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Bioengineering

एक चिप पर तनाव प्रेरित एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण

doi: 10.3791/50828 Published: January 8, 2014

Summary

हमने तेजी से एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म विकसित किया है। तरल पदार्थ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के तल पर स्थिर बैक्टीरिया पर उच्च गति से पारित किया जाता है। तनाव और एंटीबायोटिक की उपस्थिति में, बैक्टीरिया के अतिसंवेदनशील उपभेदों तेजी से मर जाते हैं। हालांकि, प्रतिरोधी बैक्टीरिया इन तनावपूर्ण स्थितियों से बच सकते हैं।

Abstract

हमने तनाव आधारित वातावरण में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक रैपिड माइक्रोफ्लुइडिक विधि विकसित की है। तरल पदार्थ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के तल पर स्थिर बैक्टीरिया पर उच्च गति से पारित किया जाता है। तनाव और एंटीबायोटिक की उपस्थिति में, बैक्टीरिया के अतिसंवेदनशील उपभेदों तेजी से मर जाते हैं। हालांकि, प्रतिरोधी बैक्टीरिया इन तनावपूर्ण स्थितियों से बच जाते हैं। इस विधि के पीछे परिकल्पना नई है: जैव रासायनिक रास्तों की तनाव सक्रियता, जो एंटीबायोटिक दवाओं के लक्ष्य हैं, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण में तेजी ला सकती है। मानक एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण विधियों की तुलना में, दर-सीमित कदम - बैक्टीरियल विकास - एंटीबायोटिक आवेदन के दौरान छोड़ दिया जाता है। विधि का तकनीकी कार्यान्वयन मानक तकनीकों और अभिनव दृष्टिकोणों के संयोजन में है। विधि के मानक भागों में बैक्टीरियल कल्चर प्रोटोकॉल, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) में माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को परिभाषित करना, फ्लोरेसेंस के साथ सेल व्यवहार्यता निगरानी और बैक्टीरिया की गिनती के लिए बैच इमेज प्रोसेसिंग शामिल है। विधि के अभिनव भागों यांत्रिक तनाव आवेदन के लिए संस्कृति मीडिया प्रवाह के उपयोग में हैं, एंजाइमों के उपयोग को नुकसान लेकिन बैक्टीरिया को मारने नहीं है, और जीवाणु लगाव के लिए microarray सब्सट्रेट्स का उपयोग करें । विकसित मंच एंटीबायोटिक और गैर-antibiotic से संबंधित दवा विकास और परीक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है। मानक बैक्टीरियल निलंबन प्रयोगों की तुलना में, दवा के प्रभाव को नियंत्रित समय अवधि में बार-बार चालू और बंद किया जा सकता है। एक ही प्रयोग के दौरान एक ही जीवाणु आबादी का दोहराव अवलोकन संभव है।

Introduction

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जीवाणु प्रतिरोध के उदय से अंतिम उपाय की हमारी दवाओं की रक्षा के लिए तेजी से फेनोटाइप आधारित एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षणों की आवश्यकता तेज हो जाती है । मानक संवेदनशीलता परीक्षण एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में बैक्टीरियल विकास अवरोध पर आधारित होते हैं जिन्हें पूरा करने में कई (8-24) घंटे लगते हैं। हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर एक उपन्यास एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण विकसित किया है जो एंटीबायोटिक दवाओं की कार्रवाई में तेजी लाने के लिए बायोसिंथेटिक रास्तों के तनाव-सक्रियण पर निर्भर करता है।

माइक्रोफ्लुइडिक पैमाने पर एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण प्रभावी नमूना उपयोग का लाभ लेते हैं, क्योंकि उन्हें बैक्टीरिया की छोटी संख्या की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कई शर्तों1,2के तहत कई नमूनों का परीक्षण करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। हाल ही में, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक तरीकों की एक संख्या3-9की सूचना दी गई है । इन तरीकों में, बैक्टीरिया नैनो के अंदर उगाए जाते हैं- और पिकाल्टर बूंदों3,7,माइक्रोफ्लुइडिक चैनल4-6,8की पूरी मात्रा में, या चैनल9की निचली सतह पर एक बैक्टीरिया विद्युत रूप से स्थानीयकृत। हालांकि ये परीक्षण माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में किए जाते हैं, लेकिन वे सभी पारंपरिक तरीकों के समान एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माइक्रोबियल विकास की निगरानी करते हैं। विकास मापन ऑप्टिकल घनत्व, पीएच संवेदनशील रंगों, या उज्ज्वल क्षेत्र/चरण विपरीत या फ्लोरेसेंस छवियों के माध्यम से लिया जाता है । हालांकि इन परीक्षणों में से कुछ पारंपरिक तरीकों की तुलना में तेजी से कर रहे हैं, वे प्रत्येक निष्क्रिय एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाने । दूसरे शब्दों में, इन तरीकों को अभी भी उपयोगकर्ता को अंतिम read-आउट के रूप में बैक्टीरियल विकास के लिए इंतजार करने की आवश्यकता होती है।

इसके विपरीत, हमने एक विधि विकसित की है जो एंटीबायोटिक-संवेदनशील जैव रासायनिक रास्तों को सक्रिय करने के लिए कतरनी और एंजाइमेटिक तनाव के संयोजन का उपयोग करती है10। उन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ तनावग्रस्त बैक्टीरिया को चुनौती देने से अधिक तेजी से संवेदनशीलता परीक्षण होता है । एंटीबायोटिक के प्रतिरोधी बैक्टीरिया तनावपूर्ण स्थितियों का सामना करने में सक्षम हैं। दूसरी ओर, अतिसंवेदनशील बैक्टीरिया, संयुक्त तनाव से तेजी से मारे जाते हैं। एक घंटे के बाद सेल मृत्यु का प्रतिशत, फ्लोरोसेंट मृत कोशिका दाग का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है, बैक्टीरिया (प्रतिरोधी बनाम अतिसंवेदनशील) के फेनोटाइप को परिभाषित करता है।

हमारी विधि के सफल कार्यान्वयन के लिए, बैक्टीरिया को माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की निचली सतह पर स्थिर किया जाना चाहिए। इस तरह, बैक्टीरिया विभिन्न तनावों के अधीन हो सकता है और साथ ही एक ही विमान में माइक्रोस्कोप के नीचे चित्रित किया जा सकता है। बैक्टीरिया स्थिरीकरण के लिए एक कोटेड माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड का उपयोग किया जाता है। स्लाइड को निर्माता द्वारा गैर-विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी के लिए एपोक्साइड समूहों के साथ प्रीकोट किया जाता है। बैक्टीरियल सतह प्रोटीन के लिए इन एपोक्साइड की गैर-विशिष्ट बाध्यकारी बैक्टीरिया को स्लाइड सतह पर जोड़ती है।

एंटीबायोटिक की अनुपस्थिति (नियंत्रण) और उपस्थिति (प्रयोग) में समान परिस्थितियों (कतरनी + एंजाइमेटिक तनाव) के तहत उपभेदों का परीक्षण किया जाता है। प्रत्येक चैनल के चरण विपरीत और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चित्रों को एक घंटे के लिए हर दो मिनट में स्वचालित रूप से लिया जाता है। प्रतिरोध पदनाम तो नियंत्रण चैनल में मौजूद लोगों के लिए प्रयोगात्मक चैनल में मृत बैक्टीरिया के प्रतिशत की तुलना करके किया जाता है । एक घंटे के बाद, 1% से अधिक सेल मृत्यु प्रतिशत वाले नमूने को अतिसंवेदनशील माना जाता है, जबकि 0.5% से कम मृत्यु प्रतिरोध का संकेत है। प्रतिशत है कि इन दो कट-नापसंद के बीच गिर अनिश्चित माना जाता है और नमूना फिर से परीक्षण किया जाना चाहिए ।

माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को पीडीएमएस में परिभाषित किया गया है, जो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों11के लिए पसंद की सामग्री है। पीडीएमएस तरंगदैर्ध्य, जैव संगत, निष्क्रिय, गैसों के लिए पारमशील की एक विस्तृत श्रृंखला में ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है और तरल पदार्थों के लिए कम पारी क्षमता है; इसलिए यह इन प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

यांत्रिक/कतरनी तनाव स्थिर बैक्टीरिया पर कमरे के तापमान मीडिया के प्रवाह के द्वारा बनाया गया है । (नोट: ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया वार्मिंग परख परिणाम पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.) स्वचालित सिरिंज पंप बल मीडिया (मृत सेल दाग +/-एंटीबायोटिक युक्त, साथ ही वैकल्पिक एंजाइमेटिक तनाव) माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से (२०० माइक्रोन x ४०० माइक्रोन) 1 मिलीलीटर की प्रवाह दर पर/ यह दर स्टेफिलोकोसीपर पहले से अध्ययन किए गए कतरनी तनाव के बराबर या उससे अधिक है ।

एंजाइम, lysostaphin, प्रारंभिक प्रयोगों के लिए चुना गया था क्योंकि यह स्टेफिलोकोकस सेल दीवार को सीधे नुकसान का कारण बनता है । lysostaphin (०.७ एनजी/मिलीलीटर) की एकाग्रता बैक्टीरियल सेल दीवार क्षति का कारण पर्याप्त था, लेकिन प्रयोग की समय सीमा में एंटीबायोटिक के बिना बैक्टीरियल सेल मौत का कारण पर्याप्त नहीं है । बैक्टीरिया संवेदनशीलता के सही पदनाम के लिए Lysostaphin की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यह परिणाम को बढ़ाता है, जिससे अतिसंवेदनशील उपभेदों में सेल की मौत बढ़ जाती है। इसके विपरीत, परख समारोह के लिए कतरनी तनाव महत्वपूर्ण है। जब मैथिसिलिन-संवेदनशील स्टेफिलोकोकस ऑरियस उपभेदों को प्रवाह के अभाव में lysostaphin और ऑक्सासिलिन के साथ इलाज किया जाता है, तो प्रयोग के दौरान कोई कोशिका मृत्यु दर्ज नहीं की जाती है।

कोशिका व्यवहार्यता की निगरानी फ्लोरोसेंट डेड सेल दाग12से की जाती है . डाई का चयन चुनिंदा रूप से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को दागने की क्षमता पर आधारित था, कोशिकाओं को जीवित करने के लिए इसकी गैर-क्षमता, और इसकी कम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस, जो अतिरिक्त चरणों के बिना सेल मीडिया के लिए इसके प्रत्यक्ष इसके लिए अनुमति दी गई थी। 0.25 माइक्रोन की फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता का चयन फ्लोरेसेंस उत्तेजन प्रकाश के लिए 1.6 सेकंड के जोखिम समय के दौरान स्वीकार्य संकेत स्तर प्राप्त करना था।

बीटा लैक्टम, ऑक्ससिलिन, हमारे प्रारंभिक अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था। मैथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) प्रजातियां ऑक्सासिलिन के लिए प्रतिरोधी हैं और प्रयोग की समय सीमा में कोई प्रशंसनीय कोशिका मृत्यु नहीं दिखाएगी। प्रारंभिक अध्ययनों में 50 माइक्रोग्राम/एमएल की एकाग्रता निर्धारित की गई थी। एंटीबायोटिक की कम सांद्रता ने प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील उपभेदों के बीच कम अलगाव दिया, जबकि उच्च सांद्रता के कारण प्रायोगिक परिणामों में सराहनीय अंतर नहीं हुआ ।

हमने पहले एक परीक्षण के सफल विकास पर रिपोर्ट की है जो यांत्रिक और एंजाइमेटिक तनावों को जोड़ती है जो सीधे बैक्टीरियल सेल वॉल13 को एक एंटीबायोटिक के साथ प्रभावित करती है जो सेल वॉल बायोसिंथेसिस14,15को रोकता है। ये प्रूफ-ऑफ-सैद्धांतिक प्रयोग एमआरएसए और मैथिसिलिन के संवेदनशील एस ऑरियस (एमएसएसए) के एक पैनल पर किए गए थे । हालांकि, उचित प्रयोगात्मक मापदंडों के चयन के साथ, हमारी विधि बैक्टीरिया की कई प्रजातियों और एंटीबायोटिक दवाओं के कई वर्गों पर लागू होनी चाहिए।

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Protocol

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1. पीडीएमएस लेयर बनाएं (चित्रा 1)

  1. 10:1 अनुपात में पीडीएमएस और इलाज एजेंट को सख्ती से मिलाएं। बुलबुले को हटाने के लिए, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक वैक्यूम कक्ष में चिपचिपा मिश्रण को डेगास करें।
  2. एक पैमाने पर, एल्यूमीनियम मोल्ड पर धीरे-धीरे पीडीएमएस डालें। केंद्र से डालो और मोल्ड समतल रखें। पिन को खुला छोड़ना सुनिश्चित करें। एक बार लक्ष्य वजन हासिल करने के बाद डालना बंद करें।
    हमारे मोल्ड को 4 ग्राम पीडीएमएस और 0.4 ग्राम इलाज रिएजेंट की आवश्यकता होती है।
  3. एक ओवन के अंदर मोल्ड स्तर, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज।
    वैकल्पिक इलाज का समय 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा या 90 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा होता है।
  4. मोल्ड के किनारे के साथ ठीक पीडीएमएस परत को विच्छेदन करें और इसे मोल्ड सतह से एक जोड़ी संदंश के साथ सावधानी से छील लें। मोल्ड सतह को 70% इथेनॉल और क्यू-टिप के साथ साफ करें।

2. चित्रा 2 के अनुसार प्रवाह सेल को इकट्ठा करें

ग्लास स्लाइड के साथ पीडीएमएस की मानक असेंबली दोनों सतहों के ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के माध्यम से की जाती है, जो पीडीएमएस और माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड के बीच रिसाव-मुक्त संबंध सुनिश्चित करती है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में प्लाज्मा उपचार कांच की स्लाइड पर रासायनिक कोटिंग को नष्ट कर देगा। इसलिए स्लाइड प्लाज्मा इलाज के बजाय दबाव सील है ।

  1. कांच की खिड़की को फ्लो सेल पॉकेट में रखें।
  2. सक्रिय पक्ष के साथ प्रवाह सेल की जेब के अंदर कांच की खिड़की पर एक लेपित ग्लास स्लाइड बिछाएं, और इसके शीर्ष पर नीचे का सामना कर रहे चैनलों के साथ पीडीएमएस परत रखें। पीडीएमएस स्लाइड को इस तरह से रखें कि चैनल इनपुट धातु की प्लेट में थ्र-होल के साथ संरेखित हों। धीरे-धीरे हवा को परतों के बीच से बाहर धकेलें।
  3. पीडीएमएस/ग्लास स्लाइड असेंबली को फ्लिप करें ताकि पीडीएमएस को शीशे की खिड़की का सामना करना पड़े । धातु की प्लेट में थ्र-होल के साथ पीडीएमएस चैनल इनपुट ओवरलैप करें।
  4. प्रेशर प्लेट को ऊपर रखें और शिकंजा कस लें।
  5. असेंबल फ्लो सेल को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। माइक्रोस्कोप आवर्धन को 60X पर सेट करें और चैनल की स्थिति को पूर्वाग्न करें।

3. लॉग चरण बैक्टीरिया तैयार करें

  1. प्रयोग से पहले दिन: एक जीवाणु कॉलोनी के साथ 2% NaCl (MH2) युक्त म्यूलर हिंटन शोरबा के 50 मिलीलीटर टीका। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 250 आरपीएम पर हिलाएं।
    वर्णित सेट-अप के लिए एक प्रयोग में एक या दो जीवाणु उपभेदों का अध्ययन किया जा सकता है।
  2. प्रयोग से पहले: MH2 मीडिया के 50 मिलीलीटर में रातोंरात बैक्टीरिया संस्कृति के 50 माइक्रोन मिलाएं। बैक्टीरिया लॉग चरण में हैं सुनिश्चित करने के लिए 3 घंटे के लिए 3 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर हिलाएं।

4. प्रयोगात्मक समाधान घटकों को कम से कम 10 मिनट पहले गर्म करें

  1. फ्लोरोसेंट डाई (5 एमएम स्टॉक) और एलिसोस्टाफिन (10 माइक्रोग्राम/एमएल स्टॉक) को कमरे के तापमान पर गल जाता है ।
  2. ऑक्ससिलिन पाउडर को कमरे के तापमान तक गर्म करें।

5. बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार करें और लोड करें

  1. 3 घंटे उपसंस्कृति के अंत के बाद: 2 मिनट के लिए 1,650 x ग्राम पर बैक्टीरिया संस्कृति और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर ले लो।
  2. ताजा MH2 मीडिया के 1 मिलीलीटर में सुपरनैंट और रिसिपेंड बैक्टीरिया को हटा दें।
  3. एक 1 मिलीलीटर Luer ताला सिरिंज के लिए ट्यूबिंग की एक छोटी लंबाई संलग्न करें। मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ सिरिंज ट्यूबिंग फ्लश। बैक्टीरियल सस्पेंशन में ड्राइंग करते समय हवा के बुलबुले से बचने के लिए ट्यूबिंग में मीडिया का एक छोटा सा छोड़ दें।
  4. सिरिंज में 0.7 मिलीलीटर बैक्टीरिया टाइप 1 लोड करें। बैक्टीरिया टाइप 1 के साथ प्रवाह कोशिका के दो चैनल भरें। सीएके बाद चैनल के दूसरी तरफ तरल दिखाई देने के लिए देखें । 150 माइक्रोन।
    बैक्टीरिया से भरे होने के साथ ही चैनल की पारदर्शिता बदल जाती है।
  5. यदि कई बैक्टीरिया प्रकारों के साथ प्रयोग कर रहे हैं, तो प्रवाह कोशिका के दो शेष चैनलों में बैक्टीरिया टाइप 2 के लिए लोडिंग प्रक्रिया दोहराएं।
  6. बैक्टीरियल निपटाने और स्लाइड सतह से लगाव की अनुमति देने के लिए 45 मिनट के लिए इनक्यूबेटर के अंदर प्रवाह कोशिका को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

6. प्रायोगिक समाधान तैयार करें और लोड करें

  1. 140 माइक्रोन 0.5 एमएम फ्लोरोसेंट डाई सॉल्यूशन को फ्लोरोसेंट डाई स्टॉक (5 एमएम) के 14 माइक्रोन और एमएच2 मीडिया के 126 माइक्रोन मिलाकर तैयार करें।
  2. 250 माइक्रोग्राम/एमएल ऑक्ससिलिन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एमएच2 मीडिया के 40 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम ऑक्ससिलिन पतला करें।
  3. 0.25 माइक्रोन फ्लोरोसेंट डाई और 0.7 एनजी/मिलीलीटर lysostaphin की अंतिम सांद्रता के साथ नियंत्रण समाधान के 130 मिलीलीटर तैयार करें। ऐसा करने के लिए, फ्लोरोसेंट डाई (0.5 एमएम), 9.12 माइक्रोन ऑफ lysostaphin स्टॉक (10 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर) और MH2 मीडिया के 130 मिलीलीटर मिलाएं।
  4. 0.25 माइक्रोन फ्लोरोसेंट डाई, 0.7 एनजी/मिलीलीटर lysostaphin, और 50 μg/ml ऑक्ससिलिन की अंतिम सांद्रता के साथ एंटीबायोटिक समाधान के 130 मिलीलीटर तैयार करें। ऐसा करने के लिए, फ्लोरोसेंट डाई (0.5 एमएम), 9.12 माइक्रोन ऑफ lysostaphin स्टॉक (10 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर), 26 मिलीलीटर ऑक्ससिलिन (250 माइक्रोग्राम/एमएल) और एमएच 2 मीडिया के 104 मिलीलीटर मिलाएं।
  5. दो 60 मिलीलीटर सीरिंज को कंट्रोल सॉल्यूशन के साथ और दो 60 एमएल सीरिंज को एंटीबायोटिक सॉल्यूशन के साथ भरें। रिएजेंट्स के प्रकाश-प्रेरित क्षरण से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे समाधान रखें।
    ट्यूबिंग के फ्लशिंग के कारण नुकसान के लिए सीरिंज को ओवरफिल करें।
  6. सीरिंज से हवा के बुलबुले को फ्लिकिंग करके निकालें। प्रयोगात्मक समाधान के साथ टिप करने के लिए इनपुट ट्यूबिंग संलग्न और भरें।
  7. पंप पर माउंट सीरिंज। सिरिंज को सबसे छोटी मात्रा के साथ पहले रखें, फिर प्लंजर स्थिति को लॉक करें। पंप पर सीरिंज के बाकी फिट, आवश्यक के रूप में उनके प्लंजर फैलाएंगे ।
  8. पंप की गति 1 मिलीलीटर/मिनट और पंप की मात्रा 60 मिलीलीटर तक सेट करें। पंप के साथ फ्लश करें जब तक कि सभी सीरिंज से तरल की एक सतत धारा न देखे।

7. माइक्रोस्कोप के तहत प्रवाह सेल की स्थापना

  1. अपकेंद्रित्र से प्रवाह कोशिका को हटा दें और इसे माइक्रोस्कोप चरण(चित्रा 3)पर माउंट करें।
  2. प्रत्येक प्रवाह सेल चैनल (प्रति चैनल एक इनपुट/एक आउटपुट) में इनपुट/आउटपुट ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
    चार अलग - अलग कंटेनरों में आउटपुट इकट्ठा करने से अलग - अलग चैनल आउटपुट वॉल्यूम की माप की अनुमति देता है

8. 60 मिनट प्रयोग चलाएं

  1. चरण 2.5 से प्रस्तावित पदों की जांच करें। यदि माइक्रोस्कोप फ़ील्ड-ऑफ-व्यू चैनल पर केंद्रित नहीं है और/या आउट-ऑफ-फोकस है, तो सेटिंग्स को समायोजित करें और नई स्थिति को सहेजें ।
    लोडेड बैक्टीरिया के उच्च घनत्व के कारण प्रवाह शुरू होने से पहले सटीक ध्यान केंद्रित करना संभव नहीं हो सकता है।
  2. चरण विपरीत अधिग्रहण समय को 10 मेससेक और फ्लोरेसेंस अधिग्रहण समय 1,600 मेससेक निर्धारित करें।
  3. प्रवाह शुरू करने से पहले प्रत्येक स्थिति के लिए चरण विपरीत और फ्लोरेसेंस छवियां प्राप्त करें।
    इससे लोडेड बैक्टीरियल डेंसिटी का गुणात्मक अनुमान मिलता है।
  4. तरल प्रवाह शुरू करें और तुरंत जांचें कि माइक्रोस्कोप चैनलों के नीचे पर केंद्रित है।
  5. प्रवाह के पहले मिनट के भीतर लक्ष्य क्षेत्रों के चरण विपरीत और फ्लोरेसेंस छवियों को लें।
  6. 60 मिनट के प्रवाह तक छवियों के पहले सेट के बाद हर 2 मिनट छवियों को प्राप्त करें। आवश्यक के रूप में फिर से ध्यान केंद्रित करें।

9. प्रवाह सेल कीटाणुरहित करें

  1. एक बीकर (100 मिलीलीटर) में 10% ब्लीच समाधान बनाएं। 10 मिलीलीटर मिश्रण के साथ 4 x 20 मिलीलीटर सीरिंज भरें। सीरिंज को डिबबल करें और उन्हें फ्लो सेल से अटैच करें।
    चैनलों को बैक्टीरिया से स्पष्ट होने में ~ 1-2 मिनट लगेगा।
  2. पंप की गति को 1 मिलीलीटर/मिनट और पंप की मात्रा 3 मिलीलीटर तक सेट करें। 3 मिनट के लिए चलाते हैं।
  3. 60 मिलीलीटर डीआई पानी के साथ 4 x 60 मिलीलीटर सीरिंज भरें। सीरिंज को डिबबल करें और उन्हें फ्लो सेल से अटैच करें।
  4. पंप की गति 1 मिलीलीटर/मिनट और पंप की मात्रा 30 मिलीलीटर तक सेट करें। 30 मिनट के लिए चलाते हैं ।
  5. माइक्रोस्कोप के नीचे चैनल की सफाई की निगरानी करें।
  6. प्रवाह कोशिका को अलग करें। इस्तेमाल किए गए एपॉक्सी स्लाइड को छोड़ दें। डीआई पानी में प्रवाह कोशिका घटकों को 20 मिनट के लिए भिगो दें।

10. छवियों का विश्लेषण और डेटा उत्पन्न

  1. प्रत्येक छवि में बैक्टीरिया की संख्या गिनें।
    ओपन एक्सेस सॉफ्टवेयर, सेलप्रोफिलर का उपयोग बैच इमेज प्रोसेसिंग16करने के लिए किया जाता है। सेलप्रोफिलर दिनचर्या की एक उच्च स्तरीय रूपरेखा तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत की गई है। फेज कंट्रास्ट इमेज (एनपी)में मौजूद बैक्टीरिया की संख्या टोटल बैक्टीरियल काउंट देती है। फ्लोरेसेंस इमेज (एनएफ)में दिखाई देने वाले बैक्टीरिया की संख्या मृत बैक्टीरिया का नंबर देती है।
  2. समय के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत जीवाणु कोशिका मृत्यु प्रतिशत की गणना करें।
    1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में व्यक्तिगत छवियों के लिए एनएफ और एनपी आयात करें।
    2. प्रत्येक चैनल में मृत बैक्टीरिया के अंश की गणना टी = टी पर अंश (एनएफ/एन पी)द्वारा दिए गए एक विशिष्ट समय बिंदु पर करें ।
    3. नियंत्रण और प्रयोगात्मक चैनलों दोनों के लिए प्रयोग (टी = 1 मिनट) के शुरू में मौजूद मृत बैक्टीरिया के अंश को घटाएं।
    4. निम्नलिखित समीकरण के साथ प्रत्येक समय बिंदु पर प्रयोगात्मक चैनल में मौजूद उस से नियंत्रण चैनल में मौजूद मृत बैक्टीरिया के अंश को घटाना:

      Data Analysis Equation

    5. प्रयोग के पाठ्यक्रम के लिए ग्राफ डीपीआदर्श बनाम टी।
      ध्यान दें कि 1% से अधिक सेल डेथ प्रतिशत वाला नमूना अतिसंवेदनशील माना जाता है, जबकि 0.5% से कम मौत प्रतिरोध का संकेत है। प्रतिशत है कि इन दो कट-नापसंद के बीच गिर अनिश्चित माना जाता है और नमूना फिर से परीक्षण किया जाना चाहिए ।
    6. विभिन्न प्रयोगों के परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करने और विश्लेषण करने के लिए स्प्रेडशीट का उपयोग करें।

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Representative Results

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चित्रा 4 में प्रस्तुत किए गए डेटा में एंटीबायोटिक युक्त माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में समय के साथ अतिसंवेदनशील स्टेफिलोकोकस ऑरियस स्ट्रेन की प्रतिक्रिया दिखाई जाती है । चरण विपरीत छवियों को 1 मिनट पर और 1 घंटे के प्रयोग के अंत में आंकड़े 4ए और बीमें दिखाया गया है । विश्लेषण 1 घंटा डेटा लाल (५,८२८ कुल) में हाइलाइट बैक्टीरिया के साथ चित्रा 4C में दिखाया गया है । इसी फ्लोरेसेंस छवियों को आंकड़े 4D और में दिखाया गया है। विश्लेषण 1 घंटा डेटा चित्रा 4F में लाल (१७४ मृत) में प्रकाश डाला फ्लोरेस्किंग बैक्टीरिया के साथ दिखाया गया है ।

छवियों का यह सेट कई बिंदुओं को दिखाता है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रयोग के अंत तक फ्लोरेस्किंग बैक्टीरिया की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि देखी जाती है (आंकड़े 4D और में 1 मिनट और 60 मिनट पर उज्ज्वल फ्लोरोसेंट स्पॉट की संख्या की तुलना करें), जो चैनल के अंदर सेल मृत्यु को इंगित करता है। ये परिणाम अतिसंवेदनशील तनाव के संकेत हैं।

नोट करने के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु ऊपर समीकरण में उपयोग किए जाने वाले सामान्यीकरण की आवश्यकता है। व्यक्तिगत एपॉक्सी स्लाइड कोटिंग्स की स्टोचस्टिक गैर-समानता के कारण, निरंतर कतरनी दबाव (आंकड़े 4 ए और बीकी तुलना) के तहत पूरे प्रयोग में बैक्टीरियल सेल हानि हो सकती है। इस भिन्नता के लिए खाते में, मृत कोशिका आबादी की प्रत्येक फ्लोरेसेंस छवि को एक ही समय बिंदु (1 सेकंड के भीतर) कुल सेल आबादी देने वाली सह-अधिग्रहीत चरण विपरीत छवि के साथ सामान्यीकृत किया जाता है।

प्रयोग की शुरुआत में सामान्यीकृत फ्लोरेसेंस को घटाकर एक और सामान्यीकरण किया जाता है (टी = 1 मिनट) अन्य सभी समय बिंदुओं (टी = टी) से। 1 मिनट में मृत कोशिका फ्लोरेसेंस प्रयोग की शुरुआत से पहले सेल डेथ से मेल खाती है। एमएसएसए या एमआरएसए के लिए प्रयोग की शुरुआत में मनाया गया उच्च फ्लोरेसेंस आमतौर पर बैक्टीरियल संस्कृति की खराब स्थिति को इंगित करता है। दुर्लभ अवसरों पर, यह पीडीएमएस स्लाइड के प्रदूषण का प्रतिनिधित्व करता है।

छवियों के नीचे कोनों पर इनसेट दोनों कच्चे और विश्लेषण छवियों से बॉक्स्ड छवि क्षेत्रों के बढ़े हुए संस्करण हैं। इन विस्तार से पता चलता है कि हमारे गिनती एल्गोरिथ्म घनी आबादी चरण विपरीत छवियों की तुलना में फ्लोरेसेंस छवियों में व्यक्तिगत बैक्टीरिया की सही गिनती में अधिक सफल है ।

मृत कोशिका दाग व्यक्तिगत मृत बैक्टीरिया के लिए एक उच्च फ्लोरेसेंस विपरीत देता है। चूंकि फ्लोरेस्किंग बैक्टीरिया की संख्या शायद ही कभी कुल संख्या के 5% से बढ़कर होती है, इसलिए पृष्ठभूमि की तुलना में प्रत्येक जीवाणु बहुत उज्ज्वल होता है। इस कारण से फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया को आसानी से उच्च स्तर की सटीकता के साथ गिना जा सकता है। दूसरी ओर, बैक्टीरिया चरण विपरीत छवि पर घनी पैक कर रहे हैं। इसके अलावा, एक जीवाणु के भीतर चरण विपरीत हमेशा एक समान नहीं होता है। ये दोनों कारक एक गिनती एल्गोरिदम के लिए एक चुनौती पेश करते हैं क्योंकि यह उनके अनुमानित आकार पर्वतमाला और तीव्रता के आधार पर विभिन्न क्षेत्रों की थ्रेसिंग पर निर्भर करता है।

इसलिए, प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना करने के लिए, विभिन्न प्रयोगों में एक ही मापदंडों के साथ एक ही गिनती एल्गोरिदम का उपयोग करना आवश्यक है। यह देखने लायक है कि फ्लोरेसेंस की कम संख्या के कारण, फ्लोरेसेंस मिसकाउंट के लिए उच्च संवेदनशीलता है; इसलिए चरण विपरीत छवियों की तुलना में फ्लोरेसेंस छवियों को सही ढंग से गिनना अधिक महत्वपूर्ण है।

अंत में, ऊपर दिए गए समीकरण के अनुसार एमएसएसए और एमआरएसए डेटा सामान्यीकृत तीन अलग-अलग प्रयोगों के लिए चित्र 5 में दिखाए गए हैं। प्रतिरोधी उपभेदों के लिए उम्मीद के अनुसार, सामान्यीकृत कोशिका मृत्यु परिमाण में कम होती है (<0.5%) और प्रयोग के दौरान नहीं बदलता है। अतिसंवेदनशील उपभेदों सेल मृत्यु में लगातार वृद्धि और प्रयोग के अंत तक एक उच्च मूल्य (>1%) दिखाते हैं । अतिसंवेदनशील उपभेदों के लिए सेल मृत्यु की शुरुआत प्रयोगों के बीच थोड़ी भिन्न होती है, लेकिन आमतौर पर 10-30 मिनट के बीच रहती है।

Figure 1
चित्रा 1. पीडीएमएस लेयर में माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की ज्यामिति और आकार दिखाने वाली तस्वीर। चैनलों के संकीर्ण खंड 3.7 सेमी लंबे, 200 माइक्रोन लंबा और 400 माइक्रोन चौड़ा हैं।

Figure 2
चित्रा 2। एक सीएडी मॉडल जो प्रत्येक प्रवाह कोशिका घटकों और उनके सापेक्ष पदों को दर्शाता है।

Figure 3
चित्र 3। माइक्रोस्कोप और सिरिंज पंप के प्रायोगिक सेट-अप को दिखाने वाली तस्वीर।

Figure 4
चित्र 4. एंटीबायोटिक युक्त चैनल के भीतर एक प्रतिनिधि एमएसएसए तनाव के लिए चरण विपरीत (ए-सी) और फ्लोरेसेंस (डी-एफ) छवियां। इनसेट बॉक्स्ड क्षेत्रों की बढ़ी हुई छवियों को दिखाते हैं। माइक्रोस्कोप छवियों को 60X आवर्धन पर अधिग्रहीत किया गया था। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। सामान्यीकृत कोशिका मृत्यु प्रतिशत बनाम समय दिखाने वाला ग्राफ। एमएसएसए और एमआरएसए उपभेदों में से प्रत्येक का परीक्षण तीन अलग-अलग प्रयोगों में किया गया था।

Table 1
तालिका 1. स्वचालित बैक्टीरिया गिनती के लिए सेलप्रोफिलर नियमित घटक।

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Discussion

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प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मैथिसिलिन-संवेदनशील और मैथिसिलिन प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस 10उपभेदों के साथ प्रयोगों के एक सेट में मान्य और अनुकूलित किया गया था। इसलिए, संशोधन के बिना यह प्रोटोकॉल सीधे एस ऑरियस और अन्य एंटीबायोटिक दवाओं के अन्य उपभेदों पर लागू होना चाहिए, जिसमें बैक्टीरियल सेल वॉल बायोसिंथेसिस को प्रभावित करने वाली कार्रवाई के तंत्र हैं। एस ऑरियस के अलावा अन्य बैक्टीरिया प्रकार तनाव मापदंडों में भिन्नता की आवश्यकता हो सकती है: घुलनशील (एंजाइमेटिक) और यांत्रिक तनाव। यदि सोलबल स्ट्रेसर स्टेफिलोकोकस के अलावा अन्य जीवाणु प्रजातियों के परीक्षण में वांछित हैं, तो एक और तनाव एजेंट की आवश्यकता होगी, क्योंकि lysostaphin एक स्टेफिलोकोकल-विशिष्ट एंजाइम है।

कतरनी तनाव की मात्रा तरल की प्रवाह दर के आनुपातिक है और चैनल के आकार के विपरीत आनुपातिक है, इसलिए सिद्धांत रूप में यह मूल्यों की एक बड़ी श्रृंखला के भीतर विविध किया जा सकता है । तनाव के प्राप्त मूल्य निम्नलिखित प्रयोगात्मक कारकों द्वारा सीमित हैं: उच्च प्रवाह दरों के तहत बैक्टीरिया को रखने के लिए स्थिरीकरण सब्सट्रेट की क्षमता, लीक किए बिना उच्च दबाव को बनाए रखने वाली माइक्रोफ्लुइडिक असेंबली, सिस्टम के अंदर तरल प्रवाह प्रतिरोध, जो प्रवाह दर को अस्थिर बना सकता है या यहां तक कि इसे कम प्रवाह दरों पर रोक सकता है। बाइंडिंग की ताकत एस ऑरियस प्रयोगों के लिए पर्याप्त थी, लेकिन प्रवाह दर या बैक्टीरियल प्रजातियों के परिवर्तन में वृद्धि के लिए एक अलग कोटिंग प्रकार की आवश्यकता हो सकती है। एपॉक्सी-लेपित स्लाइड पारंपरिक रूप से प्रोटीन माइक्रोएरी विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं और विशेष रूप से बड़ी सेलुलर वस्तुओं को पकड़ने के लिए डिज़ाइन नहीं किए जाते हैं। चूंकि कोटिंग का निर्माण और घनत्व मालिकाना है, इसलिए नियंत्रित सतह कोटिंग जमाव के साथ वैकल्पिक सूत्रों का विकास अत्यधिक वांछनीय है।

हमने हाल ही में पाया है कि बैक्टीरियल कल्चरिंग और अटैचमेंट के लिए जरूरी समय की मात्रा काफी कम की जा सकती है । कालोनियों को तीन घंटे के भीतर मीडिया की एक छोटी मात्रा में एक आगर प्लेट से सीधे चरण लॉग करने के लिए उगाया जा सकता है, रातोंरात संस्कृति कदम को नष्ट करने । इसके अतिरिक्त, लगाव एक मिनट के लिए प्रवाह कोशिका के अंदर बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र द्वारा त्वरित किया जा सकता है, ४५ मिनट बसने समय को हटाने । हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग वर्तमान में इस संक्षिप्त प्रोटोकॉल के साथ चलाए जा रहे हैं ।

हालांकि प्रोटोकॉल विशेष रूप से बैक्टीरियल सेल वॉल बायोसिंथेसिस को लक्षित करने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के लिए डिज़ाइन किया गया है, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं में विभिन्न प्राथमिक लक्ष्यों वाले एंटीबायोटिक्स एक ही डाउनस्ट्रीम बैक्टीरियल रिस्पांसपाथवे 17,18को सक्रिय करते हैं। इसलिए, हमारी विधि एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशीलता की तेजी से पहचान के लिए लागू हो सकती है जो सेल वॉल बायोसिंथेसिस से असंबंधित बायोसिंथेटिक रास्तों को लक्षित करती है, और हमारी प्रयोगशाला में प्रारंभिक अध्ययन इस परिकल्पना को बल देते हैं।

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Disclosures

माइक्रोफ्लुइडिक विधि पेटेंट लंबित है: सॉर-बज ए, शेरोन ए, कलाश्निकोव एम, विर्ज एच, अन्वेषक; बैक्टीरियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध/संवेदनशीलता पेटेंट पीसीटी/US10/33523 का तेजी से पता लगाने के लिए विधि और उपकरण ।

Acknowledgments

हम विनिर्माण नवाचार के लिए Fraunhofer केंद्र में इंजीनियरों और छात्रों का शुक्रिया अदा करते हैं । प्रयोगात्मक प्रणाली के डिजाइन, मशीनिंग और स्वचालन में मदद करने के लिए, हम एंड्रियास प्रिंसेन, होल्गर विर्ज, डौग फॉस, डेविड चार्गिन और डॉ सुडोंग शू का धन्यवाद करते हैं। हम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा संग्रह के परीक्षण में मदद के लिए जूलिया कुककार्ट्ज़, मेलानी ज़िमरमैन, निको क्राएत्जमार, टिम गम्बेल, जोश विल्नुएवा, मिनोरी शिमिज़ू और कैटरीना कुलिगा को धन्यवाद देते हैं। हम सेलप्रोफिलर में छवि विश्लेषण दिनचर्या के विकास के साथ मदद के लिए हार्वर्ड और एमआईटी के ब्रॉड इंस्टीट्यूट में इमेजिंग प्लेटफॉर्म के डीआरएस ऐनी ई बढ़ई और मार्क-एंथनी ब्रे को स्वीकार करते हैं। वर्णित परियोजना पुरस्कार R21AI079474 और 1R01AI101446 द्वारा भाग में राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान से समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है । इस परियोजना को फ्रानहोफर यूएसए ने भी समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SYTOX Green Invitrogen Corporation S7020 Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, Inc A9418-5G Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate Sigma Aldrich, Inc S8750-500G Used for lysostaphin storage
Lysostaphin  Cell Sciences CRL309A Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage 
Oxacillin salt Sigma Aldrich, Inc 28221-1G Antibiotic
Mueller Hinton Broth Fisher Scientific DF0757-17-6
Sodium chloride Sigma Aldrixh S3014-500G 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe  BD (Beckton, Dickinson and Comp.) 14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe BD (Beckton, Dickinson and Comp.) 309653 - 60 mL Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 Cambridge Scientific 9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective Olympus Corp. LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera QImaging RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence PRIOR Scientific H204/H202
X/Y Stage  PRIOR Scientific H107AENN
Focus motor PRIOR Scientific H122
Joystick for XYZ control PRIOR Scientific CS152EF
Proscan Controller PRIOR Scientific H3-XY2
Image Acquisition Software Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI 3333-1044 Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window Fraunhofer CMI 3333-1054 Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm Edmund Optics Inc. NT48-543
Sealing plate BU Scientific Instruments Facility 3333-1045
Epoxide glass slide Arrayit Corporation SuperEpoxy 2
PDMS master Fraunhofer CMI 3333-1053 Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design Fraunhofer CMI 3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green  IDEX Health Science M-644-03 Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black IDEX Health Science M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural IDEX Health Science P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow IDEX Health Science P-259 Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green  IDEX Health Science 1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red  IDEX Health Science P-658

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References

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एक चिप पर तनाव प्रेरित एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण
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Kalashnikov, M., Campbell, J., Lee, J. C., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip. J. Vis. Exp. (83), e50828, doi:10.3791/50828 (2014).More

Kalashnikov, M., Campbell, J., Lee, J. C., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip. J. Vis. Exp. (83), e50828, doi:10.3791/50828 (2014).

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