Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

Вируса болезни Ньюкасла (NDV) была тщательно изучена в последние несколько лет, чтобы развить новые векторы для вакцинации и терапии, среди других. Эти исследования стало возможным благодаря методов по спасению рекомбинантный вирус из кДНК, таких, как мы описываем здесь.

Abstract

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), член прототип Avulavirus рода семьи Paramyxoviridae 1, является несегментированная, отрицательной смысл, одноцепочечной, окутан РНК вируса (рис. 1) с потенциальными приложений в качестве вектора для вакцинации и лечение заболеваний человека. В глубокое исследование этих приложений стало возможным только после установления обратных методов генетики, чтобы спасти рекомбинантных вирусов из плазмид, кодирующих их полных геномов как кДНК 2-5. Вирусный кДНК может быть удобно модифицировать в пробирке с помощью стандартных процедур клонирования, чтобы изменить генотип вируса и / или включить новые транскрипционные единицы. Спасение таких генетически модифицированных вирусов представляет собой ценный инструмент, чтобы понять факторы, влияющие несколько этапов инфекции, а также позволяет для развития и совершенствования векторов для экспрессии и доставки антигеновдля вакцинации и терапии. Здесь мы опишем протокол для спасения рекомбинантных NDVs.

Introduction

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), птичий парамиксовирус, принадлежащая к роду Avulavirus 1, является экономически актуальны и таким образом широко исследованы и прослушивала зоонозных агент, который может серьезно повлиять на птицеводство по всему миру. Хотя это и не человеческий патоген, НДВ также хорошо изучены за пределы поля ветеринара и как модели парамиксовируса и из-за его высокой интересных, природных онколитических свойств 6. Исследование NDV большую пользу от развития обратных методов генетики для одноцепочечными, несегментированная отрицательной смысловой РНК вирусов, впервые описанных для вируса бешенства по Конзельманн и Вашии коллегами 2. Разнообразие генетически модифицированных NDVs, проведение чужеродных генов или модификации их дикого типа генома были широко изучены до сих пор. Работа с этих рекомбинантных вирусов имеет решающее значение для характеристики различных факторов вирулентности не только NDV но и другой соответствующей Хуман патогенов, таких как вируса гриппа А 7 - или возникающих Нипах вируса 8. Кроме того, ряд различных исследований исследовали использование этих методов для улучшения врожденную противоопухолевую активность NDV 6,9,10, в основном путем повышения иммуностимулирующие свойства вируса. Другая соответствующая область исследований на рекомбинантных NDVs было поколение вакцин-кандидатов против других вирусных заболеваний, таких как грипп 5,11,12, 13 ВИЧ кори 14, 15 SARS, или что вызвано дыхательных sincytial вируса (RSV) 16. Среди различных примечательных преимуществ, предоставляемых по NDV являются отсутствие существовавшие ранее иммунитета в человеческих популяциях, стабильность иностранных генетических вставок, отсутствия recombinatory деятельности и общих высоким профилем безопасности в сочетании с вышеупомянутым естественных иммуностимулирующих свойств 17. Стоит также отметить, потенциальное использование рекомбинантных двухвалентных вакцин в рoultry, защищает от обоих NDV и высокопатогенного гриппа птиц вирусы 11,12. Это может быть отличным способом, чтобы уменьшить шансы последнего распространяется от дикой к домашним животным, таким образом, также помогает предотвратить возможную межвидовой скачок страшного птичьего гриппа для человека. Наконец, репортер-выражения NDV были использованы для оценки врожденных иммунных реакций, а также идентификации интерферона антагониста, кодируемого нескольких вирусов 18-27.

Спасение процесс рекомбинантной несегментированная, вирус отрицательной мель РНК в основном состоит на искусственно заставляя вирусную цикл репликации в производящей клетки путем трансфекции кДНК, кодирующей минимальный инфекционный молекулярные машины, известной как рибонуклеопротеидных или RNP (рис. 2). В RNPs состоять из вирусной полимеразы (P и L белков), нуклеопротеина (NP) и полной длины антигеномного РНК вируса. Эта РНК + antigenome-йэ шаблон необходим для генерации дополнительных РНК-геномов, которые, также связанных с остальной частью белков вирусной RNP, повторяет тот же инфекционный комплекс, который естественным вирус бы выпустить на цитоплазме клетки при инфекции (рис. 2А ). От этого шага года, вирусная цикл может продолжаться естественным и рекомбинантные вирионы, encapsidating измененные геномы, будет генерироваться (рис. 2б). Примечательно, что трансфекции геномной кДНК вместо антигеномного кДНК значительно ухудшает или полностью отменяет эффективности спасательных 2,28-30. Даже когда антигеномного кДНК трансфицируют, эффективность капсидировани рекомбинантного РНК в РНП в трансфицированных клетках, вероятно, очень низка. Из-за этого, спасательные протоколы для NDV часто включают в себя различные шаги для амплификации нескольких вирусных частиц, выпущенных из первоначально трансфицированных клеток на сокультивировани их разрешающих клеток и / илиинфекция в яйцах с зародышем.

До спасения, кДНК можно манипулировать с помощью стандартных процедур клонирования в целях получения желаемых изменений. Хотя конкретные мутации различных генных продуктов и регуляторных последовательностей вируса может быть прямо достигается таким образом, многие из опубликованных работ с участием рекомбинантных NDV потребовало добавление нового единицы транскрипции в геном NDV. Как и другие члены семейства парамиксовирусов, геном НДВ кодирует восемь различных белков в шести транскрипционных единиц, которые по-разному выраженных в зависимости от их местонахождения относительно 3 'конца в убывающей градиентом критической для жизненного цикла вируса 1. Из-за этого, расположение нового транскрипционной единицы внутри генома должны быть тщательно подобраны, чтобы достичь баланса между экспрессии трансгена и ухудшение вирусной репликации. Вносимые между Р и М генов был использован самый, тHough другие сайты также были протестированы 13,31.

Какой бы ни была вставка, клонирование в НДВ кДНК необходимо следовать некоторым правилам, чтобы генерировать rescuable конструкцию: (I) любой новый ген, которые будут включены в геном NDV должен находиться под контролем соответствующих сигналов для вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы. Эти последовательности должны быть добавлены перед новой открытой рамки считывания (ORF), так полимераза может распознать конец предыдущей гена (GE) и началом нового трансгена (GS), расположенных на одной нуклеотидной межгенной последовательности (Ig) . Добавление действительного Козак (К) последовательности, чтобы улучшить эукариотической перевод рибосомальную также рекомендуется для лучшего выражения инородного белка 32; (II) эффективное тиражирование NDV, как и для большинства членов семьи Paramyxoviridae, зависит от длины генома быть кратна шесть 33, поэтому любая вставка в NDV должен следовать этому "правилу шести". При необходимости REQuired дополнительные нуклеотиды могут быть добавлены по потоку новый ORF, и (III) последовательность трансген должен быть проверен, чтобы найти можно GE и GS, такие как последовательности, которые могут ухудшить эффективность спасательных, экспрессию трансгена и / или вирусов жизнеспособность. Если присутствуют, эти последовательности должны быть удалены немого мутагенеза. Генерация рекомбинантного кДНК полной длины следующей вышеупомянутые правила является первым шагом для того, чтобы эффективно производить генетически модифицированного NDV как подробно здесь.

В системе все конструкции ДНК находятся под контролем полимеразы Т7 РНК промотора (рис. 3). Это цитоплазматический полимеразы приведена в транс по ко-инфекции с рекомбинантным модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA-Т7) 34. Фиг.3А показывает pNDV-B1 плазмиду, кодирующую полноразмерную кДНК антигеномного 5. Фиг.3В показывает Ptm1 плазмидами, кодирующими NP, P и L ОРС. Плазмиды pCITE-GFP, который кодирует, UNDER промотор Т7, зеленый флуоресцентный белок (GFP), и pCAGGs GFP 18, который кодирует ту же самую ORF под курица бета промотор актина 35, используют в качестве контрольной группы. В этом протоколе мы покажем процедуру, чтобы спасти рекомбинантный NDV из кДНК со сниженной вирулентностью НДВ штамм Hitchner B1 5 (рис. 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клетках млекопитающих (фиг. 4А, день 1)

Сплит Нер-2 или А549 за день до трансфекции в 6-луночных планшетах. Плотность клеток должна достичь 80-90% слияния на следующий день. Как правило, сливающийся 100 мм блюдо можно разделить на 8 скважин (около 1 × 10 6 клеток на лунку). Для каждого вирус быть спасены, 2-4 различных скважин должны быть включены, а также две дополнительные скважины для управления pCAGGs-GFP и GFP pCITE-18, направленные контролировать эффективность трансфекции и инфекции MVA-T7, соответственно.

2. Заражение клетках млекопитающих с рекомбинантной модифицированной коровьей оспы Анкара вирусов выражая бактериофага Т7 РНК-полимеразы (МВА-T7) (рис. 4А, 2-й день)

  1. Разминка PBS 1x/BA/PS и СМИ при 37 ° С
  2. Вымойте клеток, в два раза, с 1 мл PBS 1x/BA/PS.
  3. Заразить культивируемых клетках млекопитающих с вирусом MVA-T7 при множественности заражения (МВД) 1 КОЕ / клетку в конечном объеме 200 мкл в ЗФР ​​/ BA / PS течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Во время вирусной инфекции инкубации подготовить трансфекции смесь, как описано в 3.

3. Трансфекция клеток млекопитающих (рис. 4А, 2-й день)

  1. Подготовка Lipofectamine: Смешать 1-2 мкг LPF2000 250 мкл OptiMEM в спасательной и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Получение ДНК: Создать плазмиды коктейль для каждого помощь в 50 мкл OptiMEM. Добавить 0,4 мкг Ptm1-NP, 0,2 мкг Ptm1-P, и 0,2 мкг Ptm1-L на пробирку. Добавить 1 мкг полноразмерного кДНК клона NDV быть спасенной в каждую пробирку. Также подготовить два трансфекций управления, один с 2 мкг pCAGGs-GFP (проверить эффективность трансфекции), а другая с 2 мкг pCITE-GFP (проверить полимераза Т7 приводом выражение на MVA-T7).
  3. После того как раствор LPF2000-OptiMEM был предварительно инкубировали в течение 5 мин (шаг 3.1), добавить 250мкл раствора в пробирки ДНК (шаг 3,2) и инкубируют в течение 20-30 мин при комнатной температуре.
  4. После инкубации с MVA-T7, удалить вирус прививочный стремлением и заменить на ДНК-LPF2000 трансфекции смеси (шаг 3.3).
  5. Добавить 1 мл DMEM 10% FBS / PS к каждому блюду.
  6. Выдержите зараженные / трансфекции клеток в течение 6-8 часов (или на ночь) при 37 ° С, 5% СО 2, а затем заменить трансфекции СМИ с 1,5 мл свежей DMEM 10% FBS / PS.
  7. Через 24 часа после трансфекции, контрольные лунки можно наблюдать под флуоресцентным микроскопом, чтобы оценить эффективность трансфекции (pCAGGs-GFP) и полимеразную активность Т7 (pCITE-GFP) (фиг.5А). Продолжайте совместного культивирования инфицированных / трансфицированных клеток фибробластов с птичьего как описано ниже.

4. Совместное культивирование клеток млекопитающих с клетки птиц (рис. 4А, 3-й день)

Как правило, сливающийся 100 мм тканевой культуры блюдо из курицы (CEFs) ог утки (DEFS) фибробласты эмбриона используется в двух трансфектированных скважин. Будьте уверены, чтобы подготовиться, заранее, достаточно 100 мм культур тканей блюда птичьего клеток на все попытки спасателей. Для эффективного спасения вируса, DMEM 10% FBS / PS носитель с добавлением 5% аллантоисной жидкости и 30 мМ MgCl 2. В этот момент 24 ч пи, клетки млекопитающих могут начать показывать цитопатического эффекта (CPE) за счет MVA-T7 инфекции, asevident на фиг.5А.

  1. Разминка PBS 1X и средств массовой информации до 37 ° C.
  2. Вымойте клетки млекопитающих, 2x, с 1 мл PBS 1x.
  3. Trypsinize клетки млекопитающих с 0,2 мл EDTA-трипсина, пока они не отключены. Ресуспендируют клеток в 1 мл DMEM 10% FBS / PS, 5% аллантоисной жидкости, 30 мМ MgCl 2 и переход на 100 мм чашки для культивирования тканей. Добавьте 3 мл же средствах массовой информации.
  4. Промыть клетки птиц, в два раза, с 4 мл PBS 1X.
  5. Trypsinize клетки птиц по 1 мл EDTA-трипсина и инкубировали в течение 1-2 мин при 37 ° С, пока клетки отделить. Ресуспендируйте йе клетки добавляя 8 мл DMEM 10% FBS / PS, 5% аллантоисной жидкости, 30 мм MgCl 2 и добавить 4 мл трипсинизировали клеток к клеткам млекопитающих в совместном культивировании 100 мм блюдо культуры ткани для общего объема 8 мл (4 мл млекопитающих, 4 мл клетки птиц).
  6. Аккуратно встряхните рукой на совместном культивировании клеток в 100 мм блюдо, чтобы иметь равномерное распределение, а затем поместить их в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 3-4 дней. Критерии для заражения яйца 3 или 4 дня после совместного культуры млекопитающих и птиц клеток зависит от того, сколько цитопатический эффект (ячейка округление, смерть, отрыв от поверхности, и т.д..) Наблюдается в вирусной инфекции МВА-T7.

5. Заражение Куриный куриных эмбрионов (рис. 4А, Дни 6-7)

  1. Через 3-4 дней совместного культуры млекопитающих и птиц клеток, удаление 1 мл супернатанта тканевой культуры, и добавить в пробирку Эппендорфа.
  2. Центрифуга супернатанта тканевой культуры в течение 1 мин при 12000 оборотов в минуту в скамейкецентрифуга для удаления остатков клеток.
  3. Свеча яйца с использованием световой короб просвечивании, чтобы увидеть интерфейс между мешок воздуха и аллантоидной. Сделайте отметку на границе интерфейс избегая локализацию кровеносных сосудов. Спрей 70% этанола по яйцам установить стерильных условий. Аккуратно сделать отверстие в скорлупе на отмеченных месте и привить 500 мкл супернатанта с помощью инсулина (1 мл) шприц, с целью иглу вертикально и прямо в аллантоидной. (Рис. 4В).
  4. Закройте ник в яичной скорлупы с расплавленным воском или парафином.
  5. Выдержите яйца в течение 2-3 дней при 37 ° С

6. Урожай аллантоисной жидкости от зараженных Куриный куриных эмбрионов (рис. 4А, Days 8-10)

  1. Выдержите зараженные яйца на 2-4 часа или на ночь при 4 ° С, чтобы убить курицу эмбриона и коагуляции крови.
  2. Спрей яйца с 70% этанола (для поддержания стерильных условий).
  3. Осторожно коснитесь верхушечный раздел яйца, над воздушной полости, с ложкой. После того, как яичная скорлупа треснула, удалить фрагменты щипцами и полностью разоблачить аллантоисной мембрану.
  4. Expose аллантоидной путем вырезания аллантоисной мембрану пинцетом и ножницами, избегая повреждения кровеносных сосудов и желток.
  5. Осторожно надавите эмбрион с помощью шпателя и собирать восходящего потока аллантоисной жидкости (8-12 мл на яйцо) с 10 мл пипетки. Избегайте повреждения желток мембрану. Передача аллантоисной жидкости в центрифужную пробирку 15 мл на льду (использовать одну трубу на яйцо).
  6. Уточнить аллантоисной жидкости центрифугированием в течение 5 мин при 1500 оборотах в минуту. Передача супернатант в чистую пробирку, не нарушая гранул.
  7. Храните образцы при 4 ° С в течение до 1 недели, до проверки их на наличие NDV по гемагглютинации.

7. Гемагглютинации (HA) Анализ

Наличие вируса в Allantовой жидкость из инфицированных яиц может быть определена макроскопически по их способности hemagglutinate индейки эритроциты (RBC). В случае NDV, приблизительно 10 6 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл, должны дать положительный сигнал в тесте HA. HA Анализы осуществляли в виде пластин V-дно 96-луночных. Отрицательный (PBS 1x, неинфицированных аллантоисной жидкости), а также положительный (аллантоисной жидкости из любого вируса NDV) контрольные образцы должен всегда быть включен в любой HA анализа для подтверждения. Для выполнения анализа HA:

  1. 50 мкл PBS 1X на лунку в 96-луночный планшет V-дно.
  2. 50 мкл аллантоиса образцов жидкости в скважинах на первом столбце пластины. Выполнение 2-кратные серийные разведения до конца пластины и отбросить последний, дополнительные 50 мкл из лунки в последней колонке.
  3. Внесите 50 мкл 0,5% индейки РБК в PBS 1x в хорошо. Аккуратно встряхните пластину, нажав.
  4. Инкубировать при 4 ° С (или льда) Fили 30-45 мин или до получения прозрачного гранул образуется в отрицательных контрольных лунок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Спасение NDV является хорошо установленный порядок, регулярно проводится в лабораториях, которые имеют доступ к полному кДНК вируса. Тем не менее, внутренний стохастический характер метода делает его трудно достичь 100% эффективность помощь. Мониторинг ранние этапы процесса, специально эффективность трансфекции и инфекции с MVA-T7, помогает выявить возможные проблемы. Рисунке 5а стандартного трансфекции и эффективность трансфекции / инфекции, которые являются достаточно для успешного НДВ помощь. После раундов усиления в птиц-млекопитающих сокультурах и яйцах с эмбрионами, наличие спас вируса обнаруживается положительных лунок в анализе HA. НДВ вызывает гемагглютинации, связывая эритроциты и таким образом предотвращает их осаждение на дно V-образный хорошо. Таким образом, отсутствие активности HA легко можно отличить по образованию красных, круглых гранул эритроцитов (фиг.5В). Отрицательные результатыв анализе HA может быть связано с недостаточной титра вируса в аллантоисной жидкости: минимальный титр около 10 6 БОЕ / мл должен иметь положительный результат HA. Более низкие титры вируса еще может быть обнаружено с использованием специфических антител анти NDV по иммунофлуоресцентного анализа (IFA). Новый проход яиц для дальнейшей амплификации вируса, присутствующего в первой инокулированных яиц рекомендуется в этих случаях.

Рисунок 1
Рисунок 1. Организация генома вируса болезни Ньюкасла (NDV) несегментированная, одноцепочечной отрицательной смысловой РНК геном NDV является 15186 нуклеотидов (нт) в длину и кодирует восемь различных полипептидов в шести транскрипционных единиц:. Н.П., Р, М, Ж, HN и L плюс V и W белки, возник после сдвигов в рамки считывания P ORF во время транскрипции. Некодирующих, регуляторные последовательности фланггеном в его 3 '(лидер) и 5' (прицеп) заканчивается. Далее некодирующих конец гена (GE), межгенных (IG) и начала гена (GS) последовательности регулировать вирусной полимеразы деятельность в между различными ОРС. Уровни экспрессии различных генов на вирусный геном зависит от их относительное местоположение по отношению к 3'-конце (т.е. NP-транскрипты являются наиболее распространенными, L стенограммы мере), эффективно создавать градиент критической для вируса жизненного цикла 1.

Рисунок 2
Рисунок 2. Основа NDV спасения от клонированной ДНК. Схематическое сравнение между естественным (А) и искусственно индуцированного (B) цикла в процессе восстановления. (A) После прикрепления к клетке-мишени, вирус выпускает свою геномную содержание в цитоплазму encapsidated в RNPs. РНК-полимераза транскрибирует РНК-генома в различных мРНК из вирусных белков и в дополнительном, полная длина антигеномного РНК + копия, которая является шаблон для производства множественных копий оригинального генома, которые будут включены в формирующихся вирионов. (B ) В процессе спасения, компоненты RNPs (НП, P и L белков, а также полный рост, как правило, модифицированной антигеномного РНК) предоставляются кДНК трансфекции. При восстановлении из антигеномного RNPs в цитоплазме трансфицированной клетки, они могут производить взаимодополняющие, рекомбинантные геномных RNPs и целый цикл может затем начать заново, заканчивая выпуском рекомбинантных вирусов.

Рисунок 3
Рисунок 3. T7 приводом плазмиды экспрессии для генерации рекомбинантного NDV. (А) Полная длина вирусной кДНК: Чте полная длина pNDV-B1 ампициллину плазмида движущей экспрессию со сниженной вирулентностью NDV штамма Hitchner B1 antigenome под Т7 промотора Т7 (С), и последовательность терминатора T7 (T7 T), содержащей гепатита дельта рибозим (HDR) расщепления. PNDV-B1 был первоначально предназначен для перевозки иностранных вставки между Р и М генов 5. Введение нового гена (сайт XbaI) требует добавления регулирующего конце гена (GE), межгенная (ИГ) и начало гена (GS) последовательностей, чтобы позволить его функциональное признание вирусной полимеразы. Эффективность экспрессии трансгена может быть улучшено с добавлением Козака (K) выше по потоку последовательности стартового кодона 32. Вся кассета вводится в НДВ кДНК должен иметь общее число нуклеотидов делится на шесть, чтобы следовать «правилу шести" 33, который приводит эффективную репликацию большинства paramyxovius геномов (B) экспрессии белка плазмиды:. Вирусный NP, P, и L ОРС, по бокамна промотора Т7 (Т7 P), UTR вируса энцефаломиокардита (EMC) и Т7 терминатор (T T7) последовательности были клонированы в Ptm1 основой ампициллину вектора 5,36.

Рисунок 4
Рисунок 4. Плазмиды на основе обратной генетики методы генерации рекомбинантный вирус ньюкаслской болезни. (А) Вирусный спасения: А549 или Нер-2 клетки инфицируют модифицированный вирус коровьей оспы Анкара выражая бактериофага Т7-полимеразы (МВА-Т7). После вирусной инфекции клетки совместно трансфицируют с экспрессионной плазмиды, необходимого для репликации и транскрипции вирусного генома NDV (NP, P, и L), вместе с полной длины кДНК NDV, в соответствии с промотором Т7. Двадцать четыре часа post-infection/transfection, клетки млекопитающих культивируют совместно с куриными или утка эмбриональных фибробластов (CEF иDEF, соответственно). Три-в-четыре дня после совместного культивирования, 8-10 дневного возраста куриные куриных эмбрионов засевают с ткани культуральной жидкости с совместным культивированием клеток для дальнейшего усиления. Два-три дня после инкубации 8-10 дневных яиц при 37 ° С, аллантоисной жидкости из яиц собирают и анализируют на успешное спасение рекомбинантного вируса по HA анализа. Положительные (+) спасательные вирусы дополнительно характеризуются в геномной (RT-PCR) и белка (например, иммунофлуоресценции (IFA) и вестерн-блот (ВБ уровни) Отрицательный (-). HA результаты могут быть из-за отсутствия достаточного количества вирусов, которые будут . обнаружены HA повторного заражения свежих куриных яиц с эмбрионами для амплификации вируса указывается (В) Заражение куриных яиц с эмбрионами:. 8-10 куриные куриных эмбрионов являются просвете, чтобы отметить интерфейс между мешок воздуха и аллантоидной с инсулином. (1 мл) шприц, яйца заражены супернатанта клеточной культуры внутри аллантоисной Кавити, как указано.

Рисунок 5
Рисунок 5. Представитель результаты. (А) Трансфекция и эффективность инфекции МВА-T7: представитель люминесцентные (слева) и яркие (справа) поля А549 трансфекцированных pCAGGS-GFP (вверху) или инфицированных MVA-T7 и трансфекцированных pCITE-GFP (внизу) проиллюстрированы . Учредительный выражение GFP обусловлен pCAGGS является показателем эффективности трансфекции, тогда как промотор Т7 приводом выражение GFP по pCITE является элементом управления для МВА-Т7-инфекции и полимеразной активности Т7. Клетки были обследованы на 24 ч post-transfection/post-infection (В) гемагглютинации (HA): наличие вирусных частиц в аллантоисной жидкости вызывает гемагглютинации, который показан на отсутствие осадка в нижней части формы V хорошо. Отсутствие вируса позволяет формирование красного осадка в нижней части гое хорошо. Рисунок показывает как меры регулирования необходимы для любого анализа HA (отрицательный, чистый аллантоисной жидкости; положительной, уже характеризуется образца НДВ), и результаты трех образцов неизвестных полученных после спасения, с двумя положительной (+) и один отрицательный (-) результат.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несколько факторов должны быть рассмотрены для достижения хороших результатов во время спасения NDV. Во-первых, кДНК полной длины конструкция для использования должна быть разработана, чтобы позволить функциональное включение новых модификаций / трансгенов в геном NDV. Это означает, как указано выше, что (I) соответствующий конец гена (GE), Межгенный (IG) и включите ген (GS) последовательности должны быть добавлены, если это необходимо; (II) нет предполагаемые последовательности GE или GS в иностранной Ген, и (III) полное рекомбинантный геном следует «правило шести".

