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Bioengineering

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

doi: 10.3791/50828 Published: January 8, 2014

Summary

Nous avons développé une plateforme microfluidique pour des tests rapides de sensibilité aux antibiotiques. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes peuvent survivre à ces conditions stressantes.

Abstract

Nous avons développé une méthode microfluidique rapide pour les tests de sensibilité aux antibiotiques dans un environnement basé sur le stress. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes survivent à ces conditions stressantes. L’hypothèse derrière cette méthode est nouvelle : l’activation du stress des voies biochimiques, qui sont des cibles des antibiotiques, peut accélérer les tests de sensibilité aux antibiotiques. Par rapport aux méthodes standard d’essai de sensibilité aux antibiotiques, l’étape limitant le taux - la croissance bactérienne - est omise lors de l’application de l’antibiotique. La mise en œuvre technique de la méthode se fait dans une combinaison de techniques standard et d’approches innovantes. Les parties standard de la méthode comprennent des protocoles de culture bactérienne, la définition de canaux microfluidiques dans le polydiméthylsiloxane (PDMS), la surveillance de la viabilité cellulaire avec fluorescence et le traitement d’images par lots pour le comptage des bactéries. Les parties innovantes de la méthode sont l’utilisation du flux de milieux de culture pour l’application de contraintes mécaniques, l’utilisation d’enzymes pour endommager mais pas tuer les bactéries et l’utilisation de substrats de microréseaux pour la fixation bactérienne. La plate-forme développée peut être utilisée dans le développement et l’essai de médicaments antibiotiques et non antibiotiques. Par rapport aux expériences de suspension bactérienne standard, l’effet du médicament peut être activé et désactivé à plusieurs reprises sur des périodes de temps contrôlées. L’observation répétitive de la même population bactérienne est possible au cours de la même expérience.

Introduction

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L’augmentation de la résistance bactérienne intensifie le besoin de tests de sensibilité aux antibiotiques rapides basés sur le phénotype afin de protéger nos médicaments de dernier recours. Les tests de sensibilité standard sont basés sur l’inhibition de la croissance bactérienne en présence d’antibiotiques qui prennent plusieurs (8-24) heures à compléter. Nous avons développé un nouveau test de sensibilité aux antibiotiques sur une plateforme microfluidique qui s’appuie sur l’activation du stress des voies biosynthétiques pour accélérer l’action des antibiotiques.

Les tests de sensibilité aux antibiotiques à l’échelle microfluidique ont l’avantage d’une utilisation efficace des échantillons, car ils nécessitent un petit nombre de bactéries. En outre, les dispositifs microfluidiques peuvent être multiplexés afin de tester plusieurs échantillons dans plusieurs conditions1,2. Récemment, un certain nombre de méthodes microfluidiques pour les tests de sensibilité aux antibiotiques ont été signalées3-9. Dans ces procédés, les bactéries sont cultivées à l’intérieur des gouttelettes nano- et picolitres3,7,dans le volume total du canal microfluidique4-6,8,ou sous forme de bactéries uniques localisées électriquement à la surface inférieure du canal9. Bien que ces tests soient effectués dans des canaux microfluidiques, ils surveillent tous la croissance microbienne en présence et en l’absence d’antibiotiques similaires aux méthodes traditionnelles. Les mesures de croissance sont prises via la densité optique, les colorants sensibles au pH ou le contraste de champ /phase lumineux ou des images de fluorescence. Bien que certains de ces tests soient plus rapides que les méthodes traditionnelles, ils détectent chacun passivement la résistance aux antibiotiques. En d’autres termes, ces méthodes nécessitent toujours que l’utilisateur attende la croissance bactérienne comme lecture finale.

En revanche, nous avons développé une méthode qui utilise une combinaison de cisaillement et de stress enzymatique pour activer les voies biochimiques sensibles aux antibiotiques10. La remise en question des bactéries stressées avec ces antibiotiques crée un test de susceptibilité plus rapide. Les bactéries résistantes à l’antibiotique sont capables de résister aux conditions stressantes. Les bactéries sensibles, d’autre part, sont rapidement tuées par les contraintes combinées. Le pourcentage de mort cellulaire après une heure, mesuré par microscopie à l’aide d’une coloration fluorescente des cellules mortes, définit le phénotype de la bactérie (résistante vs sensible).

Pour une mise en œuvre réussie de notre méthode, les bactéries doivent être immobilisées sur la surface inférieure du canal microfluidique. De cette façon, les bactéries peuvent être soumises à divers stress et simultanément esso repérées au microscope dans un seul plan. Une lame de verre de microscope revêtue est utilisée pour l’immobilisation des bactéries. La lame est pré-revêtue par le fabricant avec des groupes époxydes pour la liaison aux protéines non spécifiques. La liaison non spécifique de ces époxydes aux protéines de surface bactériennes fixe de manière covalente les bactéries à la surface de la lame.

Les souches sont testées dans des conditions identiques (cisaillement + stress enzymatique) en l’absence (contrôle) et en présence (expérience) d’antibiotique. Les photos de contraste de phase et de microscope à fluorescence de chaque canal sont prises automatiquement toutes les deux minutes pendant une heure. Les désignations de résistance sont ensuite faites en comparant le pourcentage de bactéries mortes dans le canal expérimental à celles présentes dans le canal témoin. Après une heure, un échantillon dont le pourcentage de mort cellulaire est supérieur à 1 % est considéré comme réceptif, tandis que moins de 0,5 % de décès indique une résistance. Les pourcentages qui se situent entre ces deux seuils sont considérés comme indéterminés et l’échantillon doit être testé de nouveau.

Les canaux microfluidiques sont définis dans PDMS, qui est un matériau de choix pour les dispositifs microfluidiques11. Pdms est optiquement transparent dans une large gamme de longueurs d’onde, biocompatible, inerte, perméable aux gaz et a une faible perméabilité aux liquides; par conséquent, il est bien adapté à ces expériences.

La contrainte mécanique/de cisaillement est créée par l’écoulement des milieux à température ambiante sur les bactéries immobilisées. (Remarque : Le réchauffement du support à 37 °C n’a pas d’effet significatif sur les résultats de l’essai.) Les pompes automatisées de seringue forcent les milieux (contenant une coloration des cellules mortes +/- antibiotique, ainsi que des facteurs de stress enzymatiques facultatifs) à travers les canaux microfluidiques (200 μm x 400 μm) à un débit de 1 ml/min pour donner 6,25 kPa de force de cisaillement ou un taux de cisaillement de 6 000 sec-1. Ce taux est égal ou supérieur aux contraintes de cisaillement précédemment étudiées sur les staphylocoques.

L’enzyme, la lysostaphine, a été choisie pour des expériences préliminaires parce qu’elle cause des dommages directs à la paroi cellulaire de Staphylococcus. La concentration de lysostaphin (0,7 ng/ml) était suffisante pour causer des dommages bactériens de paroi cellulaire, mais pas suffisante pour causer la mort cellulaire bactérienne sans antibiotique dans la période de l’expérience. La lysostaphine n’est pas requise pour la désignation correcte de la susceptibilité bactérienne, mais elle augmente le résultat, conduisant à une augmentation de la mort cellulaire chez les souches sensibles. En revanche, la contrainte de cisaillement est essentielle pour la fonction d’essai. Lorsque des souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méthicilline sont traitées avec de la lysostaphine et de l’oxacilline en l’absence d’écoulement, aucune mort cellulaire n’est enregistrée au cours de l’expérience.

La viabilité cellulaire est surveillée avec une coloration fluorescente des cellules mortes12. Le choix du colorant était basé sur sa capacité à colorer sélectivement seulement les cellules endommagées, sa nontoxicité aux cellules vivantes, et sa faible fluorescence de fond, qui a permis son ajout direct au milieu cellulaire sans étapes supplémentaires. Le choix d’une concentration de colorant fluorescent de 0,25 μM visait à atteindre des niveaux de signal acceptables pendant un temps d’exposition de 1,6 s à la lumière d’excitation de fluorescence.

Le bêta-lactamine, oxacilline, a été employé dans nos études préliminaires. Les espèces de S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) sont résistantes à l’oxacilline et ne présenteront aucune mort cellulaire appréciable au cours de l’expérience. La concentration de 50 μg/ml a été déterminée dans les études préliminaires. Des concentrations plus faibles d’antibiotiques ont donné moins de séparation entre les souches résistantes et sensibles, tandis que des concentrations plus élevées n’ont pas entraîné de différence appréciable dans les résultats expérimentaux.

Nous avons précédemment rendu compte du développement réussi d’un test qui combine des contraintes mécaniques et enzymatiques qui affectent directement la paroi cellulaire bactérienne13 avec un antibiotique qui inhibe la biosynthèse de la paroi cellulaire14,15. Ces expériences de démonstration de principe ont été réalisées sur un panel de SARM et de S. aureus (MSSA), sensible à la méthicilline. Cependant, avec la sélection des paramètres expérimentaux appropriés, notre méthode devrait être applicable à plusieurs espèces de bactéries et à plusieurs classes d’antibiotiques.

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Protocol

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1. Créer la couche PDMS (Figure 1)

  1. Mélanger vigoureusement le PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Pour éliminer les bulles, dégaz le mélange visqueux dans une chambre à vide pendant 1 heure à température ambiante.
  2. Sur une balance, versez le PDMS lentement sur le moule en aluminium. Versez du centre et maintenez le moule nivelé. Assurez-vous de laisser les broches à découvert. Arrêtez de verser une fois que le poids cible est atteint.
    Notre moule nécessite 4 g de PDMS et 0,4 g de réactif de durcissement.
  3. Niveler le moule à l’intérieur d’un four et durcir à 37 °C pendant la nuit.
    Les temps de durcissement alternatifs sont de 2 h à 60 °C ou de 1 h à 90 °C.
  4. Disséquer la couche PDMS durcie le long du bord du moule et la décoller soigneusement de la surface du moule avec une paire de pinces. Nettoyez la surface du moule avec 70% d’éthanol et une Q-tip.

2. Assemblez la cellule d’écoulement selon la figure 2

L’assemblage standard de PDMS avec des lames de verre se fait par traitement au plasma d’oxygène des deux surfaces, ce qui garantit une liaison sans fuite entre le PDMS et la lame de verre du microscope. Dans le protocole présenté, le traitement au plasma détruirait le revêtement chimique sur la lame de verre. Par conséquent, la lame est scellée sous pression plutôt que traitée au plasma.

  1. Placez la fenêtre en verre dans la poche de la cellule d’écoulement.
  2. Posez une lame de verre enduit sur la fenêtre en verre à l’intérieur de la poche de la cellule d’écoulement avec le côté actif vers le haut, et placez la couche PDMS avec des canaux orientés vers le bas sur le dessus. Placez la glissière PDMS de manière à ce que les entrées de canal s’alignent sur les trous traversants de la plaque métallique. Poussez doucement l’air entre les couches.
  3. Retournez l’assemblage PDMS/lame de verre afin que le PDMS fasse face à la fenêtre en verre. Superposez les entrées du canal PDMS avec les trous traversants de la plaque métallique.
  4. Placez la plaque de pression sur le dessus et serrez les vis.
  5. Placez la cellule d’écoulement assemblée sous le microscope. Réglez le grossissement du microscope sur 60X et préalignez les positions du canal.

3. Préparer les bactéries de la phase logarithmique

  1. Jour avant l’expérience : Inoculer 50 ml de bouillon Mueller Hinton contenant 2 % de NaCl (MH2) avec une colonie bactérienne. Agiter à 250 tr/min pendant la nuit à 37 °C.
    Une ou deux souches bactériennes peuvent être étudiées dans une expérience pour la configuration décrite.
  2. Avant l’expérience : Mélanger 50 μl de culture bactérienne pendant la nuit dans 50 ml de milieu MH2. Agiter à 250 tr/min pendant 3 h à 37 °C pour s’assurer que les bactéries sont en phase logarithmique.

4. Réchauffer les composants de la solution expérimentale au moins 10 minutes avant qu’ils ne soient nécessaires

  1. Décongeler le colorant fluorescent (5 mM de stock) et la lysostaphine (10 μg/ml de stock) à température ambiante.
  2. Réchauffer la poudre d’oxacilline à température ambiante.

5. Préparer et charger la suspension bactérienne

  1. Après la fin de la sous-culture de 3 heures: Prendre 10 ml de culture de bactéries et centrifuger à 1 650 x g pendant 2 min.
  2. Retirer le surnageant et la remise en suspension des bactéries dans 1 ml de milieux frais MH2.
  3. Fixez un tube de courte longueur à une seringue Luer lock de 1 ml. Rincer le tube de la seringue avec 1 ml de support. Laissez un peu de support dans le tube pour éviter les bulles d’air lors de l’étirage dans la suspension bactérienne.
  4. Chargez 0,7 ml de bactéries de type 1 dans la seringue. Remplissez deux canaux de la cellule d’écoulement avec des bactéries de type 1. Surveillez l’apparition du liquide de l’autre côté du canal après ca. 150 μl.
    La transparence du canal change à mesure qu’il est rempli de bactéries.
  5. Si vous expérimentez avec plusieurs types de bactéries, répétez la procédure de chargement pour les bactéries de type 2 dans les deux canaux restants de la cellule d’écoulement.
  6. Placez la cellule d’écoulement à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C pendant 45 min pour permettre la décantation bactérienne et sa fixation à la surface de la glissière.

6. Préparer et charger les solutions expérimentales

  1. Préparer 140 μl de solution de colorant fluorescent à 0,5 mM en mélangeant 14 μl de colorant fluorescent (5 mM) et 126 μl de milieux MH2.
  2. Diluer 10 mg d’oxacilline dans 40 ml de MH2 pour obtenir une concentration finale de 250 μg/ml d’oxacilline.
  3. Préparer 130 ml de solution témoin avec des concentrations finales de colorant fluorescent de 0,25 μM et de 0,7 ng/ml de lysostaphine. Pour ce faire, mélanger 65 μl de colorant fluorescent (0,5 mM), 9,12 μl de stock de lysostaphine (10 μg/ml) et 130 ml de milieux MH2.
  4. Préparer 130 ml de solution antibiotique avec des concentrations finales de colorant fluorescent de 0,25 μM, de 0,7 ng/ml de lysostaphine et de 50 μg/ml d’oxacilline. Pour ce faire, mélanger 65 μl de colorant fluorescent (0,5 mM), 9,12 μl de stock de lysostaphine (10 μg/ml), 26 ml d’oxacilline (250 μg/ml) et 104 ml de milieux MH2.
  5. Remplissez deux seringues de 60 ml avec une solution de contrôle et deux seringues de 60 ml avec une solution antibiotique. Conservez les solutions enveloppées dans du papier d’aluminium pour éviter la dégradation des réactifs induite par la lumière.
    Remplissez trop les seringues pour tenir compte de la perte due au rinçage du tube.
  6. Retirez les bulles d’air des seringues en feuilletant. Fixez et remplissez le tube d’entrée à la pointe avec la solution expérimentale.
  7. Montez des seringues sur la pompe. Placez d’abord la seringue avec le plus petit volume, puis verrouillez la position du piston. Placez le reste des seringues sur la pompe, en serrant leurs pistons si nécessaire.
  8. Réglez la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 60 ml. Faites un flush avec la pompe jusqu’à ce qu’un flux constant de liquide soit vu de toutes les seringues.

7. Configurez la cellule d’écoulement au microscope

  1. Retirez la cellule d’écoulement de la centrifugeuse et montez-la sur l’étage du microscope(Figure 3).
  2. Connectez le tube d’entrée/sortie à chacun des canaux de cellule d’écoulement (une entrée/une sortie par canal).
    La collecte de la sortie dans quatre conteneurs différents permet de mesurer des volumes de sortie de canal individuels.

8. Exécutez l’expérience de 60 minutes

  1. Vérifiez les positions préalignées de l’étape 2.5. Si le champ de vision du microscope n’est pas centré sur le canal et/ou n’est pas mis au point, ajustez les paramètres et enregistrez les nouvelles positions.
    Une mise au point précise peut ne pas être possible avant le début de l’écoulement en raison de la forte densité de bactéries chargées.
  2. Réglez le temps d’acquisition du contraste de phase à 10 ms et le temps d’acquisition de la fluorescence à 1 600 ms.
  3. Obtenir des images de contraste de phase et de fluorescence pour chaque position avant d’initier le flux.
    Cela donne une estimation qualitative de la densité bactérienne chargée.
  4. Démarrez le flux de liquide et vérifiez immédiatement que le microscope est focalisé sur le bas des canaux.
  5. Prenez des images de contraste de phase et de fluorescence des zones cibles dans la première minute d’écoulement.
  6. Acquérir des images toutes les 2 minutes après le premier ensemble d’images jusqu’à ce que 60 min de flux se soit produite. Recentrez-vous au besoin.

9. Désinfecter la cellule d’écoulement

  1. Faire une solution d’eau de Javel à 10% dans un bécher (100 ml). Remplissez 4 seringues de 20 ml avec 10 ml du mélange. Déblocez les seringues et fixez-les à la cellule d’écoulement.
    Il faudra ~ 1-2 min pour que les canaux soient débraux des bactéries.
  2. Réglez la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 3 ml. Courir pendant 3 min.
  3. Remplissez 4 seringues de 60 ml avec 60 ml d’eau DI. Déblocez les seringues et fixez-les à la cellule d’écoulement.
  4. Régler la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 30 ml. Courir pendant 30 min.
  5. Surveillez le nettoyage du canal au microscope.
  6. Désassemblez la cellule d’écoulement. Jetez la lame époxy utilisée. Faire tremper les composants de la cellule d’écoulement dans de l’eau DI pendant 20 min. Sécher à l’air.

10. Analyser les images et générer des données

  1. Comptez le nombre de bactéries dans chaque image.
    Le logiciel en libre accès, CellProfiler est utilisé pour effectuer le traitement d’image par lots16. Un aperçu général de la routine CellProfiler est résumé dans le tableau 1. Le nombre de bactéries présentes dans l’image de contraste de phase (Np)donne le nombre total de bactéries. Le nombre de bactéries visibles dans l’image de fluorescence (Nf)donne le nombre de bactéries mortes.
  2. Calculer le pourcentage normalisé de mort cellulaire bactérienne en fonction du temps.
    1. Importez Nf et Np pour des images individuelles dans le logiciel d’analyse de données.
    2. Calculer la fraction de bactéries mortes dans chaque canal à un point de temps spécifique donné par la fraction (Nf / Np) à t = T.
    3. Soustrayez la fraction de bactéries mortes présentes au début de l’expérience (t = 1 min) pour les canaux témoins et expérimentaux.
    4. Soustrayez la fraction de bactéries mortes présentes dans le canal témoin de celle présente dans le canal expérimental à chaque point temporel avec l’équation suivante :

      Data Analysis Equation

    5. Graphenorme DP vs t pour le cours de l’expérience.
      Il est à noter qu’un échantillon dont le pourcentage de mort cellulaire est supérieur à 1 % est considéré comme réceptif, tandis que moins de 0,5 % de décès indique une résistance. Les pourcentages qui se situent entre ces deux seuils sont considérés comme indéterminés et l’échantillon doit être testé de nouveau.
    6. Utilisez une feuille de calcul pour résumer et analyser les résultats de différentes expériences.

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Representative Results

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Les données présentées à la figure 4 montrent la réponse d’une souche sensible de Staphylococcus aureus au fil du temps dans un canal microfluidique contenant des antibiotiques. Les images de contraste de phase acquises à 1 min et à la fin de l’expérience 1 heure sont représentées sur les figures 4A et B. Les données analysées sur 1 heure sont présentées à la figure 4C avec les bactéries surlignées en rouge (5 828 au total). Les images de fluorescence correspondantes sont représentées sur les figures 4D et E. Les données analysées sur 1 heure sont représentées à la figure 4F avec les bactéries fluorescentes surlignées en rouge (174 morts).

Cet ensemble d’images illustre plusieurs points. Plus important encore, une augmentation significative du nombre de bactéries fluorescentes est observée à la fin de l’expérience (comparer le nombre de taches fluorescentes brillantes à 1 min et 60 min dans les figures 4D et E), cequi indique la mort cellulaire à l’intérieur du canal. Ces résultats sont révélateurs d’une souche sensible.

Un autre point important à noter est la nécessité des normalisations utilisées dans l’équation ci-dessus. En raison de la non-uniforme stochastique des revêtements individuels de lames époxy, il peut y avoir une perte de cellules bactériennes tout au long de l’expérience sous une pression de cisaillement soutenue (comparer les figures 4A et B). Pour tenir compte de cette variation, chaque image de fluorescence d’une population de cellules mortes est normalisée avec l’image de contraste de phase coacquired donnant la population cellulaire totale au même point de temps (dans un délai de 1 seconde).

Une normalisation de plus est faite en soustrayant la fluorescence normalisée au début de l’expérience (t = 1 min) de tous les autres points de temps (t = T). La fluorescence des cellules mortes à 1 min correspond à la mort cellulaire avant le début de l’expérience. Une fluorescence élevée observée au début de l’expérience pour le MSSA ou le SARM indique généralement un mauvais état de la culture bactérienne. En de rares occasions, il représente une contamination de la glissière PDMS.

Les encarts dans les coins inférieurs des images sont des versions agrandies des zones d’image encadrées à partir des images brutes et analysées. Ces agrandissements montrent que notre algorithme de comptage est plus efficace pour compter avec précision les bactéries individuelles dans les images de fluorescence que dans les images de contraste de phase densément peuplées.

La tache de cellules mortes donne un contraste de fluorescence élevé pour les bactéries mortes individuelles. Étant donné que le nombre de bactéries fluorescentes dépasse rarement 5% du nombre total, chaque bactérie est très brillante par rapport au fond. Pour cette raison, les bactéries fluorescentes peuvent être facilement comptées avec un degré élevé de précision. D’autre part, les bactéries sont densément emballées sur l’image de contraste de phase. De plus, le contraste de phase au sein d’une bactérie n’est pas toujours uniforme. Ces deux facteurs présentent un défi pour un algorithme de comptage car il repose sur le seuillage de différentes zones en fonction de leurs plages de taille et intensités approximatives.

Par conséquent, afin de comparer les résultats expérimentaux, il est nécessaire d’utiliser le même algorithme de comptage avec les mêmes paramètres tout au long de différentes expériences. Il est à noter qu’en raison du faible nombre de comptages de fluorescence, il existe une sensibilité plus élevée aux erreurs de fluorescence; par conséquent, il est plus important de compter avec précision les images de fluorescence que les images de contraste de phase.

Enfin, les données MSSA et SARM normalisées selon l’équation ci-dessus sont présentées à la figure 5 pour trois expériences différentes. Comme prévu pour les souches résistantes, la mort cellulaire normalisée est de faible ampleur (<0,5 %) et ne change pas au cours de l’expérience. Les souches sensibles montrent une augmentation constante de la mort cellulaire et une valeur plus élevée à la fin de l’expérience (>1%). L’initiation de la mort cellulaire pour les souches sensibles varie légèrement d’une expérience à l’autre, mais reste généralement comprise entre 10 et 30 minutes.

Figure 1
Figure 1. Photographie montrant les géométries et les tailles des canaux microfluidiques dans la couche PDMS. Les sections étroites des canaux mesurent 3,7 cm de long, 200 μm de haut et 400 μm de large.

Figure 2
Figure 2. Un modèle CAO illustrant chacun des composants de la cellule d’écoulement et leurs positions relatives.

Figure 3
Figure 3. Une photographie montrant la configuration expérimentale du microscope et de la pompe à seringues.

Figure 4
Figure 4. Images de contraste de phase (A-C) et de fluorescence (D-F) pour une souche MSSA représentative dans un canal contenant des antibiotiques. Les encarts montrent des images agrandies des zones encadrées. Des images de microscope ont été acquises au grossissement de 60X. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Figure 5
Figure 5. Graphique montrant les pourcentages de mort cellulaire normalisés en fonction du temps. Chacune des souches de MSSA et de SARM a été testée dans le cours de trois expériences distinctes.

Table 1
Tableau 1. Composants de routine CellProfiler pour le comptage automatisé des bactéries.

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Discussion

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Le protocole présenté a été validé et optimisé dans un ensemble d’expériences avec des souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méthicilline et résistantes à la méthicilline10. Par conséquent, ce protocole sans modification devrait être directement applicable à d’autres souches de S. aureus et à d’autres antibiotiques avec des mécanismes d’action affectant la biosynthèse bactérienne de paroi cellulaire. Les types de bactéries autres que S. aureus peuvent nécessiter une variation des paramètres de contrainte: contraintes solubles (enzymatiques) et mécaniques. Si des facteurs de stress solubles sont souhaités dans les tests d’espèces bactériennes autres que staphylocoques, un autre agent de stress sera nécessaire, car la lysostaphine est une enzymespécifiquestaphylococcique.

La quantité de contrainte de cisaillement est proportionnelle au débit du liquide et inversement proportionnelle à la taille du canal, donc en principe elle peut être modifiée dans une large plage de valeurs. Les valeurs de contrainte obtenues sont limitées par les facteurs expérimentaux suivants: capacité du substrat d’immobilisation à maintenir les bactéries en place sous des débits plus élevés, l’ensemble microfluidique supportant des pressions élevées sans fuite, la résistance à l’écoulement du liquide à l’intérieur du système, ce qui peut rendre le débit instable ou même l’arrêter à des débits plus faibles. La force de la liaison était suffisante pour les expériences de S. aureus, mais une augmentation du débit ou un changement d’espèces bactériennes peut nécessiter un type de revêtement différent. Les lames recouvertes d’époxy sont conventionnellement utilisées pour l’analyse de puces à ADN protéiques et ne sont pas spécialement conçues pour contenir de gros objets cellulaires. Étant donné que la formulation et la densité du revêtement sont exclusives, le développement de formulations alternatives avec le dépôt de revêtement de surface contrôlé est hautement souhaitable.

Nous avons récemment constaté que le temps nécessaire à la culture et à l’attachement bactériens peut être considérablement réduit. Les colonies peuvent être cultivées en phase logarithmique directement à partir d’une plaque de gélose dans un petit volume de milieux en trois heures, éliminant ainsi l’étape de culture de nuit. De plus, la fixation peut être accélérée en centrifugant les bactéries à l’intérieur de la cellule d’écoulement pendant une minute, en supprimant le temps de décantation de 45 minutes. Des expériences dans notre laboratoire sont actuellement menées avec ce protocole abrégé.

Bien que le protocole ait été spécifiquement conçu pour les antibiotiques ciblant la biosynthèse de la paroi cellulaire bactérienne, des études récentes indiquent que les antibiotiques avec différentes cibles primaires dans les cellules bactériennes activent les mêmes voies de réponse bactérienne en aval17,18. Par conséquent, notre méthode peut être applicable pour l’identification rapide de la susceptibilité aux antibiotiques qui ciblent des voies biosynthétiques indépendantes de la biosynthèse de paroi cellulaire, et les études initiales dans notre laboratoire donnent du crédit à cette hypothèse.

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Disclosures

La méthode microfluidique est en instance de brevet : Sauer-Budge A, Sharon A, Kalachnikov M, Wirz H, inventeurs ; Procédé et dispositif de détection rapide de la résistance bactérienne aux antibiotiques/sensibilité au brevet PCT/US10/33523.

Acknowledgments

Nous remercions les ingénieurs et les étudiants du Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Pour avoir contribué à la conception, à l’usinage et à l’automatisation du système expérimental, nous remercions Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin et le Dr Sudong Shu. Nous remercions Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu et Katarzyna Kuliga pour leur aide dans la mise à l’essai des protocoles expérimentaux et la collecte de données. Nous remercions les Drs Anne E. Carpenter et Mark-Anthony Bray de la plateforme d’imagerie du Broad Institute de Harvard et du MIT pour leur aide dans le développement de la routine d’analyse d’images dans CellProfiler. Le projet décrit a été soutenu en partie par les prix R21AI079474 et 1R01AI101446 de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou des Instituts nationaux de la santé. Le projet a également été soutenu par Fraunhofer USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SYTOX Green Invitrogen Corporation S7020 Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, Inc A9418-5G Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate Sigma Aldrich, Inc S8750-500G Used for lysostaphin storage
Lysostaphin  Cell Sciences CRL309A Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage 
Oxacillin salt Sigma Aldrich, Inc 28221-1G Antibiotic
Mueller Hinton Broth Fisher Scientific DF0757-17-6
Sodium chloride Sigma Aldrixh S3014-500G 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe  BD (Beckton, Dickinson and Comp.) 14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe BD (Beckton, Dickinson and Comp.) 309653 - 60 mL Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 Cambridge Scientific 9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective Olympus Corp. LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera QImaging RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence PRIOR Scientific H204/H202
X/Y Stage  PRIOR Scientific H107AENN
Focus motor PRIOR Scientific H122
Joystick for XYZ control PRIOR Scientific CS152EF
Proscan Controller PRIOR Scientific H3-XY2
Image Acquisition Software Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI 3333-1044 Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window Fraunhofer CMI 3333-1054 Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm Edmund Optics Inc. NT48-543
Sealing plate BU Scientific Instruments Facility 3333-1045
Epoxide glass slide Arrayit Corporation SuperEpoxy 2
PDMS master Fraunhofer CMI 3333-1053 Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design Fraunhofer CMI 3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green  IDEX Health Science M-644-03 Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black IDEX Health Science M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural IDEX Health Science P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow IDEX Health Science P-259 Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green  IDEX Health Science 1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red  IDEX Health Science P-658

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References

  1. Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
  2. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
  3. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
  4. Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
  5. Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
  6. Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
  7. Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
  8. Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
  9. Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
  10. Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
  11. McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
  13. Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
  14. Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
  15. Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
  16. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
  17. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
  18. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce
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Kalashnikov, M., Campbell, J., Lee, J. C., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip. J. Vis. Exp. (83), e50828, doi:10.3791/50828 (2014).More

Kalashnikov, M., Campbell, J., Lee, J. C., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip. J. Vis. Exp. (83), e50828, doi:10.3791/50828 (2014).

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