dette eliminerer problemet med dårlig ernæring og oksygentilførsel i forbindelse med dyrking av store blokker av vev, og fører til god tannutvikling, men som en konsekvens tannen utvikles uten interaksjon med det omgivende vev. Når store mengder av de omkringliggende mesenchyme fjernes antall tann bakterier som danner kan endres, fremhever viktigheten av det omkringliggende mesenchyme for normal tannutvikling ^15. Slice kultur er derfor en god metode for å studere interaksjonene mellom vev, for eksempel hvor benet og tanninteragere i dannelsen av kjevebenet, eller hvordan den salivariere kjertler samhandle med tungen og munn epitel, noe som er tapt når disse vev dyrkes i isolasjon.

Dette papiret fremhever bruken av denne metode for dyrking av tann bakterier, men den samme fremgangsmåten er også utmerket for dyrkning utviklings submandibular og sublingual kjertler og følge utviklingen av strukturen, for eksempel Meckels brusk (figur 2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers