Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Redning af rekombinant Newcastle Disease-virus fra cDNA

doi: 10.3791/50830 Published: October 11, 2013

Summary

Newcastle disease-virus (NDV) er blevet grundigt undersøgt i de seneste år for at udvikle nye vektorer til vaccination og behandling, blandt andre. Disse undersøgelser har været mulig på grund af teknikker til at redde rekombinant virus fra cDNA, som dem vi beskriver her.

Abstract

Newcastle disease-virus (NDV), prototypen medlem af Avulavirus slægten af familien Paramyxoviridae 1, er en ikke-segmenteret, negative-sense, single-strandede, kappeklædte RNA-virus (figur 1) med potentielle anvendelser som en vektor til vaccination, og behandling af humane sygdomme. Dybdegående udforskning af disse applikationer er kun blevet muligt efter oprettelsen af teknikker til omvendt genetik at redde rekombinante vira fra plasmider, der koder deres fuldstændige genomer som cDNA 2-5. Viral cDNA kan bekvemt modificeres in vitro ved anvendelse af standard kloningsprocedurer at ændre genotype af virus og / eller til at omfatte nye transkriptionsenheder. Redning af sådanne genetisk modificerede virus giver et værdifuldt redskab til at forstå faktorer, der påvirker flere stadier af infektionen, samt giver mulighed for udvikling og forbedring af vektorer til ekspression og levering af antigenertil vaccination og terapi. Her beskriver vi en protokol til redning af rekombinante NDVs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Newcastle disease-virus (NDV), en aviær paramyxovirus tilhører Avulavirus slægten 1, er en økonomisk relevant og dermed i vid udstrækning forsket og overvåget zoonotisk agens, der kan alvorligt påvirke fjerkræavl hele verden. Selvom det ikke er et humant patogen, NDV er også blevet grundigt undersøgt ud over dyrlægen felt både som model paramyxovirus og på grund af dens meget interessante, naturlige onkolytiske egenskaber 6. Forskning i NDV høj grad nydt godt af udviklingen af teknikker til omvendt genetik til enkelt-strandede, ikke-segmenterede negativ-sense RNA-virus, først beskrevet for rabies virus ved Conzelmann og coleagues 2. En række af genetisk modificerede NDVs, bærer fremmede gener eller modifikationer af deres vildtype genom er blevet bredt studeret lige siden. Arbejdet med disse rekombinante vira har været afgørende for at karakterisere forskellige virulensfaktorer ikke kun for NDV, men også af andre relevante humanin patogener såsom influenza A virus 7 - eller den emergente Nipah virus 8. Endvidere har en række forskellige undersøgelser undersøgt brugen af disse teknikker til at forbedre den medfødte antitumoraktivitet af NDV 6,9,10, for det meste ved at styrke de immunstimulerende egenskaber af viruset. Anden relevant forskningsområde på rekombinante NDVs har været generation af vaccinekandidater mod andre virussygdomme som influenza 5,11,12, HIV 13, mæslinger 14, SARS 15, eller at forårsaget af respiratorisk sincytial virus (RSV) 16. Blandt de forskellige bemærkelsesværdige fordele, som NDV er manglen på allerede eksisterende immunitet i befolkningsgrupper, stabiliteten af de udenlandske genetiske skær, manglende recombinatory aktivitet og samlet en høj sikkerhedsprofil kombineret med de førnævnte naturlige immunstimulerende egenskaber 17. Det er også bemærkelsesværdigt den potentielle anvendelse af rekombinante bivalente vacciner poultry, beskyttende mod både NDV og højpatogen aviær influenzavira 11,12. Dette kan være en glimrende måde at mindske chancerne for sidstnævnte breder sig fra vilde fugle til tamme dyr, og dermed også med til at forebygge en eventuel inter-specifik hoppe af den frygtede fugleinfluenza til mennesker. Endelig er reporter-udtrykkende NDV blevet anvendt til evaluering af medfødte immunresponser samt identifikation af interferon-antagonist, der kodes af flere vira 18-27.

Den redningsproces af en rekombinant, ikke-segmenteret negativ-strenget RNA-virus består dybest set på kunstigt at tvinge en virale replikationscyklus i en producerende celle ved transfektion af cDNA, der koder for den minimale infektiøse molekylære maskineri, der er kendt som ribonukleoprotein eller RNP (figur 2). De RNP'er består af den virale polymerase (P-og L-proteiner), nukleoprotein (NP) og fuldlængde antigenomiske RNA virus. Denne RNA + antigenom er the skabelon kræves til frembringelse af de komplementære RNA-genomer, som også er forbundet med resten af proteiner af viral RNP rekapitulerer samme smitsomme kompleks, et naturligt virus ville frigøre på cellens cytoplasma efter infektion (figur 2A ). Fra dette trin frem, kan den virale cyklus foregå naturligt og rekombinante virioner indkapsling de modificerede genomer, vil blive genereret (Fig. 2B). Bemærkelsesværdigt transfektion af cDNA i stedet for det antigenomiske cDNA stærkt indskrænker eller ophæver fuldstændigt redning effektivitet 2,28-30. Selv når antigenomiske cDNA transficeres, er effektiviteten af ​​indkapsling af det rekombinante RNA i RNP'er i transficerede celler sandsynligvis meget lav. På grund af dette, rednings-protokoller for NDV omfatter ofte forskellige trin til amplifikation af de få virale partikler, der frigives fra de oprindeligt blev transficerede celler ved coculturing dem med permissive celler og / eller vedinfektion af embryonerede æg.

Forud for redning, kan cDNA'en manipuleres ved standard kloningsteknikker procedurer med henblik på at generere de ønskede modifikationer. Mens specifikke mutationer i de forskellige genprodukter og regulatoriske sekvenser af virus kan ligefrem måde opnås, mange af de offentliggjorte arbejde, der involverer rekombinant NDV har krævet tilsætning af en ny transkriptionsenhed i NDV-genomet. Ligesom andre medlemmer af paramyxovirus familie, NDV-genomet koder for otte forskellige proteiner i seks transkriptionsenheder, som udtrykkes differentielt afhængigt af deres placering i forhold til 3'-enden i en faldende gradient kritisk for den virale livscyklus 1. På grund af dette, skal placeringen af ​​den nye transkriptionsenhed i genomet være nøje udvalgt for at opnå en balance mellem ekspressionen af ​​transgenet og nedskrivning af viral replikation. Indsættelse mellem P-og M-gener er blevet brugt mest, tHough andre steder er også blevet testet 13,31.

Uanset indsatsen, kloning i NDV-cDNA skal følge nogle regler for at generere en rescuable konstruktion: (i) et nyt gen, der skal indbefattes i NDV-genomet skal være under kontrol af de passende signaler til den virale RNA-afhængige RNA- polymerase. Disse sekvenser skal tilføjes opstrøms for den nye åbne læseramme (ORF), så polymerasen kan genkende slutningen af ​​den foregående gen (GE) og begyndelsen af ​​det nye transgen (GS), adskilt af en enkelt intergenisk sekvens nukleotid (IG) . Tilsætning af en gyldig Kozak (K)-sekvens for at forbedre eukaryote ribosomale oversættelse anbefales også til bedre fremmed protein ekspression 32, (ii) en effektiv replikation af NDV, som for de fleste medlemmer af Paramyxoviridae-familien, er afhængig af genomet længde er multiplum af seks 33, og derfor enhver indsættelse i NDV skal følge denne "regel af seks". Hvis det er nødvendigt, required yderligere nukleotider kan tilsættes nedstrøms den nye ORF, og (iii) sekvensen af ​​transgenet bør kontrolleres for at finde mulige GE og GS lignende sekvenser, som kan påvirke redning effektivitet, transgen ekspression og / eller virus levedygtighed. Hvis til stede, skal disse sekvenser fjernes ved stum mutagenese. Fremstillingen af ​​rekombinant fuld længde cDNA efter ovennævnte regler er det første skridt med henblik på effektivt at producere en genetisk modificeret NDV som beskrevet her.

I systemet alle DNA-konstruktioner under kontrol af T7-RNA-polymerase-promotor (figur 3). Denne cytoplasmatisk polymerase tilvejebringes i trans ved coinfektion med et rekombinant modificeret vaccinia Ankara-virus (MVA-T7) 34 Figur 3A viser pNDV-B1 plasmid, der koder for fuldlængde-antigenomiske cDNA 5.. 3B viser pTM1 plasmider kodende for NP, P-og L ORF'er. Plasmider pCITE-GFP, som koder for ufter T7 promotoren, grønt fluorescerende protein (GFP) og pCAGGS GFP 18, som koder for den samme ORF under chicken beta-actin-promotor 35, anvendes som kontroller. I denne protokol viser vi procedure at redde rekombinant NDV fra cDNA'et af lentogene NDV-stamme Hitchner B1 5 (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Fremstilling af pattedvrceller (figur 4A, dag 1)

Split HEp-2-eller A549-celler dagen før transfektion i 6-brønds plader. Tæthed af cellerne skal nå 80-90% konfluens den følgende dag. Normalt kan en konfluent 100 mm skål opdeles i 8 brønde (ca. 1 x 10 6 celler pr brønd). For hver virus der skal reddes, bør 2-4 forskellige brønde medtages, samt 2 ekstra brønde til kontrollerne pCAGGS-GFP-og pCITE-GFP-18, der har til formål at overvåge transfektion og MVA-T7 infektion effektivitetsgevinster, hhv.

2. Infektion af pattedvrceller med det rekombinante Modified Vaccinia Ankara virus, der udtrykker bakteriofag T7 RNA Polymerase (MVA-T7) (figur 4A, dag 2)

  1. Varm op PBS 1x/BA/PS og medier ved 37 ° C.
  2. Vask cellerne to gange med 1 ml PBS 1x/BA/PS.
  3. Inficere dyrkede pattedyrceller med MVA-T7 virus ved en multiplicitet af infektion (moi) 1 pfu / celle i et endeligt volumen på 200 pi i PBS / BA / PS i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Under virusinfektion inkubation forberede Transfektionsblandingen som beskrevet i 3..

3. Transfektion af pattedyrsceller (figur 4A, dag 2)

  1. Fremstilling af Lipofectamin: Bland 1-2 ug LPF2000 med 250 pi OptiMEM pr redningsforsøg og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  2. Forberedelse af DNA: Lav en plasmid cocktail for hver redning i 50 pi OptiMEM. Tilføj 0,4 ug pTM1-NP, 0,2 ug pTM1-P, og 0,2 ug af pTM1-L per rør. Tilsæt 1 ug af fuldlængde-cDNA-klon af NDV at blive reddet til hvert rør. Også forberede to kontrolgrupper transfektioner, den ene med 2 ug pCAGGS-GFP (for at kontrollere transfektionseffektiviteten) og den anden med 2 ug pCITE-GFP (for at kontrollere T7 polymerase drevet udtryk ved MVA-T7).
  3. Efter LPF2000-OptiMEM løsning er forinkuberet i 5 min (trin 3.1) tilsættes 250pi af opløsningen til DNA-rørene (trin 3.2) og inkuberes i 20-30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Efter inkubation med MVA-T7, fjerne virus inokulum ved aspiration og erstatte med den DNA-LPF2000 Transfektionsblandingen (trin 3.3).
  5. Tilsæt 1 ml DMEM 10% FBS / PS til hver skål.
  6. Inkubér inficerede / transficerede celler til 6-8 time (eller natten over) ved 37 ° C, 5% CO 2 og derefter erstatte transfektion medier med 1,5 ml frisk DMEM 10% FBS / PS.
  7. Ved 24 timer post-transfektion kan kontrolbrønde observeres under et fluorescensmikroskop for at vurdere transfektionseffektivitet (pCAGGS-GFP) og T7-polymerase-aktivitet (pCITE-GFP) (figur 5A). Fortsæt med co-kultur af inficerede / transficerede celler med aviær fibroblaster som beskrevet nedenfor.

4.. Co-kultur af pattedvrceller med fugleceller (figur 4A, Dag 3)

Normalt en sammenflydende 100 mm vævskulturskål af kylling (CEFS) or duck (defs) embryofibroblaster bruges per to transficerede brønde. Vær sikker på at forberede på forhånd nok 100 mm vævskulturskåle af fugleceller pr alle forsøg på at redde. Til effektiv redning af virus, er DMEM 10% FBS / PS medium suppleret med 5% allantoisvæske, 30 mM MgCl2. På dette tidspunkt 24 timer pi, pattedyrceller kan begynde at vise cytopatisk effekt (CPE) på grund af MVA-T7-infektion, asevident i figur 5A.

  1. Varm op PBS 1x og medier til 37 ° C.
  2. Vask pattedyrceller, 2x med 1 ml PBS 1x.
  3. Trypsinisér pattedyrceller med 0,2 ml EDTA-trypsin, indtil de fjernes. Resuspender cellerne i 1 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoisvæske, 30 mM MgCl2 og overføres til en 100 mm vævskulturskål. Tilsæt 3 ml samme medier.
  4. Vask fugleceller to gange med 4 ml PBS 1x.
  5. Trypsinisér fugleceller med 1 ml EDTA-trypsin og inkuberes i 1-2 min ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes. Resuspender the-celler tilføjer 8 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoisvæske, 30 mM MgCl2 og tilsættes 4 ml af de trypsiniserede celler til pattedyrceller i samdyrket 100 mm vævskulturskål til et samlet volumen på 8 ml (4 ml pattedyr, 4 ml fugleceller).
  6. Ryst forsigtigt med hånden co-dyrkede celler i 100 mm-skål for at få en ensartet fordeling og derefter placere dem i inkubatoren ved 37 ° C i 3-4 dage. Kriterierne for at inficere æg 3 eller 4 dage efter co-kultur af pattedyr og fugle celler afhænger af, hvor meget cytopatisk effekt (celle afrunding, død, løsrivelse fra overfladen, osv.) Er observeret i MVA-T7 virusinfektion.

5.. Infektion af Kylling befrugtede æg (figur 4A Days 6-7)

  1. Efter 3-4 dages co-dyrkning af mammale og aviære celler, fjernes 1 ml vævskultursupernatant og tilføje til et Eppendorf-rør.
  2. Centrifugér vævskultursupernatant i 1 minut ved 12.000 rpm i en bænktop centrifuge for at fjerne cellerester.
  3. Stearinlys æggene ved hjælp af en let gennemlysning box for at se grænsefladen mellem luft sac og allantoishulen. Lav et mærke på grænsefladen grænsen undgå blodkar lokalisering. Spray 70% ethanol i løbet af æggene til at etablere sterile betingelser. Forsigtigt lave et hul i æggeskallen på det markerede stedet og pode 500 pi af supernatanten ved hjælp af en insulin (1 ml) sprøjte, sigter nålen lodret og direkte i allantoiskaviteten. (Figur 4B).
  4. Forsegl nick i æggeskallen med smeltet voks eller paraffin.
  5. Inkuberes æggene i 2-3 dage ved 37 ° C.

6.. Høst af allantoisvæske fra inficerede kyllinger befrugtede æg (figur 4A dage 8-10)

  1. Inkubér de inficerede æg til 2-4 hr eller natten over ved 4 ° C for at dræbe kylling embryoner og koagulere blodet.
  2. Spray æggene med 70% ethanol (for at opretholde sterile betingelser).
  3. Trykke forsigtigt den apikale del af ægget, æteren hulrum, med en ske. Når æggeskallen er revnet, fjerne fragmenter med en pincet og fuldt eksponere allantois membran.
  4. Bring allantoiskaviteten ved udskæring allantois membranen med pincet og saks, undgår skader på blodkar og blommesækken.
  5. Skub forsigtigt ned foster med en spatel og indsamle opad strømmende allantoisvæske (8-12 ml pr æg) med en 10 ml pipette. Undgå at beskadige æggeblommen. Overfør allantoisvæske til et 15 ml centrifugerør på is (brug ét rør pr æg).
  6. Afklar allantoinvæsken ved centrifugering i 5 minutter ved 1500 rpm. Supernatanten overføres til et frisk rør uden at forstyrre pelleten.
  7. Opbevar prøver ved 4 ° C i op til 1 uge, indtil kontrollere dem for tilstedeværelse af NDV ved hæmagglutineringsassay.

7.. Hæmagglutination (HA) Indhold

Tilstedeværelsen af ​​virus i Allantoic væske fra inficerede æg kan bestemmes visuelt ved deres evne til hemagglutinate kalkun røde blodlegemer (RBC). I tilfælde af NDV er ca 10 6 plaque-dannende enheder (pfu) per ml kræves for at give et positivt signal i HA-assay. HA-assays udføres i V-bundede plader med 96 brønde. Negativ (PBS 1x, inficerede allantoisvæske) samt positiv (allantoisvæske fra enhver NDV-virus) kontrolprøver skal altid indgå i enhver HA-analyse for at validere det. For at udføre en HA-analyse:

  1. Afpipetteres 50 pi PBS 1x per brønd i en V-bund 96 brønd plade.
  2. Afpipetteres 50 pi allantoisvæsken prøver i brøndene på den første kolonne af pladen. Udfør 2-fold seriefortyndinger gennem resten af ​​pladen, og kassér det sidste, ekstra 50 ul fra brønde i den sidste kolonne.
  3. Dispensér 50 pi 0,5% kalkun RBC i PBS 1x per brønd. Ryst forsigtigt pladen ved at trykke.
  4. Inkubér pladen ved 4 ° C (eller is) feller 30-45 min, eller indtil en klar pellet dannet i negative kontrolbrønde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Redning af NDV er en veletableret procedure rutinemæssigt udføres i laboratorier, der har adgang til den fuldstændige cDNA af virus. Den iboende stokastiske natur af fremgangsmåden gør det imidlertid vanskeligt at opnå 100% redning effektivitet. Overvågning de tidlige trin i processen, specielt transfektionseffektiviteten og infektionen med MVA-T7, hjælper at identificere mulige problemer. 5A viser standard transfektion og transfektion / infektion effektivitetsgevinster, der er nok til en vellykket NDV redning. Efter amplifikationsrunder i fugle pattedyr co-kulturer og befrugtede æg, er tilstedeværelsen af ​​reddet virus opdaget af positive brønde i HA-analyse. NDV inducerer hæmagglutination ved at knytte erythrocytter og dermed hindrer aflejringer i bunden af ​​den V-formede godt. Derfor kan mangel på HA-aktivitet let skelnes ved dannelse af en rød, rund pille af RBC (figur 5B). Negative resultateri HA-assay kan skyldes et utilstrækkeligt titer af virus i allantoisvæske: minimum titer på ca 10 6 pfu / ml er nødvendig for at have en positiv HA resultat. Lavere virale titere kan stadig detekteres ved immunfluorescensassay (IFA) under anvendelse af specifikke anti-NDV-antistoffer. En ny passage om æg til yderligere forstærkning af virus til stede i de første inokulerede æg anbefales i disse tilfælde.

Figur 1
Figur 1. Genom organisering af Newcastle disease-virus (NDV) Den ikke-segmenteret, single-strandede negative-sense RNA-genomet af NDV er 15.186 nukleotider (nt) lang og koder otte forskellige polypeptider i seks transkriptionsenheder:. NP, P, M, F, HN-og L plus V-og W-proteiner, opstod efter skift i læserammen af ​​P-ORF under transskription. Noncoding, regulatoriske sekvenser flankerergenomet i sin 3 '(leder) og 5' (trailer) ender. Yderligere noncoding gen ende (GE), intergen (IG) og gen-start (GS) sekvenser regulerer den virale polymerase aktivitet i mellem de forskellige ORFs. Ekspressionsniveauer for de forskellige gener på det virale genom afhænger af deres relative placering i forhold til 3'-enden (dvs. NP transkripter er den mest udbredte, L afskrifter mildt) og opretter en gradient kritisk for virussens livscyklus 1.

Figur 2
Figur 2. Basis af NDV redning fra klonet DNA. Skematisk sammenligning mellem en fysisk (A) og kunstigt induceret (B) cyklus under redning processen. (A) Efter fastgørelse til målcellen, virus frigiver dets genomiske indhold i cytoplasmaet indkapslet i RNP'er. RNA-polymerasen transskriberer RNA-genomet i de forskellige mRNA'er for de virale proteiner, og i en komplementær, fuld længde antigenomiske RNA + kopi, som skabelon til fremstilling af flere kopier af det oprindelige genom, der vil blive indarbejdet i spirende virioner. (B ) Under redning proces, er komponenterne i RNP'er (NP, P og L-proteiner, samt en fuld-længde, som regel modificeret antigenomisk RNA) fra cDNA transfektion. Efter rekonstituering af det antigenomiske RNP'er i cytoplasmaet i den transficerede celle, kan de producerer komplementære, rekombinante genomiske RNP'er og en hel cyklus kan så begynde forfra, slutter med udgivelsen af ​​rekombinante vira.

Figur 3
Figur 3. T7-driven ekspressionsplasmider til frembringelse af rekombinant NDV. (A) Fuld længde viral cDNA: The fuld længde pNDV-B1 ampicillinresistens plasmid driver ekspression af lentogene NDV-stamme Hitchner B1 antigenom under T7-promotoren (P T7) og T7-terminator-sekvensen (T T7) indeholdende Hepatitis Delta Ribozym (HDR) spaltning. Den pNDV-B1 blev oprindeligt designet til at bære udenlandske indsatser mellem P-og M-generne 5. Indsættelse af et nyt gen (Xbal-sted) kræver tilsætning af den regulerende gen ende (GE), intergen (IG) og gen-start (GS) sekvenser til at tillade sin funktionelle anerkendelse af den virale polymerase. Ekspression effektivitet af transgenet kan forbedres ved tilsætning af en Kozak (K)-sekvens opstrøms for startkodonen 32. Hele kassette indføres i NDV-cDNA nødt til at have et samlet antal nukleotider delelige med seks til følge "seks-reglen" 33, der driver en effektiv replikering af de fleste paramyxovius genomer (B) Protein ekspressionsplasmider:. Viral NP, P og L ORF'er flankeretaf T7-promotoren (P T7) er UTR af encephalomyocarditisvirus (EMC) og T7-terminator (T T7) sekvenser blev klonet ind i pTM1 rygraden ampicillinresistens vektor 5,36.

Figur 4
Figur 4.. Plasmid-baserede teknikker til omvendt genetik til frembringelse af rekombinant Newcastle Disease-virus. (A) Viral redning: A549 eller HEp-2-celler inficeres med den modificerede vacciniavirus Ankara udtrykker bakteriofag T7 polymerase (MVA-T7). Efter virusinfektion, celler co-transficeres med ekspressionsplasmid kræves til replikation og transkription af NDV virusgenomet (NP, P og L) sammen med fuldlængde-NDV-cDNA under T7-promotoren. Fireogtyve timer post-infection/transfection, pattedyrceller dyrkes sammen med kylling eller andelever embryofibroblaster (CEF ogDEF, henholdsvis). Tre til fire dage efter co-kultur, 8-10 dage gammel kylling befrugtede æg podes med vævskultursupernatanter af co-kultur celler til yderligere forstærkning. To til tre dage efter inkubation af 8-10 dage gamle æg på 37 ° C, allantoisvæske fra æg høstes og analyseres for en vellykket redning af det rekombinante virus ved HA-analyse. Positive (+) rednings virus karakteriseres yderligere ved genomisk (RT-PCR) og protein (f.eks immunfluorescensassay (IFA) og western blot (WB) niveauer Negativ (-). HA resultater kan skyldes manglen på tilstrækkeligt virus til at være . opdaget af HA Geninfektion af fersk kylling befrugtede æg til forstærke virussen er angivet (B) Infektion af kylling befrugtede æg:. 8-10 kylling befrugtede æg lyses at markere grænsefladen mellem luft sac og allantoiskaviteten Med en insulin. (1 ml) injektionssprøjte bliver æg inficeret med vævskultursupernatant inde allantois cavity, som angivet.

Figur 5
Figur 5. Repræsentative resultater. (A) Transfektion og MVA-T7 infektionseffektivitet: repræsentative fluorescerende (venstre) og lyse (højre) områder af A549-celler transficeret med pCAGGS-GFP (øverst) eller inficeret med MVA-T7 og transficeret med pCITE-GFP (nederst) er vist . Konstitutiv GFP-ekspression drevet af pCAGGS er en indikator for transfektionseffektivitet, mens T7 promotordrevet GFP-ekspression ved pCITE er en kontrol for MVA-T7-infektion og T7-polymerase-aktivitet. Celler blev afbildet på 24 hr post-transfection/post-infection (B) hæmagglutineringsassay (HA): Tilstedeværelse af virale partikler i allantoisvæske inducerer hæmagglutination, som er vist ved en mangel på pulver i bunden af en V-formet godt. Fravær af virus tillader dannelsen af ​​en rød pille i bunden af ​​the godt. Figuren viser både de nødvendige for en HA-analyse (negativ, ren allantoisvæske, positive, en allerede karakteriseret NDV prøve) kontroller og resultaterne af tre ukendte prøver opnået efter en redning med to positive (+) og en negativ (-) resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flere faktorer skal tages i betragtning for at opnå gode resultater, mens redde NDV. For det første fuldlængde-cDNA-konstruktion, der skal anvendes skal være udformet således, at den funktionelle integrering af de nye transgener / ændringer i NDV-genomet. Det betyder, som nævnt ovenfor, at (i) passende gen ende (GE), intergen (IG) og gen-start (GS) sekvenser der skal tilføjes, hvis det kræves, (ii) der er ingen formodede GE eller GS sekvenser i udenlandske gen, og (iii) den fulde rekombinante genom følger de "seks-reglen".

Som for redning proces, kvalitet plasmidpræparater, MVA-T7 aktier samt korrekt vedligeholdelse af celler er kritiske. For de fleste af de tilfælde, standard maxiprep oprensning af plasmid-DNA er tilstrækkelig, selv om vanskelige klonings-og redning processer, på grund af størrelse eller art af transgenerne, kan forbedres ved oprensning af DNA gennem CsCl densitetsgradientcentrifugering. Transfektion effektivitet ved hjælp Lipofectamine er normalt nok for en vellykket redning, men kan også bruges andre transfektionsmetoder såsom nucleofection. Under alle omstændigheder skal være strengt opretholdt (0.4:0.2:0.2:1 til NP-PL-pNDV, henholdsvis) forholdet mellem de forskellige plasmider. På grund af den besværlige og på en måde stokastiske natur af rednings-processen bør mindst 2-4 forskellige brønde transficeres per konstruktion at blive reddet, og forskellige kloner af samme konstruktion skal analyseres.

I den protokol, som vi har beskrevet her, bruger vi MVA-T7 til at levere i trans T7 polymerase kræves for ekspression af de virale cDNA konstruktioner. Mens dette er standardproceduren i vores laboratorium, er det ikke den eneste mulige fremgangsmåde. For eksempel har andre grupper held reddet NDV og andre ikke-segmenterede, negativ-streng RNA-virus ved hjælp af cellelinier konstitutivt udtrykker høje niveauer af T7-polymerase 4,37. Tilgængeligheden af ​​en rekombinant vektoreller cellelinie kodning T7 polymerase, samt den konkrete udførelse af enten holdning i en given laboratorium, bør overvejes, når oprettelse af ny redningssystemet for NDV.

Efter bestemmelse af NDV tilstedeværelse i allantoisvæske af HA, er yderligere undersøgelser, der skal udføres for at fuldt ud at karakterisere den nyligt reddet virus, såsom RT-PCR efterfulgt af sekventering af det virale genom, IFA og Western-blotting (WB) for at bestemme ekspression af det fremmede gen (hvis relevant). Afhængigt af arten af ​​de ændringer, at de rekombinante vira bærer, kan andre former for biokemiske og funktionelle assays også være nødvendig.

Redningen af ​​rekombinant NDV fra cDNA er en nyttig teknik til flere årsager. Første og mest indlysende, denne teknik giver med evnen til at analysere biologi NDV, en økonomisk relevant virus for aviær industri ved eksperimentelt at ændre dens gener og regulatoriske sekvenser. NDV er en paramyxovirus nært beslægtet med humane patogener som mæslinger, fåresyge eller respiratorisk syncytial virus, såvel som den emergente, højpatogen Hendra og Nipah virus, forskning i de grundlæggende livscyklus denne familie af virus er vigtigt at forstå deres biologi. Ud over grundforskning, rekombinante NDVs har et stort potentiale som vaccine og onkolytiske vectos, der kombinerer muligheden for at foreing gener i deres genomer med et godt vurderet biosikkerhed profil. Af alle disse grunde kan NDV rednings-protokollen være et værdifuldt aktiv for mange laboratorier verden interesseret i virus forskning, udvikling vaccine og kræftbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Adolfo Garcia-Sastre er en opfinder af patenter på rekombinante Newcastle virus sygdom, der er ejet af Icahn School of Medicine på Mount Sinai.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke tidligere og nuværende medlemmer i laboratorier Drs. Peter Palese og Adolfo García-Sastre for udviklingen af ​​NDV omvendt genetik teknikker og for teknisk assistance. Forskning i Newcastle disease-virus i AG-S laboratorium er delvist finansieret af niaD indrømme R01AI088770 og af Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence for Emerging og zoonotiske Dyresygdomme (CEEZAD, tildeling nummer 2010-ST-061-AG001). Forskning i LM-S laboratorium er finansieret af NIH tilskud RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAID Centers of Excellence for Influenza Forskning og overvågning (HHSN266200700008C) og University of Rochester Center for Biodefense Immun Modeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80, (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).
Redning af rekombinant Newcastle Disease-virus fra cDNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter