Summary
Здесь мы подробно метод культуры зубных микробов в нижней челюсти ломтиками использованием тканей вертолет. Этот метод позволяет уникальный доступ к зуба в процессе разработки, обеспечивая прекрасную возможность для манипуляций и рода трассировки, не доступен, используя более традиционные методы культивирования.
Abstract
Эксплантата культура позволяет манипулирование разработке органы в определенные моменты времени и, следовательно, является важным методом для биолога развития. Для многих органов трудно получить доступ к развивающимся ткани, чтобы позволить мониторинг во время экс естественных условиях культуры. Метод ломтик культура позволяет получить доступ к ткани, так что морфогенетические движения можно проследить и конкретные клеточные популяции могут быть направлены для манипуляции или клонов трассировки.
В этой статье мы опишем метод среза культуры, который был очень успешным для культуры зубных микробов в диапазоне видов. Метод обеспечивает удобный доступ к зубу микробов, которые развиваются с такой же скоростью, наблюдаемой в естественных условиях, в окружении других челюстных тканей. Это позволяет взаимодействия между тканей зуба и окружающих тканей, подлежащих мониторингу. Хотя эта статья концентрируется на микробов зубов, и тот же протокол может применяться следовать развитие рядадругих органов, таких как слюнные железы, хрящей Меккелев, носовых желез, языка, и ухо.
Introduction
Для ряда экспериментов важно, чтобы иметь возможность культуры ткани экс естественных условиях, чтобы следить за развитием. Культура разработке ткани обеспечивает доступ через определенные периоды развития и позволяет манипуляции генов путем добавления факторов в культуральной среде, или на загружалась бисера, и с помощью трансфекции и электропорации 1. Для многих экспериментов важно иметь возможность визуализировать ткани, как он растет, например, следовать судьбу меченых клеток клона как ткань подвергается морфогенез. Это может быть особенно проблематичным для тканей, которые развиваются в глубине эмбриона, которые не являются очевидными, когда блок ткани из эмбриона культивируют. Зубы являются хорошими примерами того, как они развиваются в рамках процесса носа нижней челюсти, верхней и фронтальной. Когда вся челюсть культивируют поверхностные структуры зуба можно просматривать, но изменения в морфологии могут быть проанализированы только после срезов фиксированной ткани
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создавать
- Увеличение резкости рассечение инструментов (используя точильный камень смазанный минеральным маслом) и стерилизовать перед использованием для органной культуре с использованием 70% этанола спрей и сухой тепловой стерилизации. Увеличение резкости рассечение иглы с помощью электролиза в 2 М гидроксида натрия с использованием питания 12 V.
- Подготовка культуральную среду, используемую для рассечения и культуры эмбриональных органов, состоящий из модифицированной Дульбекко среде F12 Расширенный Дульбекко (DMEM F12) с добавлением 1% глютамаксом и 1% пенициллина-стрептомицина.
2. Эмбрион Рассечение
- Cull приурочен повязана беременных женщин, используя график один метод, утвержденный Министерством внутренних дел или другого руководящего органа. Отсечь кожу вокруг нижней части живота, и разрезать живот с помощью ножниц. Найдите два рога матки, которые соединяют вместе на нижней линии.
- Рассеките из матки и место в трубе, наполненной среды на льду. Wheн на льду, ткани можно оставить на несколько часов.
- Удалить матку и места в чашке Петри в среде под микроскопом. По возможности вскрытия эмбрионов должна быть выполнена в вытяжном шкафу с ламинарным потоком для минимизации загрязнения.
- Рассеките из эмбрионов из матки и освободить их от внезародышевых тканей.
- Обезглавьте эмбрионов с использованием вольфрамовой иглы и передавать головы в свежем блюдо среды.
- Изолируйте челюсти от головы путем размещения иглы в полость рта и разрезать по направлению к задней части головы (фиг.1А и 1В). Изолированные челюсти может быть временно хранятся в среде на льду в ожидании измельчения.
- Для целых челюсти ломтиками стадии E11.5-E15.5 идеально подходят для зубного зачатка культуры. После E15.5 развития кость в челюсти слишком трудно для измельчения. Зубные ломтики еще может быть сделано, но кость (зубная и формирования альвеолярной кости) должны сначала быть удаленырассечение до измельчения 9. Осторожно снимите кости с использованием вольфрама иглы и пинцета.
3. Эмбрион нарезки
- Подготовка нижней челюсти срезы тканей с использованием стандартного таблица ткани вертолет (рис. 1в). Используйте свежие лезвие после примерно 200 челюстями, и убедитесь, что он находится на одном уровне с монтажной диска, когда он падает.
- Очистите монтажную диск и лезвие с 70% этанола перед использованием. Необходимо соблюдать осторожность при использовании аппарата, как лезвие очень острое.
- Установите прерыватель на режущей расстоянии между 200-400 мкм в зависимости от возраста образца, и в зависимости от того, требуется ли весь зародыш зуба. Установите лезвие силу на максимуме.
- Передача челюсть в пластиковых монтажных диска с помощью пипетки или щипцы. Организовать нижнюю челюсть на создании диска наверняка ориентация все еще ясно. Разработке язык может быть использован в качестве полезного ориентира для определения ориентации. Для моляры использования афrontal / поперечная ориентация (см. плоскость измельчения на рисунке 1b), в то время как для резцов использовать сагиттальный срез через челюсти, чтобы отразить различную ориентацию этих зубов, как они растут (см. плоскость измельчения на рисунке 2А).
- Удалить излишки среды со всего ткани с помощью фильтровальной бумаги для того, чтобы немного высохнуть нижнюю челюсть на монтажной диска.
- Сразу после сушки, поместите диск на круговой нержавеющей стали таблице вертолета. Включите машину, и нажать старт. В таблице автоматически перемещается слева направо и в то же время измельчения рычаг, несущий нож поднимается и упал со скоростью до 200 ударов / мин.
- Выключите машину после того, как ткань была полностью нарезанный. Убедитесь, что лезвие рычаг находится в поднятом положении и извлеките диск. Не ставьте пальцы под лопасти руку или оставить машину без присмотра при рубке.
- Возьмите монтажный диск и сразу добавить среднего то ломтики на диске для того, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание. Осторожно сместить нарезанный ткани из нижней части диска с помощью вольфрамовой иглы, а затем пипеткой в небольшую чашку Петри среды (рис. 2а).
- Отделите ломтики с помощью иглы, а затем выберите ломтики тканей, содержащие ткани интереса под стереомикроскопом (Цифры 1D, 1E и 2В). Поместите выбранные ломтики свежими чашек для культивирования со средой.
4. Кусочек Культура
- Подготовка центральные-хорошо органной культуре блюда, готовые к культуре путем добавления приблизительно 2 мл автоклавного воды к наружной скважины, чтобы предотвратить обезвоживание, и путем установки металлическую сетку через центр чашки (фиг.3А и 3В).
- Подготовка металлических сеток за счет сокращения полосы примерно в 4 см х 1,5 см из листов нержавеющей стальной сетки. Используйте дырокол, чтобы сделать отверстие в центре и согнитестороны по созданию шахматном конец. Сетка должна соответствовать плоским через центральную скважину, лежащих параллельно нижней части блюда (фиг.3А и 3В). Автоклав решетки стерилизовать перед использованием.
- Отрежьте кусок прозрачного полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны (размер пор 0,4 мкм) достаточно большой, чтобы закрыть отверстие в сетке. Поместите сократить мембраны в блюдо с выбранным среза.
- Поместите кусочек сверху мембраны, а затем осторожно поднимите мембрану из среды, с ломтиком уплощенной в центре.
- Поместите фильтр на решетке над круглым отверстием в центре, а также добавить около 1 мл культуральной среды в скважину, до уровня мембраны.
- Для манипуляции добавить белки или низкомолекулярные ингибиторы к среде (например, 8).
- Сфотографируйте кусочек для записи морфологии в день 0 культуры.
- Поместите посуду в увлажненной атмосфере 5% CO
- Сфотографируйте культуры при интервалов в среднем 7 дней. Изменение культуральной среде каждый 48-72 час. Для просмотра фотографии ломтики с источником света снизу (фиг. 2C-E).
5. Lineage Трассировка
Если линия трассировки требуется, липофильные красители, такие как DiI или DIO может быть введен в зубного зачатка до шага 4, ломтик культуры.
- Потяните стеклянный капилляр иглы с помощью иглы съемник.
- Перерыв кончик иглы с помощью щипцов и поместите наконечник вниз в раствор красителя. Оставьте в течение нескольких минут, пока краситель заполняет наконечник под действием капиллярных сил.
- Поместите заполненную иглу в держатель и закрепите с помощью трубки с аспиратором инжектора или рта.
- Расположите кончик иглы в культуральной среде касаясь площадь среза должное быть помечены. Применение давление воздуха для вытеснения небольшое количество красителя из игольного ANд на ткани.
- Удалить иглу и проверьте маркировку под флуоресценции.
- Успешно меченные срезы могут быть переданы на фильтрах и культивировали, как описано в пункте 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы следовать за движением первого моляра зубной фолликул, 250 мкм фронтальные срезы были взяты через нижнюю челюсть использованием способа, описанного выше. Зубной фолликул слой мезенхимы, которая окружает внешнюю эмаль эпителий (OEE) развивающегося зуба, а ранее было показано, принимать участие в формировании ткани периодонта 6. Мандибулы рассекали на E14.5, стадии крышкой развития зуба. В срезе контур зубного эпителия было ясно, и конденсации стоматологическая мезенхимы могут быть определены как более темное кольцо вокруг зуба эпителий (рис. 4А). DiI вводили в мезенхиме рядом с наружной эмали эпителия зубной ломтик на язычной стороны (рис. 4А). После маркировки ломтики культивировали в течение 4 дней и сфотографировали с интервалами (фиг. 4В и 4С). В естественных зубные зародыши достигла быстадия колокол на E18.5, и особым колокол этап форма наблюдалась в срезах, что указывает на аналогичную прогрессирование за этот период времени. Пятно DiI был замечен расширить в группу клеток, проходящих по внешней зубной эпителия как зуб вырос (рис. 4В и 4С).
Рисунок 1. Формирование живых ломтиками. (А) E14.5 эмбрионов. Пунктирные линии самолеты сократить с рассекает иглы, начиная с нижнего среза для обезглавливания. (В) Dissected нижнюю челюсть. Язык обращены вниз. Плоскость сечения для ткани вертолета показана пунктиром. (C) Tissue прерыватель, показывающий лезвие руку (BA) и белого монтажное диск (MD) с подготовленных образцов (стрелка). (D) представитель ломтик через моляраобласть. Стрелки указывают на молярных микробов зубов. (Е) вид Высокая мощность молярного среза. Зародыш зуб эпителий изложил с черными пятнами. Изображения заточены с помощью Photoshop. Т = Язык, DB = зубной кости кости, хрящи MC = Меккеля. Бар Масштаб в = 3 мм. Бар Масштаб в B & D = 1 мм. Бар Масштаб в Е = 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Резец и железа культуры. (А) E12.5 Нижняя челюсть, которая была нарезанный сагиттально. Развивающиеся резцы (изложенные белые пятна с звездочкой) и подчелюстные железы (обведены черными пятнами и стрелками) можно только оформляется. (Б) То же челюсть показывая центральные 4 ломтика отделяется. Развивающийся подчелюстной железы срассматриваться как бутон окруженный уплотненной мезенхимы (наконечники стрел) в еще двух боковых секций (верхней части изображения). Конденсации мезенхимы вокруг железы выделены красным цветом. Резцы находятся на стадии эпителиальной сгущения (Asterix) в двух центральных срезах (в нижней части изображения). (С) Сагиттальный ломтик через резца на E14.0 в день 0. (D) То же ломтик 1 день позже. (E) ломтик же после 3 дней в культуре. (CE) стрелка указывает на резца и формирование губной шейки петлю. Arrowhead указывает на разработке подчелюстной железы. В культуре зародыш зуба проходит в обратном направлении, как шейные петли расти, в то время как слюнные железы продолжает подвергаться морфогенеза ветвления и формирования просвета. Изображения заточены с помощью Photoshop. Т = Язык, хрящ MC = Меккеля. Бар Масштаб ля & B = 1 мм. Бар Масштаб в C, D, E = 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 3. Метод Культура. (А) Искусственный ломтик. Культура сидит на прозрачном фильтра взвешенных по среде с помощью металлической сетки. Отверстие в сетке позволяет ломтик быть визуализированы с учетом снизу. (B) Схема способа культивирования.
Рисунок 4. DiI маркировка стоматологической фолликула. (AC) Merged светлых и темных местах изображения, показывающие развития молярное зародыш зуба и расположение Dii этикетке клонов. (A) День 0. Зародыш зуба (стрелка) находится на стадии крышкой. DiI этикетки клетки зубного фолликула на язычной стороны зуба. (В (C) День 4. Зародыш зуб достиг стадии колокола и DiI меченые клетки видны разложить по дуге вокруг развивающегося внешней эмали эпителия. Изображения были заточены в Photoshop после слияния слоев с использованием режима экрана. Эпителий зуба изложил с черными пятнами. DP = стоматологическая сосочек лежал во внутреннем эмали эпителия. DF = стоматологическая фолликул, который проходит вокруг наружной эмали эпителия. МС = хряща Меккелев. Бар Масштаб в А, В, С = 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод культуры зуба имеет то преимущество, что доступ к зубного зачатка отлично, позволяя точное происхождение отслеживание и размещение бисера в эпителии или мезенхимы. Определенные регионы развивающегося зубного зачатка, следовательно, может быть конкретно направлены. Во культуры изменение морфологии зубного зачатка может следовать, и эффект манипуляций быстро оценить.
Способ, однако, подходит только для маленьких микробов зуба до значительного образования твердых тканей, таких как дентин, эмаль, так как они не могут быть точно расколотый. Для челюстями после E15.5 надо удалить кости, прежде чем рубить. Это имеет тот недостаток, что потенциально может повредить зародыш зуба, который тесно связан с костью от E16.5. Мы успешно нарезанный расчлененные микробы зубов до послеродового день 4, после чего зуб становится слишком трудно для вертолета, чтобы сократить из-за отложения эмали. Ломтик меню хорошо работает на зубных микробов из E13.5, т.е. стадии почки 1,6. До этого момента времени, когда зуб находится в стадии эпителиальной сгущения, микробы зубные действительно развиваются, но вероятность успеха снижается и морфология могут быть затронуты в долгосрочной перспективе.
Одним из основных недостатков с помощью метода является то, что измельчение происходит случайным образом через зуба. В некоторых ломтиками целый зародыш зуба будет найден в пределах среза, а в других вертолет может сократить зародыш зуба через середину. Это означает, что может быть трудно получить большое количество идентичных слоев. Для борьбы с этой проблемой, можно разделить кусок пополам и использовать правую и левую стороны, как экспериментальный и контроля. Для этого, однако, нижней челюсти должны быть тщательно размещены на разделочной диска, чтобы обеспечить часть разрезают симметрично. Для некоторых экспериментов это преимущество, чтобы иметь срезы, препарировать зуб так, что внутренние структуры, такие как эмалиузел, можно получить для клонов маркировки 4. Зародыш зуба появляется очень надежные и такие половиной микробы зубные способны хорошо развиваться в культуре, как было показано ранее в половинчатых молярных микробов зубных 12,13.
В качестве альтернативы к культуре Кусочек, зародыши зубов можно разрезать из нижней челюсти и культивируют в изоляции 14. Это снимает проблему плохого питания и оксигенации, связанной с культивированием большие блоки ткани и приводит к хорошему развития зубов, но как следствие зуб развивается без взаимодействия с окружающей тканью. При больших объемах окружающих мезенхимы удаляются количество зубных микробов, которые формируют могут быть изменены, подчеркнув важность окружающей мезенхимы для нормального развития зубов 15. Кусочек культура Поэтому хорошим методом для изучения взаимодействий тканей, например, как кость и зуб взаимодействовать при формировании альвеолярного отростка, или как Саливарьироваться железы взаимодействовать с языком и устной эпителия, то, что теряется, когда эти ткани культивируют в изоляции.
В настоящем документе освещаются использование этого метода для культивирования микробов зубов, но тот же метод также отлично подходит для культивирования развивающимся подчелюстные и подъязычные железы и следит за развитием структуры, такие как хрящи Меккелев (рис. 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Сара А. Alfaqeeh финансируется Kind Сауда университета Колледж стоматологии, Министерства высшего образования, Королевства Саудовская Аравия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