Что касается процесса спасения, качество плазмиды препаратов, запасы МВА-T7, а также надлежащее обслуживание клеток имеют решающее значение. Для большинства случаев, стандартный очистки максипреп из ДНК плазмиды достаточно, хотя трудные клонирования и спасательные процессы, из-за размера и характера трансгенов, может быть улучшена путем очистки ДНК через CsCl центрифугирования в градиенте плотности. Эффективность трансфекции с помощью Lipofectamine обычно достаточно для успешного спасения, хотя другие способы трансфекции, такие как nucleofection также могут быть использованы. В любом случае, соотношение различных плазмид должна быть строго поддерживается (0.4:0.2:0.2:1 для NP-PL-pNDV, соответственно). В связи с трудоемкой и так или иначе стохастического характера процесса восстановления, по крайней мере 2-4 различных скважин следует трансфицировали в конструкции быть спасены, и различные клоны той же конструкции следует анализировать.

В протоколе, который мы описали здесь мы используем MVA-T7, чтобы обеспечить в транс-Т7 полимеразы, необходимую для экспрессии вирусных конструкций кДНК. Хотя это стандартная процедура в нашей лаборатории, это не единственный возможный подход. Например, другие группы успешно спасены NDV и другие не сегментированные, негативные вирусы нить РНК с помощью клеточных линий конструктивно выражать высокие уровни T7-полимеразы 4,37. Наличие рекомбинантного вектораили клеточная линия кодирования полимераза Т7, а также конкретных результатов деятельности любом подходе в данной лаборатории, должны быть учтены при создании заново спасательной системы для NDV.

После определения НДВ присутствия в аллантоисной жидкости по ГК, дальнейшие исследования должны быть выполнены в полном объеме характеризуют недавно спасенного вируса, например, RT-PCR с последующим последовательности вирусного генома, ИФА и вестерн-блоттинг (ВБ), чтобы определить выражение из чужеродного гена (если применимо). В зависимости от характера изменений, что рекомбинантные вирусы несущих, другой вид биохимических и функциональных анализов также могут быть необходимы.

Спасение рекомбинантного NDV из кДНК является полезным методом по нескольким причинам. Первый и самый очевидный, этот метод обеспечивает возможность анализировать биологию NDV, экономически соответствующего вируса для птичьего промышленности, экспериментально изменяя свои гены и регуляторные последовательности. Северная ДакотаВ это парамиксовирус тесно связана с человеческих патогенов, таких как корь, свинка или респираторно-синцитиальный вирусов, а также выходящего, высоко патогенного Hendra и Нипах вирусов; исследования на основной жизненного цикла этого семейства вирусов важно понять их биологию. Помимо фундаментальных исследований, рекомбинантные NDVs имеют большой потенциал как вакцины и онколитических vectos, сочетая возможность проведения гены Зарубежная в их геномах с хорошо оцененной профиль биобезопасности. Для всех этих причин, Протокол спасательных НДВ может быть ценным активом для многих лабораториях по всему миру, заинтересованных в вирусной исследований, разработки вакцины и лечения рака.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Адольфо Гарсия-Састре является изобретателем патентов на рекомбинантных заболеваний вирусов Ньюкасл, которые принадлежат к Икан школы медицины на горе Синай.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить бывшие и нынешние участники в лабораториях доктора. Питер Палезе и Адольфо Гарсия-Састре для развития NDV обратной генетики методы и для оказания технической помощи. Исследования в вируса болезни Ньюкасла в AG-S лаборатории частично финансируется NIAD предоставить R01AI088770 и Министерства национальной науки и технологий безопасности Центра повышения квалификации для развивающихся и Болезни Зоонозных животных (CEEZAD, награда номер 2010-ST-061-AG001). Исследования в LM-S лаборатории финансируется грантами NIH РВЫХ1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, то NIAID центров передового опыта по борьбе с гриппом исследований и надзора (HHSN266200700008C) и Университета Рочестера Центр Biodefense иммунной моделирования (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Tags

Иммунологии выпуск 80, Вакцины онколитических Виротерапии Иммунитет Врожденная вируса болезни Ньюкасла (NDV) МВА-T7 обратный методы генетики плазмиды трансфекции рекомбинантный вирус HA опробования
Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A.,… More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter