Summary
We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.
Abstract
We hebben een snelle microfluïdische methode ontwikkeld voor het testen van de gevoeligheid van antibiotica in een stressgebaseerde omgeving. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën overleven deze stressvolle omstandigheden echter. De hypothese achter deze methode is nieuw: stressactivatie van biochemische routes, die doelwit zijn van antibiotica, kan het testen van de gevoeligheid van antibiotica versnellen. In vergelijking met standaard antibioticagevoeligheidstestmethoden wordt de snelheidsbeperkende stap - bacteriële groei - weggelaten tijdens het aanbrengen van antibiotica. De technische implementatie van de methode is in een combinatie van standaardtechnieken en innovatieve benaderingen. De standaardonderdelen van de methode omvatten bacteriële kweekprotocollen, het definiëren van microfluïdische kanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS), cel levensvatbaarheidsmonitoring met fluorescentie en batchbeeldverwerking voor het tellen van bacteriën. Innovatieve onderdelen van de methode zijn in het gebruik van kweekmediastroom voor mechanische stresstoepassing, gebruik van enzymen om de bacteriën te beschadigen maar niet te doden, en het gebruik van microarray substraten voor bacteriële aanhechting. Het ontwikkelde platform kan worden gebruikt bij de ontwikkeling en het testen van antibiotica en niet-antibiotische geneesmiddelen. In vergelijking met de standaard bacteriële suspensie-experimenten kan het effect van het medicijn herhaaldelijk worden in- en uitgeschakeld gedurende gecontroleerde periodes. Repetitieve observatie van dezelfde bacteriepopulatie is mogelijk in de loop van hetzelfde experiment.
Introduction
De opkomst van bacteriële resistentie versterkt de behoefte aan snelle op fenotype gebaseerde antibioticagevoeligheidstests om onze geneesmiddelen in laatste instantie te beschermen. Standaard gevoeligheidstests zijn gebaseerd op bacteriële groeiremming in aanwezigheid van antibiotica die meerdere (8-24) uur in beslag nemen. We hebben een nieuwe antibioticagevoeligheidstest ontwikkeld op een microfluïdisch platform dat afhankelijk is van de stressactivering van biosyntheseroutes om de werking van antibiotica te versnellen.
Antibiotica gevoeligheidstests op microfluïdische schaal hebben het voordeel van effectief monstergebruik, omdat ze kleine aantallen bacteriën vereisen. Bovendien kunnen microfluïdische apparaten worden gemulderd om meerdere monsters onder meerdere omstandigheden te testen1,2. Onlangs zijn een aantal microfluïdische methoden voor antibioticagevoeligheidstests gemeld3-9. In deze methoden worden bacteriën gekweekt in nano- en picoliterdruppels3,7, in het volledige volume van het microfluïdische kanaal4-6,8, of als enkele bacteriën elektrisch gelokaliseerd op het onderste oppervlak van kanaal9. Hoewel deze tests worden uitgevoerd in microfluïdische kanalen, monitoren ze allemaal de microbiële groei in de aan- en afwezigheid van antibiotica die vergelijkbaar zijn met traditionele methoden. Groeimetingen worden uitgevoerd via optische dichtheid, pH-gevoelige kleurstoffen of heldere veld-/fasecontrast- of fluorescentiebeelden. Hoewel sommige van deze tests sneller zijn dan traditionele methoden, detecteren ze elk passief antibioticaresistentie. Met andere woorden, deze methoden vereisen nog steeds dat de gebruiker wacht op bacteriegroei als de laatste uitlezing.
Daarentegen hebben we een methode ontwikkeld die een combinatie van afschuiving en enzymatische stress gebruikt om antibioticagevoelige biochemische routes te activeren10. Het uitdagen van de gestreste bacteriën met die antibiotica creëert een snellere gevoeligheidstest. Bacteriën die resistent zijn tegen het antibioticum zijn bestand tegen de stressvolle omstandigheden. Gevoelige bacteriën daarentegen worden snel gedood door de gecombineerde spanningen. Het percentage celdood na een uur, gemeten door microscopie met behulp van een fluorescerende dode celvlek, definieert het fenotype van de bacterie (resistent versus vatbaar).
Voor een succesvolle implementatie van onze methode moeten bacteriën worden geïmmobiliseerd op het onderste oppervlak van het microfluïdische kanaal. Op deze manier kunnen bacteriën worden blootgesteld aan verschillende spanningen en tegelijkertijd onder een microscoop in één vlak worden afgebeeld. Een gecoate microscoopglasschuif wordt gebruikt voor bacterieimmobilisatie. De dia is door de fabrikant voorgecoat met epoxidegroepen voor niet-specifieke eiwitbinding. De aspecifieke binding van deze epoxiden aan bacteriële oppervlakte-eiwitten hecht de bacteriën covalent aan het diaoppervlak.
Stammen worden getest onder identieke omstandigheden (shear + enzymatische stress) bij afwezigheid (controle) en aanwezigheid (experiment) van antibiotica. Fasecontrast en fluorescentiemicroscoopfoto's van elk kanaal worden gedurende een uur elke twee minuten automatisch gemaakt. Resistentiebenamingen worden vervolgens gemaakt door het percentage dode bacteriën in het experimentele kanaal te vergelijken met die in het controlekanaal. Na een uur wordt een monster met een celdoodpercentage van meer dan 1% als vatbaar beschouwd, terwijl minder dan 0,5% sterfte indicatief is voor resistentie. Percentages die tussen deze twee afsnijdingen vallen, worden als onbepaald beschouwd en het monster moet opnieuw worden getest.
Microfluïdische kanalen worden gedefinieerd in PDMS, een materiaal bij uitstek voor microfluïdische apparaten11. PDMS is optisch transparant in een breed scala aan golflengten, biocompatibel, inert, doorlaatbaar voor gassen en heeft een lage permeabiliteit voor vloeistoffen; daarom is het zeer geschikt voor deze experimenten.
Mechanische/schuifspanning wordt gecreëerd door de stroom van kamertemperatuurmedia over de geïmmobiliseerde bacteriën. (Opmerking: Het opwarmen van de media tot 37 °C heeft geen significant effect op de uitkomst van de test.) Geautomatiseerde spuitpompen forceren media (met dode celvlek +/- antibioticum, evenals optionele enzymatische stressoren) door de microfluïdische kanalen (200 μm x 400 μm) met een debiet van 1 ml/min om 6,25 kPa afschuifkracht of een afschuifsnelheid van 6.000 sec-1te geven. Dit percentage is gelijk aan of hoger dan eerder bestudeerde schuifspanningen op stafylokokken.
Het enzym, lysostaphin, werd geselecteerd voor voorbereidende experimenten omdat het directe schade aan de Staphylococcus celwand veroorzaakt. De concentratie lysostaphin (0,7 ng/ml) was voldoende om bacteriële celwandschade te veroorzaken, maar niet voldoende om bacteriële celdood zonder antibioticum te veroorzaken in het tijdsbestek van het experiment. Lysostaphin is niet nodig voor de juiste aanduiding van bacteriële gevoeligheid, maar het verhoogt wel het resultaat, wat leidt tot verhoogde celdood bij gevoelige stammen. Schuifspanning daarentegen is van cruciaal belang voor de testfunctie. Wanneer methicilline-gevoelige Staphylococcus aureus stammen worden behandeld met lysostaphin en oxacilline bij afwezigheid van stroom, wordt er in de loop van het experiment geen celdood geregistreerd.
De levensvatbaarheid van de cel wordt bewaakt met een fluorescerende dode celvlek12. De selectie van de kleurstof was gebaseerd op zijn vermogen om selectief alleen beschadigde cellen te bevlekken, de niet-toxiciteit voor levende cellen en de lage fluorescentie op de achtergrond, waardoor de directe toevoeging aan de celmedia zonder extra stappen mogelijk was. De selectie van een fluorescerende kleurstofconcentratie van 0,25 μM was om aanvaardbare signaalniveaus te bereiken tijdens een blootstellingstijd van 1,6 sec aan fluorescentie-excitatielicht.
De bèta-lactam, oxacilline, werd gebruikt in onze voorstudies. Methicilline-resistente S. aureus (MRSA) soorten zijn resistent tegen oxacilline en zullen in het tijdsbestek van het experiment geen merkbare celdood vertonen. De concentratie van 50 μg/ml werd bepaald in de voorstudies. Lagere concentraties antibiotica gaven minder scheiding tussen resistente en gevoelige stammen, terwijl hogere concentraties geen merkbaar verschil in experimentele resultaten veroorzaakten.
We hebben eerder gerapporteerd over de succesvolle ontwikkeling van een test die mechanische en enzymatische spanningen combineert die de bacteriële celwand13 rechtstreeks beïnvloeden met een antibioticum dat de biosynthese van de celwand remt14,15. Deze proof-of-principle experimenten werden uitgevoerd op een panel van MRSA en methicilline-gevoelige S. aureus (MSSA). Met de selectie van de juiste experimentele parameters moet onze methode echter van toepassing zijn op meerdere soorten bacteriën en meerdere klassen antibiotica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maak de PDMS-laag (figuur 1)
- Meng PDMS en curing agent krachtig in een 10:1 verhouding. Om bellen te verwijderen, ontgast u het viskeuze mengsel gedurende 1 uur in een vacuümkamer bij kamertemperatuur.
- Giet het PDMS op een schaal langzaam over de aluminium mal. Giet vanuit het midden en houd de mal waterpas. Zorg ervoor dat u de pinnen onbedekt laat. Stop met gieten zodra het streefgewicht is bereikt.
Onze mal vereist 4 g PDMS en 0,4 g uithardend reagens. - Breng de mal waterpas in een oven en hard 's nachts uit bij 37 °C.
Alternatieve uithardingstijden zijn 2 uur bij 60 °C of 1 uur bij 90 °C. - Ontleed de uitgeharde PDMS-laag langs de rand van de mal en pel deze voorzichtig van het matrijsoppervlak af met een tang. Reinig het matrijsoppervlak met 70% ethanol en een Q-tip.
2. Monteer de stroomcel volgens figuur 2
Standaardassemblage van PDMS met glazen dia's gebeurt door middel van zuurstofplasmabehandeling van beide oppervlakken, wat zorgt voor lekvrije hechting tussen de PDMS- en microscoopglasschuif. In het gepresenteerde protocol zou de plasmabehandeling de chemische coating op de glazen dia vernietigen. Daarom is de dia drukdicht in plaats van plasmabehandeld.
- Plaats het glazen raam in de zak van de stromingscel.
- Leg een gecoate glazen schuif over het glazen raam in de zak van de stroomcel met de actieve kant naar boven en plaats de PDMS-laag met kanalen naar beneden erop. Plaats de PDMS-schuif zo dat kanaalingangen uitlijnen met de doorvoergaten in de metalen plaat. Duw de lucht voorzichtig tussen de lagen uit.
- Draai de PDMS/glazen schuifeenheid zo dat het PDMS naar het glasraam kijkt. Overlap de PDMS-kanaalingangen met de doorvoergaten in de metalen plaat.
- Plaats de drukplaat erop en draai de schroeven vast.
- Plaats de geassembleerde stroomcel onder de microscoop. Stel de microscoopvergroting in op 60X en lijn de kanaalposities vooraf uit.
3. Bereid logfasebacteriën voor
- Dag voor het experiment: Ent 50 ml Mueller Hinton bouillon met 2% NaCl (MH2) met een bacteriekolonie. Schud 's nachts bij 250 tpm bij 37 °C.
Een of twee bacteriestammen kunnen in één experiment worden bestudeerd voor de beschreven opstelling. - Voorafgaand aan het experiment: Meng 50 μl overnight bacteriekweek in 50 ml MH2 media. Schud bij 250 tpm gedurende 3 uur bij 37 °C om ervoor te zorgen dat de bacteriën zich in de logfase bevinden.
4. Verwarm de componenten van de experimentele oplossing ten minste 10 minuten voordat ze nodig zijn
- Ontdooi de fluorescerende kleurstof (5 mM bouillon) en lysostaphin (10 μg/ml bouillon) bij kamertemperatuur.
- Verwarm het oxacillinepoeder op kamertemperatuur.
