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Immunology and Infection

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

doi: 10.3791/50830 Published: October 11, 2013

Summary

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Abstract

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el miembro prototipo del género Avulavirus de la familia Paramyxoviridae 1, es una, de sentido negativo no segmentado, de cadena única, envuelto ARN del virus (Figura 1) con aplicaciones potenciales como un vector para la vacunación y tratamiento de enfermedades humanas. Exploración en profundidad de estas aplicaciones sólo ha sido posible después de que el establecimiento de técnicas de genética inversa para rescatar a los virus recombinantes a partir de plásmidos que codifican sus genomas completos como cDNA 2-5. ADNc viral puede ser convenientemente modificado in vitro mediante el uso de procedimientos de clonación estándar para alterar el genotipo del virus y / o para incluir nuevas unidades de transcripción. Rescate de estos virus modificados genéticamente proporciona una valiosa herramienta para entender los factores que afectan a múltiples etapas de la infección, así como permite el desarrollo y la mejora de los vectores para la expresión y entrega de antígenospara la vacunación y la terapia. Aquí se describe un protocolo para el rescate de NDVs recombinantes.

Introduction

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Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un paramixovirus aviar perteneciente al género Avulavirus 1, es un agente zoonótica económicamente relevante y por lo tanto ampliamente investigado y vigilado, que pueden afectar gravemente a la cría de aves en todo el mundo. Aunque no es un patógeno humano, NDV también se ha estudiado a fondo más allá del campo veterinario tanto como un modelo de paramixovirus y debido a sus propiedades altamente interesantes oncolíticos naturales, 6. Investigación sobre el NDV se benefició en gran medida del desarrollo de técnicas de genética inversa para los virus de una sola cadena, no segmentados de sentido negativo de ARN, descrito por primera vez por el virus de la rabia por Conzelmann y coleagues 2. Una variedad de NDVs modificados genéticamente con genes extraños o modificaciones de su tipo salvaje genoma se ha estudiado ampliamente desde entonces. Trabajar con estos virus recombinantes ha sido fundamental para caracterizar los diferentes factores de virulencia no sólo de NDV, sino también de otros huma relevanten patógenos, tales como virus de influenza A 7 - o la emergente Nipah virus 8. Además, un número de diferentes estudios han explorado el uso de estas técnicas para mejorar la actividad antitumoral innata de NDV 6,9,10, sobre todo mediante la mejora de las propiedades inmunoestimulantes del virus. Otro ámbito de investigación en NDVs recombinantes ha sido la generación de candidatos a vacunas contra otras enfermedades virales como la gripe 5,11,12, 13 VIH, sarampión 14, 15 SARS o la causada por el virus respiratorio sincytial (VRS) 16. Entre las diversas ventajas notables prestados por NDV son la falta de inmunidad preexistente en la población humana, la estabilidad de los insertos extranjeros genéticos, la falta de actividad recombinatorios y en general un alto perfil de seguridad combinado con las propiedades inmunoestimulantes naturales antes mencionados 17. También es digno de mención el uso potencial de las vacunas bivalentes recombinantes en poultry, la influenza aviar de protección tanto contra el NDV y altamente patógeno virus de 11,12. Esto puede ser una excelente manera de reducir las posibilidades de que este último se diseminan desde silvestre a los animales domésticos, por lo que también ayuda a prevenir un posible salto inter-específica de la temida gripe aviar a los humanos. Por último, el reportero-expresando NDV se han utilizado para la evaluación de la respuesta inmune innata, así como la identificación de antagonista de interferón codificada por múltiples virus 18-27.

El proceso de rescate de un recombinante, no segmentado, virus de ARN de cadena negativa consiste básicamente en forzar artificialmente un ciclo de replicación viral en una célula que produce mediante la transfección de ADNc que codifican la maquinaria molecular infecciosa mínima, conocida como ribonucleoproteína o RNP (Figura 2). Los RNPs consisten de la polimerasa viral (P y proteínas L), la nucleoproteína (NP) y de la longitud completa de ARN antigenómico del virus. Este ARN + antigenoma es the plantilla requerida para la generación de los genomas de ARN-complementarios, los cuales, también asociados con el resto de las proteínas de la RNP viral, recapitula el mismo complejo infecciosa que un virus natural sería liberar en el citoplasma de la célula después de la infección (Figura 2A ). A partir de este paso adelante, el ciclo viral puede proceder de forma natural y viriones recombinantes, encapsidadoras los genomas modificados, será generado (Figura 2B). Sorprendentemente, la transfección del ADNc genómico en lugar del cDNA antigenómico perjudica en gran medida o completamente suprime la eficiencia de rescate 2,28-30. Incluso cuando se transfectó ADNc antigenómico, la eficiencia de la encapsidación del ARN recombinante en RNPs en células transfectadas es probablemente muy baja. Debido a esto, los protocolos de rescate para NDV a menudo incluyen diferentes pasos para la amplificación de las pocas partículas virales liberadas por las células transfectadas originalmente por cocultivo con células permisivas y / o por elinfección de huevos embrionados.

Antes de rescate, el ADNc se puede manipular por procedimientos de clonación estándar con el fin de generar las modificaciones deseadas. Mientras que las mutaciones específicas de los diferentes productos de los genes y las secuencias reguladoras del virus se pueden lograr sin rodeos esta manera, muchos de los trabajos publicados que involucran NDV recombinante ha requerido la adición de una nueva unidad de transcripción en el genoma de NDV. Al igual que otros miembros de la familia de los paramixovirus, el genoma de NDV codifica ocho proteínas diferentes en seis unidades de transcripción, que se expresan diferencialmente dependiendo de su ubicación respecto al extremo 3 'en un gradiente decreciente crítico para el ciclo de vida viral 1. Debido a esto, la ubicación de la nueva unidad de transcripción dentro del genoma debe ser cuidadosamente seleccionado para lograr un equilibrio entre la expresión del transgén y el deterioro de la replicación viral. De inserción entre los genes P y M se ha utilizado la mayor parte, tHough otros sitios también se han probado 13,31.

Cualquiera que sea la pieza de inserción, la clonación en ADNc de NDV tiene que seguir algunas reglas para generar un constructo rescatable: (i) cualquier nuevo gen que se incluirán en el genoma de NDV tiene que estar bajo control de las señales apropiadas para la viral dependiente de ARN-ARN polimerasa. Estas secuencias deben ser añadidos aguas arriba del nuevo marco de lectura abierto (ORF) de modo que la polimerasa puede reconocer el final del gen anterior (GE) y el comienzo de la nueva transgén (GS), separados por una sola secuencia de nucleótidos intergénica (IG) . También se recomienda la adición de un Kozak válida (K) de secuencia para mejorar la traducción eucariótica ribosómico para una mejor expresión de la proteína extranjera 32; (ii) la replicación eficiente de NDV, como para la mayoría de los miembros de la familia Paramyxoviridae, es dependiente de la longitud del genoma de ser múltiplo de seis de 33, por lo tanto, cualquier inserción en el NDV tiene que seguir esta "regla de los seis". Si es necesario, se reqnucleótidos adicionales pedirá otra se pueden añadir aguas abajo de la ORF de nuevo, y (iii) la secuencia de transgén deben ser evaluados para encontrar posibles GE y GS como secuencias que puedan perjudicar la eficiencia del rescate, la expresión del transgen y / o la viabilidad del virus. Si está presente, estas secuencias deben ser removidos mediante mutagénesis silenciosa. La generación de ADNc de longitud completa recombinante siguiendo las reglas anteriormente mencionadas es la primera etapa con el fin de producir eficientemente un NDV genéticamente modificado como se detalla aquí.

En el sistema de todas las construcciones de ADN se encuentran bajo el control del promotor de T7 ARN polimerasa (Figura 3). Esta polimerasa citoplásmica se proporciona en trans por la coinfección con un vaccinia modificado Ankara del virus recombinante (MVA-T7) 34. Figura 3A muestra el plásmido pNDV-B1, que codifica el ADNc de longitud completa antigenómico 5. Figura 3B muestra los plásmidos pTM1 que codifica NP, ORFs P y L. Los plásmidos pCITE-GFP, que codifica, uajo el promotor T7, la proteína verde fluorescente (GFP), y pCAGGS GFP 18, que codifica la misma ORF bajo el promotor de beta-actina de pollo 35, se utilizan como controles. En este protocolo se muestra el procedimiento para rescatar NDV recombinante a partir del ADNc de la cepa lentogénica de NDV Hitchner B1 5 (Figura 4).

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Protocol

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1. Preparación de células de mamíferos (Figura 4A, Día 1)

Dividir HEp-2 o células A549 el día antes de la transfección en placas de 6 pocillos. Densidad de las células debe alcanzar el 80-90% de confluencia el día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm plato se puede dividir en 8 pozos (alrededor de 1 x 10 6 células por pocillo). Para cada virus para ser rescatado, 2-4 pozos diferentes deben incluirse, además de 2 pozos adicionales para los controles pCAGGS-GFP y GFP-pCITE 18, con el objetivo de monitorear la transfección y MVA-T7 eficiencia de infección, respectivamente.

2. La infección de células de mamífero con el recombinante modificado del virus vaccinia Ankara Expresando el bacteriófago T7 RNA polimerasa (MVA-T7) (Figura 4A, Día 2)

  1. Calentar PBS 1x/BA/PS y medios a 37 ° C.
  2. Lavar las células dos veces con 1 ml de PBS 1x/BA/PS.
  3. Infectar las células de mamífero en cultivo con el virus MVA-T7 a una multiplicidad de infección (moi) De 1 ufp / célula en un volumen final de 200 l en PBS / BA / PS durante 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Durante la incubación infección viral, preparar la mezcla de transfección como se describe en 3.

3. La transfección de células de mamíferos (Figura 4A, Día 2)

  1. Preparación de Lipofectamine: Mezclar 1-2 g de LPF2000 con 250 l de OptiMEM por intento de rescate e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  2. Preparación de ADN: Hacer un cóctel para cada plásmido de rescate en 50 l de OptiMEM. Añadir 0,4 g de pTM1-NP, 0,2 g de pTM1-P, y 0,2 g de pTM1-L por tubo. Añadir 1 g de los de larga duración cDNA clon de NDV que ser rescatados a cada tubo. También hay que preparar dos transfecciones de control, uno con 2 g de pCAGGS-GFP (para comprobar la eficacia de transfección) y el otro con 2 g de pCITE-GFP (para verificar la polimerasa T7 impulsada expresión por la MVA-T7).
  3. Después de la solución LPF2000-OptiMEM ha preincubaron durante 5 min (paso 3.1), añadir 250l de la solución a los tubos de ADN (paso 3,2) y se incuba durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Después de la incubación con MVA-T7, retire el inóculo de virus por aspiración y reemplazarla con la mezcla de transfección de ADN LPF2000 (paso 3.3).
  5. Añadir 1 ml de DMEM 10% FBS / PS para cada plato.
  6. Se incuban las células infectadas / transfectadas para 6-8 horas (o durante la noche) a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego reemplazar el medio de transfección con 1,5 ml de DMEM fresco 10% de SFB / PS.
  7. A las 24 h después de la transfección, los pocillos de control se pueden observar bajo un microscopio de fluorescencia para evaluar la eficacia de transfección (pCAGGS-GFP) y la actividad de la polimerasa de T7 (pCITE-GFP) (Figura 5A). Continúe con el co-cultivo de las células infectadas / transfectadas con fibroblastos aviar descritas a continuación.

4. Co-cultivo de células de mamífero con células de aves (Figura 4A, Día 3)

Por lo general, una confluencia de 100 mm de cultivo de tejidos plato de pollo (CEF) or pato (DEFs) fibroblastos de embrión se utiliza por dos pozos transfectadas. Asegúrese de preparar, con antelación, suficientes 100 mm placas de cultivo tisular de células de aves por todos los intentos de rescate. Para el rescate eficiente del virus, medio DMEM 10% de FBS / PS se complementa con 5% de fluido alantoideo y 30 mM de MgCl 2. En este punto, 24 horas pi, células de mamífero pueden empezar a mostrar el efecto citopático (CPE) debido a la infección de MVA-T7, asevident en la Figura 5A.

  1. Calentar 1x PBS y medios de comunicación a 37 ° C.
  2. Lavar las células de mamíferos, 2x, con 1 ml de PBS 1x.
  3. Tripsinizar las células de mamífero con 0,2 ml de EDTA-tripsina hasta que se desprendieron. Resuspender las células en 1 ml de DMEM 10% de FBS / PS, 5% de fluido alantoideo, 30 mM de MgCl 2 y la transferencia a un 100 mm de placa de cultivo de tejido. Añadir 3 ml de los mismos medios de comunicación.
  4. Lavar las células aviares, dos veces, con 4 ml de PBS 1x.
  5. Trypsinize células aviares con 1 ml de EDTA-tripsina y se incuba durante 1-2 min a 37 ° C hasta que las células se separan. ª Resuspendercélulas e la adición de 8 ml de DMEM 10% de FBS / PS, 5% de fluido alantoideo, 30 mM de MgCl 2 y añadir 4 ml de las células tratadas con tripsina a las células de mamíferos en la co-cultivadas 100 mm de placa de cultivo de tejido para un volumen total de 8 (4 ml de mamíferos, 4 ml células de aves) ml.
  6. Agitar suavemente a mano las células co-cultivadas en la placa de 100 mm con el fin de tener una distribución uniforme y luego colocar en la incubadora a 37 ° C durante 3-4 días. Los criterios para infectar los huevos de 3 o 4 días después de la co-cultivo de células de mamíferos y aves depende de la cantidad de efecto citopático (redondeo celular, la muerte, el desprendimiento de la superficie, etc.) Se observa en la infección viral MVA-T7.

5. La infección de los huevos embrionados de pollo (Figura 4A, días 6-7)

  1. Después de 3-4 días de co-cultivo de células de mamíferos y aves, extraiga 1 ml del sobrenadante de cultivo de tejidos y agregar a un tubo Eppendorf.
  2. Centrifugar el sobrenadante de cultivo de tejidos durante 1 min a 12.000 rpm en un bancocentrífuga para eliminar restos celulares.
  3. Candle los huevos usando una caja de mirar al trasluz la luz para ver la interfaz entre el saco de aire y la cavidad alantoideo. Haga una marca en la frontera evitando interfaz de localización de los vasos sanguíneos. Pulverizar etanol al 70% sobre los huevos para establecer condiciones estériles. Hacer suavemente un agujero en la cáscara del huevo en el lugar marcado y inocular 500 l del sobrenadante usando una insulina (1 ml) de la jeringa, la aguja apuntando verticalmente y directamente en la cavidad alantoidea. (Figura 4B).
  4. Sellar el corte en la cáscara de huevo con cera derretida o parafina.
  5. Incubar los huevos durante 2-3 días a 37 ° C.

6. Cosecha de fluido alantoideo de huevos embrionados de pollo infectados (Figura 4A, días 8-10)

  1. Incubar los huevos infectados durante 2 a 4 horas o durante la noche a 4 ° C con el fin de matar al embrión de pollo y coagular la sangre.
  2. Pulverizar los huevos con etanol al 70% (para mantener las condiciones estériles).
  3. Cuidadosamente la sección apical del huevo, sobre la cavidad de aire, con una cuchara. Una vez que la cáscara está agrietada, retire los fragmentos con unas pinzas y totalmente exponer la membrana alantoidea.
  4. Exponer la cavidad alantoidea mediante la escisión de la membrana alantoideo con pinzas y tijeras, evitando daños a los vasos sanguíneos y la yema.
  5. Con cuidado, empujar hacia abajo el embrión con una espátula y se recoge el fluido alantoideo que fluye hacia arriba (8-12 ml por huevo) con una pipeta de 10 ml. Evitar daños en la membrana de la yema. Transferir el fluido alantoideo a un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo (utilizar un tubo por huevo).
  6. Aclarar el fluido alantoideo mediante centrifugación durante 5 min a 1500 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y sin perturbar el sedimento.
  7. Muestras a 4 ° C durante un máximo de 1 semana, hasta comprobar que la presencia de NDV por ensayo de hemaglutinación.

7. Hemaglutinación (HA) Ensayo

La presencia de virus en el allantfluido oico a partir de huevos infectados se puede determinar macroscópicamente por su capacidad para hemoaglutinar pavo glóbulos rojos (RBC). En el caso de la enfermedad de Newcastle, de aproximadamente 10 6 unidades formadoras de placa (ufp) por ml son necesarios para dar una señal positiva en el ensayo de HA. Ensayos de HA se llevan a cabo en placas de 96 pocillos de fondo en V. Negativo (PBS 1x, fluido alantoideo infectado), así como positivo (fluido alantoideo de cualquier virus NDV) muestras de control siempre se deben incluir en cualquier ensayo de HA para validarlo. Para llevar a cabo un ensayo de HA:

  1. Pipetear 50 l de PBS 1x por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo en V.
  2. Pipetear 50 l de las muestras de fluido alantoideo en los pocillos de la primera columna de la placa. Realizar diluciones seriadas de 2 veces por el resto de la placa y desechar la última, extra 50 l de pozos en la última columna.
  3. Dispensar 50 l de 0,5% pavo RBC en PBS 1x por pocillo. Agitar suavemente la placa tocando.
  4. Incubar la placa a 4 ° C (o hielo) fo 30-45 minutos o hasta que un pellet claro se forma en los pocillos de control negativo.

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Representative Results

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Rescate de NDV es un procedimiento bien establecido, realizada de forma rutinaria en los laboratorios que tienen acceso a la ADNc completo del virus. Sin embargo, la naturaleza estocástica intrínseca del método hace que sea difícil de lograr la eficiencia de rescate 100%. El seguimiento de los primeros pasos del proceso, especialmente la eficacia de la transfección y la infección con MVA-T7, ayuda a la identificación de posibles problemas. Figura 5A muestra la transfección estándar y las eficiencias de transfección / infección que son suficientes para una exitosa rescate del NDV. Después de las rondas de amplificación en co-cultivos-aviares de mamíferos y en huevos embrionados, presencia de virus rescatado se detecta por los pocillos positivos en el ensayo de HA. NDV induce la hemaglutinación mediante la vinculación de los eritrocitos y de este modo impide su sedimentación en la parte inferior de la forma de V así. Por lo tanto, la falta de actividad HA fácilmente se puede distinguir por la formación de un sedimento de color rojo, ronda de RBC (Figura 5B). Los resultados negativosen el ensayo de HA puede ser debido a un título insuficiente de virus en el fluido alantoideo: un título mínimo de aproximadamente 10 6 pfu / ml se requiere para tener un resultado positivo para HA. Títulos virales bajos todavía pueden ser detectados por el ensayo de inmunofluorescencia (IFA) utilizando anticuerpos específicos anti NDV. Un nuevo paso en los huevos para su posterior amplificación del virus presente en los primeros huevos inoculados se recomienda en estos casos.

Figura 1
Figura 1. Organización del genoma del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) La no segmentado, de sentido negativo genoma de ARN de cadena simple de NDV es 15.186 nucleótidos (nt) de longitud y codifica ocho polipéptidos diferentes en seis unidades transcripcionales:. NP, P, M, F, HN y L más proteínas V y W, se originaron después de cambios en el marco de lectura del ORF P durante la transcripción. Codificante, secuencias reguladoras flanqueanel genoma en su extremo 3 '(líder) y 5' (remolque) termina. Además no codificante de fin de gen (GE), intergénica (IG) y de inicio del gen (GS) secuencias de regular la actividad de la polimerasa viral en entre los diferentes ORFs. Los niveles de expresión de los diferentes genes en el genoma viral dependen de su ubicación relativa respecto a el extremo 3 '(es decir, las transcripciones NP son los más abundantes, L transcripciones lo menos), creando efectivamente un gradiente crítico para el virus' ciclo de vida 1.

Figura 2
Figura 2. Bases de NDV a partir de ADN clonado de rescate. Comparación esquemática entre un natural (A) y el ciclo de (B) artificialmente inducida durante el proceso de rescate. (A) Después de unir a la célula diana, el virus libera su contenido genómico en el citoplasma encapsidado en RNPs. La ARN polimerasa transcribe el ARN de genoma en los diferentes ARNm de las proteínas virales y en una, longitud ARN complementario antigenómico completo + copia, que es la plantilla para la producción de múltiples copias del genoma original que se incorporarán en viriones nacientes. (B ) Durante el proceso de rescate, los componentes de las RNPs (NP, P y L proteínas, así como de longitud completa, el ARN antigenómico generalmente modificado) son proporcionados por la transfección de ADNc. Tras la reconstitución de las RNPs antigenómicos en el citoplasma de la célula transfectada, pueden producir los RNPs, genómica recombinantes complementarias y todo un ciclo puede entonces comenzar de nuevo, para terminar con la liberación de los virus recombinantes.

Figura 3
Figura 3. Plásmidos de expresión de T7 impulsada para la generación de NDV recombinante. (A) de ADNc viral Integral: Thcorreo de longitud completa pNDV-B1 plásmido de resistencia a ampicilina conducir la expresión de la cepa lentogénica de NDV Hitchner B1 antigenoma bajo el promotor de T7 (P T7) y la secuencia de terminador de T7 (T7 T) que contiene la ribozima de la hepatitis delta (HDR) de escisión. El pNDV-B1 fue originalmente diseñado para llevar insertos extranjeros entre los genes P y M 5. La inserción de un nuevo gen (XbaI) requiere la adición de finales gen regulador (GE), intergénica (IG) y el inicio de gen (GS) secuencias para permitir su reconocimiento funcional por la polimerasa viral. Eficacia de la expresión del transgén se puede mejorar con la adición de una secuencia Kozak (K) aguas arriba del codón de inicio 32. Todo el casete introducido en el cDNA NDV tiene que tener un número total de nucleótidos divisible por seis a seguir la "regla de los seis" 33 que impulsa la replicación eficiente de la mayoría de los genomas paramyxovius (B) los plásmidos de expresión de proteínas:. NP Viral, P y ORFs L, flanqueadospor el promotor de T7 (T7 P), la UTR del virus de la encefalomiocarditis (EMC) y el terminador de T7 (T7 T) secuencias se clonaron en el vector de columna vertebral ampicilina resistencia pTM1 5,36.

Figura 4
Figura 4. Técnicas de genética inversa basada en un plásmido-para la generación de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante. (A) viral de rescate: A549 o células HEp-2 se infectaron con el virus vaccinia modificado Ankara que expresa la polimerasa del bacteriófago T7 (MVA-T7). Después de la infección viral, las células se co-transfectaron con el plásmido de expresión requerido para la replicación y la transcripción del genoma viral de NDV (NP, P y L), junto con el ADNc de longitud completa de NDV, bajo el promotor T7. Veinticuatro horas post-infection/transfection, células de mamíferos son co-cultivadas con pollo o fibroblastos de embrión de pato (CEF yDEF, respectivamente). Tres o cuatro días después de co-cultivo, pollo de 8-10 días de edad huevos embrionados son inoculados con el sobrenadante de cultivo de tejidos de las células de co-cultivo para su posterior amplificación. De dos a tres días después de la incubación de los 8-10 días de edad, los huevos a 37 ° C, el fluido alantoideo de los huevos se cosecha y se analizó para el rescate con éxito de virus recombinante mediante ensayo de HA. (+) Virus de rescate positivos se caracterizan además en genómico (RT-PCR) y la proteína (por ejemplo, ensayo de inmunofluorescencia (IFA) y Western blot niveles (WB) Negativo (-). HA resultados pueden deberse a la falta de suficientes virus para estar . detectado por HA reinfección de huevos embrionados de pollo frescos para amplificar el virus se indica (B) La infección de huevos embrionados de pollo:. 8-10 huevos de gallina embrionados se trasluz para marcar la interfaz entre el saco de aire y la cavidad alantoidea Con una insulina. (1 ml) de la jeringa, los huevos están infectadas con el sobrenadante de cultivo tisular dentro de la cavi alantoideoTy, como se indica.

La figura 5
Figura 5. Los resultados representativos. (A) La transfección y MVA-T7 eficiencia de infección: fluorescente representativa (izquierda) y brillante (derecha) campos de las células A549 transfectadas con pCAGGS-GFP (arriba) o infectadas con MVA-T7 y transfectadas con pCITE-GFP (abajo) se ilustran . Constitutiva la expresión de GFP impulsado por pCAGGS es un indicador de la eficacia de la transfección, mientras que el promotor de T7 impulsada por la expresión de GFP pCITE es un control para la infección MVA-T7 y la actividad de la polimerasa de T7. Las células fueron imágenes a las 24 horas post-transfection/post-infection (B) ensayo de hemaglutinación (HA): Presencia de partículas virales en el líquido alantoideo induce la hemaglutinación, que se muestra por la falta de sedimento en la parte inferior de una forma de V así. Ausencia de virus permite la formación de un sedimento de color rojo en la parte inferior de the así. La Figura muestra tanto los controles necesarios para cualquier ensayo de HA (fluido alantoideo negativo, limpia; positivo, una muestra ya caracterizado NDV), y los resultados de tres muestras desconocidas obtenidos después de un rescate, con dos positivo (+) y negativo (-) resultado.

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Discussion

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Hay varios factores que deben ser considerados para lograr buenos resultados, mientras que el rescate de NDV. En primer lugar, la construcción de ADNc de longitud completa para ser utilizado tiene que ser diseñado para permitir la incorporación funcional de los nuevos transgenes / modificaciones en el genoma NDV. Esto significa que, como se ha dicho, que las secuencias de (i) de gama apropiada gen (GE), intergénica (IG) y el inicio del gen (GS) se deben añadir, si es necesario, (ii) no hay secuencias de GE o GS putativos en el extranjero gen, y (iii) el genoma recombinante completo sigue la "regla de los seis".

Como para el proceso de rescate, calidad de las preparaciones de plásmido, las poblaciones de MVA-T7, así como el mantenimiento adecuado de las células son críticos. Para la mayoría de los casos, la purificación maxiprep estándar de la ADN plásmido es suficiente, aunque de clonación y de rescate procesos difíciles, debido al tamaño o la naturaleza de los transgenes, se pueden mejorar mediante la purificación de ADN a través de CsCl de densidad de centrifugación de gradiente. La eficacia de transfección usando Lipofectamine es por lo general suficiente para un rescate con éxito, aunque otros métodos de transfección, tales como nucleofection también se pueden utilizar. En cualquier caso, la relación de los diferentes plásmidos necesita ser estrictamente mantenido (0.4:0.2:0.2:1 para NP-PL-pNDV, respectivamente). Debido a la naturaleza laboriosa y de alguna manera estocástica del proceso de rescate, por lo menos 2-4 pozos diferentes deben ser transfectadas por constructo a ser rescatado, y diferentes clones de la misma construcción deben ensayarse.

En el protocolo que hemos descrito aquí, utilizamos MVA-T7 para proporcionar en trans la polimerasa de T7 necesario para la expresión de las construcciones de ADNc virales. Aunque este es el procedimiento estándar en nuestro laboratorio, no es el único enfoque posible. Por ejemplo, otros grupos han rescatado con éxito NDV y otros no segmentados, los virus ARN de cadena negativa mediante el uso de líneas celulares que expresan constitutivamente altos niveles de T7 polimerasa 4,37. La disponibilidad de un vector recombinanteo una línea celular que codifica la polimerasa T7, así como el cumplimiento específico de uno u otro enfoque en un laboratorio dado, deben ser considerados al establecer de nuevo el sistema de rescate de NDV.

Después de la determinación de la presencia del NDV en el fluido alantoideo por HA, más estudios se han de realizar para caracterizar completamente el virus recién rescatado, tales como RT-PCR seguida de secuenciación del genoma viral, IFA y Western-Blot (WB) para determinar la expresión del gen extraño (si es aplicable). Dependiendo de la naturaleza de las modificaciones que los virus recombinantes están llevando, también podría ser necesario otro tipo de ensayos bioquímicos y funcionales.

El rescate de NDV recombinante a partir de ADNc es una técnica útil para múltiples razones. En primer lugar y la más obvia, esta técnica proporciona con la capacidad de analizar la biología de la enfermedad de Newcastle, un virus de relevancia económica para la industria aviar, alterando experimentalmente sus genes y secuencias reguladoras. NDV es un paramixovirus estrechamente relacionado con patógenos humanos, como el sarampión, la parotiditis y virus sincitial respiratorio, así como los emergentes, altamente patógena Hendra y Nipah, la investigación sobre el ciclo de vida básico de esta familia de virus es importante para entender su biología. Más allá de la investigación básica, NDVs recombinantes tienen un gran potencial como vacuna y vectos oncolíticos, la combinación de la posibilidad de llevar los genes extranjeras en sus genomas con un perfil de seguridad de la biotecnología, así evaluado. Por todas estas razones, el protocolo de rescate NDV puede ser un activo valioso para muchos laboratorios de todo el mundo interesados ​​en la investigación del virus, el desarrollo de vacunas y el tratamiento del cáncer.

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Disclosures

Adolfo García-Sastre es un inventor de las patentes sobre los virus recombinantes de la enfermedad de Newcastle que son propiedad de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a los miembros del pasado y presente en los laboratorios de los Dres. Peter Palese y Adolfo García-Sastre para el desarrollo de técnicas de genética inversa NDV y de asistencia técnica. La investigación en el virus de la enfermedad de Newcastle en el laboratorio AG-S está parcialmente financiado por NIAD conceder R01AI088770 y por el Departamento de Centro de Excelencia de Seguridad Nacional de Ciencia y Tecnología para enfermedades emergentes y zoonóticas de los animales (CEEZAD, número de concesión 2010-ST-061-AG001). La investigación en laboratorio LM-S es financiado por los NIH subvenciones RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, los Centros de Excelencia del NIAID para la Investigación de la Influenza y Vigilancia (HHSN266200700008C), y la Universidad de Rochester Centro de Biodefensa Inmune Modeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

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References

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Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA
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Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

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