5. Bereid de bacteriële suspensie voor en laad deze
- Na het einde van 3 uur subcultuur: Neem 10 ml bacteriekweek en centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.650 x g.
- Verwijder het supernatant en de resuspend bacteriën in 1 ml verse MH2 media.
- Bevestig een korte lengte slang aan een Luer-slotspuit van 1 ml. Spoel de spuitslang door met 1 ml media. Laat een beetje media in de slang om luchtbellen te voorkomen bij het trekken van de bacteriële suspensie.
- Plaats 0,7 ml bacteriën type 1 in de spuit. Vul twee kanalen van de stroomcel met bacteriën type 1. Let erop dat de vloeistof na ca. 150 μl.
De transparantie van het kanaal verandert omdat het gevuld is met bacteriën. - Als u experimenteert met meerdere bacterietypen, herhaalt u de laadprocedure voor bacteriën type 2 in de twee resterende kanalen van de stroomcel.
- Plaats de stroomcel gedurende 45 minuten in de incubator op 37 °C om bacteriële bezinking en bevestiging aan het schuifoppervlak mogelijk te maken.
6. Bereid de experimentele oplossingen voor en laad ze
- Bereid 140 μl fluorescerende verfoplossing van 0,5 mM door 14 μl fluorescerende kleurstoffen (5 mM) en 126 μl MH2-media te mengen.
- Verdun 10 mg oxacilline in 40 ml MH2-media om een eindconcentratie van 250 μg/ml oxacilline te verkrijgen.
- Bereid 130 ml regeloplossing met eindconcentraties van 0,25 μM fluorescerende kleurstof en 0,7 ng/ml lysostaphin. Meng hiervoor 65 μl fluorescerende kleurstof (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinbouillon (10 μg/ml) en 130 ml MH2-media.
- Bereid 130 ml antibioticaoplossing met eindconcentraties van 0,25 μM fluorescerende kleurstof, 0,7 ng/ml lysostaphin en 50 μg/ml oxacilline. Meng hiervoor 65 μl fluorescerende kleurstof (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinbouillon (10 μg/ml), 26 ml oxacilline (250 μg/ml) en 104 ml MH2-media.
- Vul twee spuiten van 60 ml met regeloplossing en twee spuiten van 60 ml met een antibioticumoplossing. Houd oplossingen gewikkeld in aluminiumfolie om lichtgeïnduceerde afbraak van de reagentia te voorkomen.
Vul de spuiten te vol om rekening te houden met verlies als gevolg van het doorspoelen van de slang. - Verwijder luchtbellen uit de spuiten door te flikkeren. Bevestig en vul de ingangsslang aan de punt met de experimentele oplossing.
- Monteer spuiten op de pomp. Plaats de spuit eerst met het kleinste volume en vergrendel vervolgens de zuigerpositie. Plaats de rest van de spuiten op de pomp en knijp indien nodig in hun zuigers.
- Stel de pompsnelheid in op 1 ml/min en het pompvolume op 60 ml. Doe een flush met de pomp totdat een constante stroom vloeistof wordt gezien van alle spuiten.
7. Stel de stroomcel onder de microscoop in
- Verwijder de stroomcel uit de centrifuge en monteer deze op het microscoopstadium (afbeelding 3).
- Sluit de ingangs-/uitgangsslang aan op elk van de stroomcelkanalen (één ingang/één uitgang per kanaal).
Het verzamelen van output in vier verschillende containers maakt het mogelijk om de uitgangsvolumes van afzonderlijke kanalen te meten.
8. Voer het experiment van 60 minuten uit
- Controleer de vooraf uitgelijnde posities vanaf stap 2.5. Als het gezichtsveld van de microscoop niet gecentreerd is op het kanaal en/of niet scherp is, past u de instellingen aan en slaat u de nieuwe posities op.
Nauwkeurige scherpstelling is mogelijk niet mogelijk voordat de stroom begint vanwege de hoge dichtheid van geladen bacteriën. - Stel de acquisitietijd van het fasecontrast in op 10 msec en de fluorescentieverwervingstijd op 1.600 msec.
- Verkrijg fasecontrast- en fluorescentiebeelden voor elke positie voordat u de stroom start.
Dit geeft een kwalitatieve schatting van de geladen bacteriedichtheid. - Start de vloeistofstroom en controleer onmiddellijk of de microscoop op de bodem van de kanalen is gericht.
- Maak fasecontrast- en fluorescentiebeelden van de doelgebieden binnen de eerste minuut van de stroom.
- Verkrijg afbeeldingen elke 2 minuten nadat de eerste set afbeeldingen is opgetreden totdat 60 minuten stroom heeft plaatsgevonden. Heroriënteer indien nodig.
9. Desinfecteer de flowcel
- Maak een 10% bleekoplossing in een bekerglas (100 ml). Vul 4 x 20 ml spuiten met 10 ml van het mengsel. Debubble de spuiten en bevestig ze aan de stroomcel.
Het duurt ~ 1-2 minuten voordat de kanalen vrij zijn van bacteriën. - Stel de pompsnelheid in op 1 ml/min en het pompvolume op 3 ml. Ren 3 minuten.
- Vul 4 x 60 ml spuiten met 60 ml DI water. Debubble de spuiten en bevestig ze aan de stroomcel.
- Stel de pompsnelheid in op 1 ml/min en het pompvolume op 30 ml. Ren 30 minuten.
- Controleer de kanaalreiniging onder de microscoop.
- Demonteer de stroomcel. Gooi de gebruikte epoxyschuif weg. Week de stromingscelcomponenten gedurende 20 minuten in DI-water. Aan de lucht drogen.
10. Analyseer afbeeldingen en genereer gegevens
- Tel het aantal bacteriën in elke afbeelding.
De open access software, CellProfiler wordt gebruikt om batch-beeldverwerking uit te voeren16. Een overzicht op hoog niveau van de CellProfiler-routine wordt samengevat in tabel 1. Het aantal bacteriën in het fasecontrastbeeld (Np) geeft het totale aantal bacteriën. Het aantal bacteriën dat zichtbaar is in het fluorescentiebeeld (Nf) geeft het aantal dode bacteriën aan. - Bereken het genormaliseerde bacteriële celdoodpercentage als functie van de tijd.
- Importeer Nf en Np voor individuele afbeeldingen in de data-analysesoftware.
- Bereken de fractie van dode bacteriën in elk kanaal op een specifiek tijdstip gegeven door de fractie (Nf / Np) op t = T.
- Trek de fractie dode bacteriën af die aan het begin van het experiment aanwezig zijn (t = 1 min) voor zowel de controle- als de experimentele kanalen.
- Trek de fractie dode bacteriën in het controlekanaal af van die in het experimentele kanaal op elk moment met de volgende vergelijking:
- Grafiek DPnorm vs. t voor de loop van het experiment.
Merk op dat een monster met een celdoodpercentage van meer dan 1% vatbaar wordt geacht, terwijl minder dan 0,5% sterfte indicatief is voor resistentie. Percentages die tussen deze twee afsnijdingen vallen, worden als onbepaald beschouwd en het monster moet opnieuw worden getest. - Gebruik een spreadsheet om resultaten van verschillende experimenten samen te vatten en te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gegevens in figuur 4 tonen de respons van een gevoelige Staphylococcus aureus stam in de loop van de tijd in een antibioticumbevattend microfluïdisch kanaal. Fasecontrastbeelden die na 1 minuut en aan het einde van het 1 uur durende experiment zijn verkregen, zijn weergegeven in de figuren 4A en B. De geanalyseerde 1 uur gegevens zijn weergegeven in figuur 4C met de bacteriën gemarkeerd in rood (5.828 totaal). Overeenkomstige fluorescentiebeelden worden weergegeven in de figuren 4D en E. De geanalyseerde 1 uur gegevens zijn weergegeven in figuur 4F met de fluorescerende bacteriën gemarkeerd in rood (174 doden).
Deze reeks afbeeldingen illustreert verschillende punten. Het belangrijkste is dat aan het einde van het experiment een significante toename van het aantal fluorescerende bacteriën wordt waargenomen (vergelijk het aantal heldere fluorescerende vlekken op 1 min en 60 min in de figuren 4D en E), wat wijst op celdood in het kanaal. Deze resultaten zijn indicatief voor een gevoelige stam.
Een ander belangrijk punt om op te merken is de noodzaak van de normalisaties die in de bovenstaande vergelijking worden gebruikt. Als gevolg van de stochastische nonuniformiteit van individuele epoxyschuifcoatings kan er tijdens het experiment bacterieel celverlies zijn onder aanhoudende afschuifdruk (vergelijk figuren 4A en B). Om rekening te houden met deze variatie, wordt elk fluorescentiebeeld van een dode celpopulatie genormaliseerd met het coacquired fasecontrastbeeld dat de totale celpopulatie op hetzelfde moment (binnen 1 seconde) geeft.
Nog een normalisatie wordt gedaan door de genormaliseerde fluorescentie aan het begin van het experiment (t = 1 min) af te trekken van alle andere tijdspunten (t = T). De dode celfluorescentie na 1 min komt overeen met celdood vóór het begin van het experiment. Hoge fluorescentie waargenomen aan het begin van het experiment voor MSSA of MRSA duidt meestal op een slechte staat van de bacteriële cultuur. In zeldzame gevallen vertegenwoordigt het verontreiniging van de PDMS-dia.
De insets in de onderste hoeken van de afbeeldingen zijn vergrote versies van de boxed afbeeldingsgebieden van zowel de onbewerkte als de geanalyseerde afbeeldingen. Deze vergrotingen laten zien dat ons telalgoritme succesvoller is in het nauwkeurig tellen van individuele bacteriën in fluorescentiebeelden dan in dichtbevolkte fasecontrastafbeeldingen.
De dode celvlek geeft een hoog fluorescentiecontrast voor individuele dode bacteriën. Aangezien het aantal fluorescerende bacteriën zelden meer dan 5% van het totale aantal bedraagt, is elke bacterie erg helder in vergelijking met de achtergrond. Om deze reden kunnen de fluorescerende bacteriën gemakkelijk met een hoge mate van nauwkeurigheid worden geteld. Aan de andere kant zijn bacteriën dicht op het fasecontrastbeeld verpakt. Bovendien is het fasecontrast binnen een bacterie niet altijd uniform. Deze twee factoren vormen een uitdaging voor een telalgoritme omdat het afhankelijk is van drempels van verschillende gebieden op basis van hun geschatte groottebereiken en intensiteiten.
Daarom is het, om experimentele resultaten te vergelijken, noodzakelijk om hetzelfde telalgoritme te gebruiken met dezelfde parameters in verschillende experimenten. Het is vermeldensgewijze dat er vanwege het lage aantal fluorescentietellingen een hogere gevoeligheid is voor fluorescentiefouten; daarom is het belangrijker om de fluorescentiebeelden nauwkeurig te tellen dan de fasecontrastbeelden.
Ten slotte worden MSSA- en MRSA-gegevens genormaliseerd volgens de bovenstaande vergelijking weergegeven in figuur 5 voor drie verschillende experimenten. Zoals verwacht voor resistente stammen, is de genormaliseerde celdood laag in omvang (<0,5%) en verandert niet in de loop van het experiment. Gevoelige stammen vertonen een gestage toename van celdood en een hogere waarde aan het einde van het experiment (>1%). Het begin van celdood voor gevoelige stammen varieert enigszins tussen experimenten, maar blijft meestal tussen 10-30 min.
Figuur 1. Een foto met de geometrieën en afmetingen van de microfluïdische kanalen in de PDMS-laag. De smalle delen van de kanalen zijn 3,7 cm lang, 200 μm hoog en 400 μm breed.
Figuur 2. Een CAD-model dat elk van de stroomcelcomponenten en hun relatieve posities illustreert.
Figuur 3. Een foto die de experimentele opstelling van de microscoop en de spuitpomp toont.
Figuur 4. Fasecontrast (A–C) en fluorescentie (D–F) beelden voor een representatieve MSSA stam binnen een antibioticum-bevattend kanaal. Insets tonen vergrote afbeeldingen van de boxed gebieden. Microscoopbeelden werden verkregen bij 60X vergroting. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Een grafiek met genormaliseerde celdoodpercentages versus tijd. Elk van de MSSA- en MRSA-stammen werd getest in drie afzonderlijke experimenten.
Tabel 1. CellProfiler routinecomponenten voor het automatisch tellen van bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol werd gevalideerd en geoptimaliseerd in een reeks experimenten met methicillinegevoelige en methicillineresistente Staphylococcus aureus stammen10. Daarom moet dit protocol zonder wijziging rechtstreeks van toepassing zijn op andere stammen van S. aureus en andere antibiotica met werkingsmechanismen die de biosynthese van de bacteriële celwand beïnvloeden. Andere bacterietypen dan S. aureus kunnen variatie in de stressparameters vereisen: oplosbare (enzymatische) en mechanische spanningen. Als oplosbare stressoren gewenst zijn bij het testen van andere bacteriële soorten dan Staphylococcus, is een ander stressmiddel nodig, omdat lysostaphin een stafylokokkenis -specifiek enzym.
De hoeveelheid afschuifspanning is evenredig met het debiet van de vloeistof en omgekeerd evenredig met de grootte van het kanaal, daarom kan het in principe binnen een groot aantal waarden worden gevarieerd. De bereikte waarden van spanning worden beperkt door de volgende experimentele factoren: het vermogen van het immobilisatiesubstraat om bacteriën op hun plaats te houden onder hogere debieten, de microfluïdische assemblage die hoge druk ondersteunt zonder te lekken, de vloeistofstroomweerstand in het systeem, die het debiet onstabiel kan maken of zelfs kan stoppen bij lagere debieten. De sterkte van de binding was voldoende voor de S. aureus-experimenten, maar een toename van het debiet of de verandering van bacteriële soorten kan een ander coatingtype vereisen. De epoxy-gecoate dia's worden conventioneel gebruikt voor eiwitmicroarray-analyse en zijn niet specifiek ontworpen om grote cellulaire objecten vast te houden. Omdat de formulering en dichtheid van de coating eigendom is, is de ontwikkeling van alternatieve formuleringen met de gecontroleerde depositie van de oppervlaktecoating zeer wenselijk.
We hebben onlangs ontdekt dat de hoeveelheid tijd die nodig is voor bacteriële cultivering en gehechtheid sterk kan worden verminderd. Kolonies kunnen binnen drie uur worden gekweekt om de fase rechtstreeks van een agarplaat in een klein volume media te loggen, waardoor de nachtelijke cultuurstap wordt geëlimineerd. Bovendien kan de hechting worden versneld door de bacteriën gedurende één minuut in de stroomcel te centrifugeren, waardoor de bezinktijd van 45 minuten wordt verwijderd. Experimenten in ons laboratorium worden momenteel uitgevoerd met dit verkorte protocol.
Hoewel het protocol speciaal is ontworpen voor antibiotica die gericht zijn op bacteriële celwandbiosynthese, geven recente studies aan dat antibiotica met verschillende primaire doelen in bacteriële cellen dezelfde downstream bacteriële responsroutes activeren17,18. Daarom kan onze methode toepasbaar zijn voor de snelle identificatie van gevoeligheid voor antibiotica die zich richten op biosyntheseroutes die geen verband houden met celwandbiosynthese, en initiële studies in ons laboratorium geven geloofwaardigheid aan deze hypothese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De microfluïdische methode is patent aangevraagd: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, uitvinders; Methode en apparaat voor snelle detectie van bacteriële antibioticaresistentie / gevoeligheid patent PCT / US10 /33523.
Acknowledgments
We danken de ingenieurs en studenten van het Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Voor het helpen bij het ontwerp, de bewerking en de automatisering van het experimentele systeem, bedanken we Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin en Dr. Sudong Shu. We danken Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu en Katarzyna Kuliga voor hulp bij het testen van experimentele protocollen en het verzamelen van gegevens. We erkennen Drs. Anne E. Carpenter en Mark-Anthony Bray van het Imaging Platform van het Broad Institute of Harvard en MIT voor hulp bij de ontwikkeling van de beeldanalyseroutine in CellProfiler. Het beschreven project werd gedeeltelijk ondersteund door awards R21AI079474 en 1R01AI101446 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases of de National Institutes of Health. Het project werd ook ondersteund door Fraunhofer USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 - 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
