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Immunology and Infection

सीडीएनए से संयोजक न्यूकासल रोग वायरस का बचाव

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

न्यूकासल रोग वायरस (NDV) बड़े पैमाने पर अन्य लोगों के अलावा, टीकाकरण और उपचार के लिए नए वैक्टर विकसित करने के लिए पिछले कुछ वर्षों में अध्ययन किया गया है. इन अध्ययनों के कारण इस तरह हम यहाँ वर्णन उन के रूप में सीडीएनए से पुनः संयोजक वायरस बचाव के लिए तकनीक, संभव हो गया है.

Abstract

न्यूकासल रोग वायरस (NDV), परिवार Paramyxoviridae 1 की Avulavirus जीनस का प्रोटोटाइप सदस्य, एक गैर खंडों, नकारात्मक भावना, एकल असहाय, टीकाकरण के लिए एक वेक्टर के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के साथ शाही सेना वायरस (चित्रा 1) छा और है मानव रोगों का इलाज. इन आवेदनों की गहराई अन्वेषण केवल सीडीएनए 2-5 के रूप में उनकी पूर्ण जीनोम एन्कोडिंग plasmids से पुनः संयोजक वायरस बचाव के लिए रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक की स्थापना के बाद संभव हो गया है. वायरल सीडीएनए सुविधा वायरस के जीनोटाइप को बदलने के लिए और / या नए ट्रांसक्रिप्शनल इकाइयों में शामिल करने के लिए मानक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करके इन विट्रो में संशोधित किया जा सकता है. ऐसे आनुवंशिक रूप से संशोधित वायरस से बचाव कारकों संक्रमण के कई चरणों को प्रभावित करने, और साथ ही एंटीजन की अभिव्यक्ति और वितरण के लिए वैक्टर के विकास और सुधार के लिए अनुमति देता है समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता हैटीकाकरण और उपचार के लिए. यहाँ हम पुनः संयोजक NDVs के बचाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

Introduction

न्यूकासल रोग वायरस (NDV), Avulavirus जीनस 1 से संबंधित एक एवियन paramyxovirus, गंभीर रूप से दुनिया भर के सभी पोल्ट्री खेती को प्रभावित कर सकते हैं जो एक आर्थिक रूप से प्रासंगिक और इस तरह व्यापक रूप से शोध और surveilled जूनोटिक एजेंट है. नहीं एक मानव रोगज़नक़ हालांकि, NDV भी अच्छी तरह से एक मॉडल paramyxovirus के रूप में और इसकी वजह से बेहद रोचक, प्राकृतिक oncolytic गुणों से 6 दोनों पशुचिकित्सा क्षेत्र से परे अध्ययन किया गया है. NDV पर अनुसंधान बहुत पहले CONZELMANN और coleagues 2 से रेबीज वायरस के लिए वर्णित एकल असहाय, गैर खंडों नकारात्मक भावना आरएनए वायरस, के लिए रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक के विकास से लाभ हुआ. विदेशी जीन या उनके जंगली प्रकार जीनोम के संशोधनों को ले जाने आनुवंशिक रूप से संशोधित NDVs, की एक किस्म व्यापक रूप से कभी के बाद से अध्ययन किया गया है. इन पुनः संयोजक वायरस के साथ काम NDV की बल्कि अन्य प्रासंगिक हुमा की न केवल अलग विषैलापन कारकों को चिह्नित करने के लिए आलोचना की गई हैn इस तरह इन्फ्लूएंजा ए वायरस के रूप में 7 रोगजनकों - या आकस्मिक Nipah वायरस 8. इसके अलावा, विभिन्न अध्ययनों के एक नंबर ज्यादातर वायरस के immunostimulatory गुणों को बढ़ाने के द्वारा, NDV 6,9,10 की जन्मजात antitumoral गतिविधि में सुधार के लिए इन तकनीकों के प्रयोग का पता लगाया है. पुनः संयोजक NDVs पर अनुसंधान के अन्य प्रासंगिक क्षेत्र इन्फ्लूएंजा 5,11,12 के रूप में अन्य वायरल बीमारियों के खिलाफ टीका उम्मीदवारों की पीढ़ी कर दिया गया है, एचआईवी 13, सार्स 15, 14 खसरा, या कि श्वसन sincytial वायरस (आरएसवी) 16 की वजह से. NDV द्वारा प्रदान की विभिन्न उल्लेखनीय फायदे मानव आबादी में प्रतिरक्षा preexisting की कमी कर रहे हैं के बीच, विदेशी आनुवंशिक सम्मिलित करता है, recombinatory गतिविधि की कमी और समग्र aforementioned प्राकृतिक immunostimulatory गुण 17 के साथ संयुक्त एक उच्च सुरक्षा प्रोफाइल की स्थिरता. यह भी पी में पुनः संयोजक बीवालेन्त टीके की क्षमता का उपयोग उल्लेखनीय हैoultry, NDV दोनों के खिलाफ रक्षात्मक और उच्च रोगजनक एवियन इन्फ्लूएंजा 11,12 वायरस. इस प्रकार भी मनुष्य के लिए खतरनाक बर्ड फ्लू के संभावित अंतर - विशिष्ट कूद को रोकने में मदद, पालतू जानवरों के लिए जंगली से फैल बाद के अवसरों को कम करने के लिए एक शानदार तरीका हो सकता है. अंत में, रिपोर्टर व्यक्त NDV सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के साथ ही कई वायरस 18-27 द्वारा इनकोडिंग इंटरफेरॉन प्रतिपक्षी की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है.

एक पुनः संयोजक का बचाव प्रक्रिया, गैर खंडों, नकारात्मक असहाय आरएनए वायरस मूल रूप से कृत्रिम रूप से Ribonucleoprotein या RNP के रूप में जाना न्यूनतम संक्रामक आणविक मशीनरी, चित्रा (2) एन्कोडिंग सीडीएनए transfecting द्वारा एक उत्पादक सेल में एक वायरल प्रतिकृति चक्र मजबूर पर होते हैं. RNPs वायरल पोलीमर्स (पी और एल प्रोटीन) से मिलकर बनता है, nucleoprotein (एनपी) और वायरस के पूर्ण लंबाई antigenomic आरएनए. इस शाही सेना + antigenome वें हैभी वायरल RNP के प्रोटीन के आराम के साथ जुड़ा हुआ है, जो पूरक आरएनए जीनोम की पीढ़ी के लिए आवश्यक ई टेम्पलेट, एक प्राकृतिक वायरस संक्रमण पर सेल के cytoplasm (चित्रा 2A पर रिलीज होगी कि एक ही संक्रामक जटिल स्मरण दिलाता है ). बाद में इस कदम से, वायरल चक्र स्वाभाविक रूप से आगे बढ़ सकते हैं और संशोधित जीनोम encapsidating पुनः संयोजक virions, चित्रा (2 बी) उत्पन्न हो जाएगा. उल्लेखनीय है, बजाय antigenomic सीडीएनए के जीनोमिक सीडीएनए के अभिकर्मक बहुत impairs या पूरी तरह से बचाव दक्षता 2,28-30 समाप्त करता है. Antigenomic सीडीएनए ट्रांसफ़ेक्ट है, तब भी जब कोशिकाओं में RNPs में पुनः संयोजक शाही सेना के encapsidation की दक्षता शायद बहुत कम है. इस वजह से, NDV के लिए बचाव प्रोटोकॉल अक्सर अनुमोदक कोशिकाओं के साथ और / या द्वारा उन्हें coculturing द्वारा मूल रूप से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से जारी कुछ वायरल कणों के प्रवर्धन के लिए विभिन्न चरणों में शामिलembryonated अंडे का संक्रमण.

पिछले बचाव के लिए, सीडीएनए वांछित संशोधनों उत्पन्न करने के क्रम में मानक क्लोनिंग प्रक्रियाओं द्वारा चालाकी से किया जा सकता है. विभिन्न जीन उत्पादों और वायरस के विनियामक दृश्यों के विशिष्ट परिवर्तन straightforwardly इस तरह से प्राप्त किया जा सकता है, पुनः संयोजक NDV शामिल प्रकाशित काम के कई NDV जीनोम में एक नया ट्रांसक्रिप्शनल इकाई के अलावा आवश्यकता है. Paramyxovirus परिवार के अन्य सदस्यों की तरह, NDV जीनोम विभिन्न वायरल जीवन चक्र 1 के लिए महत्वपूर्ण एक कम ढाल में 3 'के अंत तक उनके स्थान सम्मान के आधार पर व्यक्त कर रहे हैं जो छह ट्रांसक्रिप्शनल इकाइयों में आठ विभिन्न प्रोटीन encodes. इस वजह से, जीनोम के भीतर नई ट्रांसक्रिप्शनल इकाई के स्थान को ध्यान से वायरल प्रतिकृति के transgene और हानि की अभिव्यक्ति के बीच एक संतुलन प्राप्त करने के लिए चुना जाना चाहिए. पी और एम जीन के बीच निवेशन सबसे, टी इस्तेमाल किया गया हैHough अन्य साइटों को भी 13,31 परीक्षण किया गया है.

(मैं) NDV जीनोम में शामिल होने के लिए किसी भी नए जीन वायरल शाही सेना पर निर्भर शाही सेना के लिए उपयुक्त संकेतों के नियंत्रण के अधीन हो गया है: जो कुछ भी डालने, NDV सीडीएनए में क्लोनिंग एक rescuable निर्माण उत्पन्न करने के लिए कुछ नियमों का पालन करने की जरूरत है पोलीमर्स. इन दृश्यों नया खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) के अपस्ट्रीम में जोड़ा जाना चाहिए ताकि पोलीमर्स एक एकल nucleotide intergenic अनुक्रम (आईजी) से स्थान दिया गया है, जो पिछले जीन (जीई) और नई transgene (जी एस) की शुरुआत के अंत पहचान सकते हैं . Paramyxoviridae परिवार के अधिकांश सदस्यों के लिए के रूप में NDV (ii) कुशल प्रतिकृति, जीनोम लंबाई के कई किया जा रहा है पर निर्भर है, एक वैध कोज़ाक (कश्मीर) यूकेरियोटिक ribosomal अनुवाद में सुधार करने के अनुक्रम के अलावा भी बेहतर विदेशी प्रोटीन अभिव्यक्ति 32 के लिए सिफारिश की है छह 33, इसलिए NDV में किसी भी प्रविष्टि इस "छह के नियम" का पालन किया है. यदि आवश्यक हो, अनुरोधuired अतिरिक्त nucleotides बहाव के नए ओआरएफ जोड़ा जा सकता है, और (iii) transgene की अनुक्रम खोजने के लिए जाँच की जानी चाहिए संभव जीई और बचाव दक्षता, transgene अभिव्यक्ति और / या वायरस व्यवहार्यता प्रभावित हो सकती है, जो दृश्यों की तरह जी एस. अगर मौजूद है, इन दृश्यों चुप mutagenesis के द्वारा हटा दिया जाना चाहिए. aforementioned नियमों का पालन पुनः संयोजक पूरी लंबाई सीडीएनए की पीढ़ी कुशलता से यहाँ विस्तृत रूप में एक आनुवंशिक रूप से संशोधित NDV उत्पादन के क्रम में पहला कदम है.

सिस्टम में सभी डीएनए निर्माणों T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर (चित्रा 3) के नियंत्रण में हैं. इस cytoplasmic पोलीमर्स एक पुनः संयोजक संशोधित चेचक अंकारा वायरस (एमवीए-T7) 34 के साथ coinfection द्वारा ट्रांस में प्रदान की जाती है. चित्रा 3A पूर्ण लंबाई antigenomic सीडीएनए 5 encodes जो pNDV-B1 प्लाज्मिड, दिखा. चित्रा 3B pTM1 plasmids एनपी एन्कोडिंग से पता चलता है, पी और एल ORFs. , यू encodes जो प्लास्मिड pCITE GFP,nder T7 प्रमोटर, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), और चिकन बीटा actin के प्रमोटर 35 के तहत एक ही ओआरएफ encodes जो pCAGGS GFP 18, नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में हम lentogenic NDV तनाव Hitchner बी 1 से 5 (चित्रा 4) के सीडीएनए से पुनः संयोजक NDV बचाव के लिए प्रक्रिया दिखा.

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Protocol

1. स्तनधारी कोशिकाओं की तैयारी (चित्रा -4 ए, दिन 1)

स्प्लिट एचईपी-2 या A549 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटें में अभिकर्मक से पहले दिन. कोशिकाओं के घनत्व अगले दिन 80-90% संगम तक पहुंच जाना चाहिए. आमतौर पर, एक मिला हुआ 100 मिमी पकवान 8 कुओं में (अच्छी तरह से प्रति 6 से 10 एक्स 1 के आसपास की कोशिकाओं) को विभाजित किया जा सकता है. प्रत्येक वायरस बचाया जा करने के लिए, 2-4 अलग कुओं शामिल किया जाना चाहिए, साथ ही साथ क्रमश अभिकर्मक और एमवीए-T7 संक्रमण क्षमता पर नजर रखने के उद्देश्य से नियंत्रण pCAGGS-GFP और pCITE-GFP 18 के लिए 2 अतिरिक्त कुओं,,.

2. जीवाणुभोजी T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (एमवीए-T7) व्यक्त संयोजक संशोधित चेचक अंकारा वायरस के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के संक्रमण (चित्रा -4 ए, 2 दिन)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस 1x/BA/PS और मीडिया को गर्म
  2. पीबीएस 1x/BA/PS के 1 मिलीलीटर के साथ, दो बार, कोशिकाओं को धो लें.
  3. संक्रमण की बहुलता (कम से एमवीए-T7 वायरस के साथ सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं को संक्रमित Moi) 1 के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस / बीए / पी एस में 200 μl के अंतिम मात्रा में pfu / सेल.
  4. 3 में वर्णित के रूप में वायरल संक्रमण ऊष्मायन के दौरान, अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें.

3. स्तनधारी कोशिकाओं के अभिकर्मक (चित्रा -4 ए, 2 दिन)

  1. Lipofectamine की तैयारी: बचाव के प्रयास प्रति OptiMEM के 250 μl के साथ LPF2000 की 1-2 ग्राम मिक्स और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. डीएनए की तैयारी: OptiMEM के 50 μl में प्रत्येक बचाव के लिए एक प्लाज्मिड कॉकटेल बनाओ. 0.4 pTM1 एनपी के ग्राम, pTM1 पी के 0.2 ग्राम, और ट्यूब प्रति pTM1 एल के 0.2 ग्राम जोड़ें. प्रत्येक ट्यूब बचाया जा NDV की पूरी लंबाई सीडीएनए क्लोन की 1 ग्राम जोड़ें. इसके अलावा दो नियंत्रण transfections, pCAGGS-GFP की 2 ग्राम के साथ एक (अभिकर्मक दक्षता की जांच करने के लिए) और (T7 पोलीमर्स एमवीए-T7 द्वारा अभिव्यक्ति संचालित की जांच करने के लिए) pCITE-GFP की 2 ग्राम के साथ अन्य तैयार करते हैं.
  3. LPF2000-OptiMEM समाधान 5 मिनट (3.1 कदम) के लिए preincubated किया गया है, जोड़ना 250डीएनए ट्यूबों के समाधान के μl (3.2 कदम) और कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. एमवीए-T7 साथ ऊष्मायन के बाद, आकांक्षा से वायरस inoculum हटाने और डीएनए LPF2000 अभिकर्मक मिश्रण (3.3 कदम) के साथ बदलें.
  5. प्रत्येक पकवान DMEM 10% FBS / पी एस के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 6-8 घंटे (या रात) के लिए संक्रमित / ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को सेते हैं और फिर ताजा DMEM 10% FBS / पी एस के 1.5 मिलीलीटर के साथ अभिकर्मक मीडिया की जगह.
  7. 24 घंटा बाद अभिकर्मक पर नियंत्रण कुओं अभिकर्मक दक्षता (pCAGGS GFP) और T7 पोलीमर्स गतिविधि (pCITE GFP) (चित्रा 5A) का आकलन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है. नीचे वर्णित के रूप में एवियन fibroblasts के साथ संक्रमित / ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के सह संस्कृति के साथ आगे बढ़ें.

4. एवियन कोशिकाओं के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के सह संस्कृति (चित्रा -4 ए, 3 दिन)

आमतौर पर, चिकन का एक मिला हुआ 100 मिमी टिशू कल्चर पकवान (CEFs) ओआर बतख (defs) भ्रूण fibroblasts दो ट्रांसफ़ेक्ट कुओं प्रति प्रयोग किया जाता है. अग्रिम में, सभी बचाव के प्रयास प्रति एवियन कोशिकाओं का पर्याप्त 100 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें. वायरस के कुशल बचाव के लिए, DMEM 10% FBS / पी एस मीडिया द्रव्य और 30 मिमी 2 MgCl के 5% के साथ पूरक है. इस बिंदु पर, 24 घंटा पीआई, स्तनधारी कोशिकाओं के कारण एमवीए-T7 संक्रमण, चित्रा 5A में asevident को कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई) दिखाना शुरू कर सकते हैं.

  1. 37 डिग्री सेल्सियस तक पीबीएस 1x और मीडिया को गर्म
  2. पीबीएस 1x के 1 मिलीलीटर के साथ, 2x, स्तनधारी कोशिकाओं को धो लें.
  3. वे अलग तक EDTA-trypsin के 0.2 मिलीलीटर के साथ स्तनधारी कोशिकाओं Trypsinize. DMEM 10% FBS / पी एस के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend, 5% द्रव्य, 30 मिमी 2 MgCl और एक 100 मिमी टिशू कल्चर डिश के लिए स्थानांतरण. एक ही मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. पीबीएस 1x के 4 एमएल के साथ, दो बार, एवियन कोशिकाओं को धो लें.
  5. कोशिकाओं को अलग जब तक 1 EDTA-trypsin के मिलीग्राम और साथ Trypsinize एवियन कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए सेते हैं. Resuspend वें8 DMEM 10% FBS / पी एस, 5% द्रव्य, 30 मिमी 2 MgCl के मिलीग्राम और 8 की कुल मात्रा के लिए सह सुसंस्कृत 100 मिमी टिशू कल्चर पकवान में स्तनधारी कोशिकाओं को trypsinized कोशिकाओं के 4 मिलीलीटर जोड़ने जोड़ने ई कोशिकाओं मिलीलीटर (4 मिलीलीटर स्तनधारी, 4 मिलीलीटर एवियन कोशिकाओं).
  6. धीरे एक समान वितरण होगा और फिर 3-4 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उन्हें जगह के क्रम में हाथ से 100 मिमी पकवान में सह संवर्धित कोशिकाओं हिला. 3 या 4 दिन स्तनधारी और एवियन कोशिकाओं के सह संस्कृति के बाद अंडे को संक्रमित करने के लिए मापदंड (सेल गोलाई, मृत्यु, सतह से सेना की टुकड़ी, आदि.) एमवीए-T7 वायरल संक्रमण में मनाया जाता है कितना कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव पर निर्भर करता है.

5. चिकन embryonated अंडे के संक्रमण (चित्रा -4 ए, दिन 6-7)

  1. स्तनधारी और एवियन कोशिकाओं के सह संस्कृति के 3-4 दिनों के बाद, टिशू कल्चर पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर हटाने और एक Eppendorf ट्यूब को जोड़ने.
  2. एक बेंच में 12,000 rpm पर 1 मिनट के लिए टिशू कल्चर पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्रसेलुलर मलबे को हटाने के लिए शीर्ष अपकेंद्रित्र.
  3. हवा की थैली और अपरापोषिकीय गुहा के बीच इंटरफेस को देखने के लिए एक प्रकाश Candling बॉक्स का उपयोग अंडे मोमबत्ती. इंटरफ़ेस सीमा रक्त वाहिका स्थानीयकरण से बचने पर एक निशान बना. बाँझ शर्तों की स्थापना के लिए अंडे पर 70% इथेनॉल स्प्रे. धीरे चिह्नित मौके पर ही खोल में एक छेद बनाने के लिए और अपरापोषिकीय गुहा में खड़ी है और सीधे सुई लक्ष्य, एक इंसुलिन (1 मिलीलीटर) सिरिंज का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला के 500 μl टीका लगाना. (चित्रा 4 बी).
  4. पिघला मोम या तेल के साथ खोल में निक सील.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए अंडे सेते

6. संक्रमित चिकन embryonated अंडे से द्रव्य (चित्रा -4 ए, दिन 8-10) की फसल

  1. चिकन भ्रूण को मारने और खून जमना क्रम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 घंटे या रात भर के लिए संक्रमित अंडे सेते हैं.
  2. 70% इथेनॉल (बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए) के साथ अंडे का छिड़काव करें.
  3. ध्यान से एक चम्मच के साथ हवा गुहा के ऊपर अंडे के शिखर अनुभाग,, नल. Eggshell फटा हो जाने के बाद, संदंश के साथ टुकड़े हटाने और पूरी तरह से अपरापोषिकीय झिल्ली बेनकाब.
  4. रक्त वाहिकाओं को नुकसान और जर्दी से परहेज, संदंश और कैंची से अपरापोषिकीय झिल्ली excising द्वारा अपरापोषिकीय गुहा बेनकाब.
  5. ध्यान से एक रंग के साथ भ्रूण नीचे धक्का और एक 10 एमएल पिपेट साथ upflowing द्रव्य (अंडा प्रति 8-12 मिलीग्राम) इकट्ठा. जर्दी झिल्ली को नुकसान पहुँचाए से बचें. बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (अंडा प्रति एक ट्यूब का उपयोग करें) को द्रव्य स्थानांतरण.
  6. 1500 rpm पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा द्रव्य स्पष्ट करें. गोली परेशान बिना एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  7. 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के नमूने, hemagglutination परख द्वारा NDV की उपस्थिति के लिए उन्हें जाँच जब तक.

7. Hemagglutination (एचए) परख

allant में वायरस की उपस्थितिसंक्रमित अंडे से ओआईसी द्रव तुर्की लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) hemagglutinate करने की क्षमता से macroscopically निर्धारित किया जा सकता है. NDV के मामले में, मिलीग्राम प्रति इकाइयों के गठन लगभग 10 6 पट्टिका (pfu) हा परख में एक सकारात्मक संकेत देने के लिए आवश्यक हैं. हा assays वी के नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें में किया जाता है. नकारात्मक (पीबीएस 1x, असंक्रमित द्रव्य) के साथ ही सकारात्मक (किसी NDV वायरस से द्रव्य) नियंत्रण के नमूने हमेशा यह मान्य करने के लिए किसी भी हा परख में शामिल किया जाना चाहिए. एक हा परख प्रदर्शन करने के लिए:

  1. पिपेट एक वी के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति पीबीएस 1x के 50 μl.
  2. पिपेट थाली का पहला स्तंभ पर कुओं में द्रव्य के नमूने के 50 μl. थाली के बाकी के माध्यम से 2 गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन और अंतिम स्तंभ में कुओं से पिछले, अतिरिक्त 50 μl त्यागें.
  3. अच्छी तरह से प्रति पीबीएस 1x में 0.5% तुर्की आरबीसी के 50 μl बांटना. धीरे दोहन से थाली हिला.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस (या बर्फ) च पर थाली सेतेया 30-45 मिनट या एक स्पष्ट गोली तक नकारात्मक नियंत्रण कुओं में बनाई है.

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Representative Results

NDV का बचाव नियमित वायरस का पूरा सीडीएनए लिए उपयोग किया है कि प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन एक सुस्थापित प्रक्रिया है. हालांकि, विधि के आंतरिक स्टोकेस्टिक प्रकृति यह कठिन 100% बचाव दक्षता हासिल करने के लिए बनाता है. प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों, एमवीए-T7 के साथ विशेष अभिकर्मक दक्षता और संक्रमण निगरानी संभव समस्याओं. चित्रा 5A मानक अभिकर्मक और एक सफल NDV बचाव के लिए पर्याप्त हैं कि अभिकर्मक / संक्रमण क्षमता से पता चलता है की पहचान करने में मदद करता है. एवियन स्तनधारी सह संस्कृतियों और embryonated अंडे में प्रवर्धन के दौर के बाद, बचाया वायरस की उपस्थिति हा परख में सकारात्मक कुओं से पता चला है. NDV एरिथ्रोसाइट्स जोड़ने के द्वारा hemagglutination लाती है और इस प्रकार अच्छी तरह से वी के आकार के तल में उनके अवसादन रोकता है. इसलिए, हा गतिविधि की कमी को आसानी से आरबीसी का एक लाल, गोल गोली (चित्रा 5 ब) के गठन से प्रतिष्ठित किया जा सकता. नकारात्मक परिणामहा परख में होने वाले द्रव्य में वायरस की एक अपर्याप्त अनुमापांक के लिए किया जा सकता है: लगभग 10 6 pfu / मिलीलीटर की एक न्यूनतम अनुमापांक एक सकारात्मक हा परिणाम है की आवश्यकता है. लोअर वायरल titers अभी भी विशिष्ट विरोधी NDV एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence परख (यूके) द्वारा पता लगाया जा सकता है. पहला टीका अंडे में मौजूद वायरस के आगे प्रवर्धन के लिए अंडे पर एक नया बीतने के इन मामलों में सिफारिश की है.

चित्रा 1
चित्रा 1. न्यूकासल रोग वायरस (NDV) के जीनोम संगठन NDV की गैर खंडों, एकल असहाय नकारात्मक भावना आरएनए जीनोम (NT) लंबे 15,186 nucleotides है और छह ट्रांसक्रिप्शनल इकाइयों में आठ अलग polypeptides encodes:. एनपी, पी, एम, एफ, हेमवती और एल प्लस वी और डब्ल्यू प्रोटीन, प्रतिलेखन के दौरान पी ओआरएफ के पढ़ने के फ्रेम में बदलाव के बाद शुरु हुआ. Noncoding, विनियामक दृश्यों पार्श्वमें जीनोम अपनी 3 '(नेता) और 5' (ट्रेलर) समाप्त हो जाती है. इसके अलावा intergenic जीन अंत (जीई), (आईजी) noncoding और जीन प्रारंभ (जीएस) दृश्यों अलग ORFs के बीच में वायरल पोलीमर्स गतिविधि को विनियमित. वायरल जीनोम पर विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को जीवन चक्र 1 'प्रभावी रूप से वायरस के लिए महत्वपूर्ण एक ढाल बनाने, (यानी एनपी टेप एल से कम देखिए, सबसे प्रचुर मात्रा में हैं) अंत' 3 करने के लिए उनके रिश्तेदार स्थान सम्मान पर निर्भर करते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. क्लोन डीएनए से NDV बचाव. एक प्राकृतिक (ए) के बीच योजनाबद्ध तुलना और बचाव की प्रक्रिया के दौरान कृत्रिम रूप से प्रेरित (बी) के चक्र के आधार पर. (ए) लक्ष्य सेल को संलग्न करने के बाद, वायरस encapsidated cytoplasm में अपनी जीनोमिक सामग्री विज्ञप्ति RNPs में. शाही सेना पोलीमरेज़ वायरल प्रोटीन की और नवजात virions में शामिल किया जाएगा कि मूल जीनोम की कई प्रतियां के उत्पादन के लिए टेम्पलेट है जो एक पूरक, पूरी लंबाई antigenomic आरएनए + प्रतिलिपि, में विभिन्न mRNAs में आरएनए जीनोम transcribes. (बी ) बचाव की प्रक्रिया के दौरान, RNPs (एन पी, पी और एल प्रोटीन, साथ ही साथ एक पूर्ण लंबाई, आमतौर पर संशोधित antigenomic आरएनए) के घटक सीडीएनए अभिकर्मक द्वारा प्रदान की जाती हैं. ट्रांसफ़ेक्ट सेल के cytoplasm में antigenomic RNPs के पुनर्गठन पर, वे पूरक, पुनः संयोजक जीनोमिक RNPs उत्पादन कर सकते हैं और एक पूरे चक्र फिर पुनः संयोजक वायरस के रिलीज के साथ समाप्त, नए सिरे से शुरू कर सकते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. पुनः संयोजक NDV की पीढ़ी के लिए अभिव्यक्ति plasmids T7 संचालित. (एक) पूर्ण लंबाई वायरल सीडीएनए: गुT7 प्रमोटर (पी T7) और हेपेटाइटिस डेल्टा ribozyme (एचडीआर) दरार युक्त T7 टर्मिनेटर अनुक्रम (टी T7) के तहत lentogenic NDV तनाव Hitchner बी 1 antigenome की अभिव्यक्ति ड्राइविंग ई पूरी लंबाई pNDV-B1 एम्पीसिलीन प्रतिरोध प्लाज्मिड. pNDV-B1 मूल रूप से पी और एम जीन 5 के बीच विदेशी आवेषण ले जाने के लिए डिजाइन किया गया था. एक नए जीन (XbaI साइट) की प्रविष्टि वायरल पोलीमर्स द्वारा अपने कार्य मान्यता अनुमति देने के लिए नियामक जीन अंत (जीई) के अलावा, intergenic (आईजी) और जीन प्रारंभ (जीएस) दृश्यों की आवश्यकता है. Transgene की अभिव्यक्ति दक्षता 32 कोडोन शुरू नदी के ऊपर एक कोज़ाक (कश्मीर) अनुक्रम के अलावा के साथ सुधार किया जा सकता है. NDV सीडीएनए में पेश पूरे कैसेट सबसे paramyxovius जीनोम के कुशल प्रतिकृति है कि ड्राइव 33 "छह के नियम" का पालन करने के लिए छह से विभाज्य nucleotides की कुल संख्या की जरूरत है (बी) प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids:. वायरल एनपी, पी, और flanked एल ORFs,T7 प्रमोटर (पी T7), मस्तिष्क एवं हृद् - पेशी का शोथ वायरस (EMC) के UTR और T7 टर्मिनेटर (टी T7) द्वारा दृश्यों pTM1 रीढ़ एम्पीसिलीन प्रतिरोध वेक्टर 5,36 में क्लोन किया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4. पुनः संयोजक न्यूकासल रोग वायरस की पीढ़ी के लिए प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक. (ए) वायरल बचाव: A549 या एचईपी-2 कोशिकाओं संशोधित चेचक वायरस अंकारा जीवाणुभोजी T7 पोलीमरेज़ (एमवीए-T7) व्यक्त से संक्रमित हैं. वायरल संक्रमण के बाद, कोशिकाओं T7 प्रमोटर के तहत, एक साथ पूरी लंबाई NDV सीडीएनए साथ, NDV वायरल जीनोम (एन पी, पी, और एल) की प्रतिकृति और प्रतिलेखन के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट हैं. चौबीस घंटे post-infection/transfection, स्तनधारी कोशिकाओं (CEF चिकन या बतख भ्रूण fibroblasts के साथ सह सुसंस्कृत हैं औरडेफ, क्रमशः). सह संस्कृति, 8-10 दिन पुरानी चिकन embryonated अंडे आगे प्रवर्धन के लिए सह संस्कृति कोशिकाओं के टिशू कल्चर supernatants साथ inoculated हैं तीन से चार दिनों के बाद. दो से तीन दिनों में 37 डिग्री सेल्सियस पर 8-10 दिन पुरानी अंडे की ऊष्मायन के बाद, अंडे से द्रव्य हा परख द्वारा पुनः संयोजक वायरस का सफल बचाव के लिए काटा और विश्लेषण किया जाता है. धनात्मक (+) बचाव वायरस आगे जीनोमिक (RT-पीसीआर) में विशेषता है और प्रोटीन (जैसे immunofluorescence परख (यूके) और वेस्टर्न ब्लॉट (पश्चिम बंगाल) के स्तर नकारात्मक हैं (-.) हा परिणामों की वजह से होने के लिए पर्याप्त वायरस की कमी के कारण हो सकता है . वायरस बढ़ाना ताजा चिकन embryonated अंडे की हा पुनर्संक्रमण द्वारा पता लगाया संकेत दिया है चिकन embryonated अंडे का (बी) के संक्रमण:. 8-10 चिकन embryonated अंडे हवा की थैली और अपरापोषिकीय गुहा के बीच इंटरफेस को चिह्नित करने के candled रहे एक इंसुलिन के साथ. (1 मिलीलीटर) सिरिंज, अंडे अपरापोषिकीय CAVI अंदर टिशू कल्चर पर तैरनेवाला से संक्रमित होते हैंTy, संकेत के रूप में.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि परिणाम है. (ए) अभिकर्मक और एमवीए-T7 संक्रमण क्षमता: प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट (बाएं) और pCAGGS-GFP (ऊपर) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या एमवीए-T7 से संक्रमित और pCITE-GFP (नीचे) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट A549 कोशिकाओं के उज्ज्वल (दाएं) क्षेत्रों सचित्र हैं . PCAGGS द्वारा संचालित विधान GFP अभिव्यक्ति T7 प्रमोटर pCITE द्वारा GFP अभिव्यक्ति संचालित जबकि एमवीए-T7 संक्रमण और T7 पोलीमर्स गतिविधि के लिए एक नियंत्रण है, अभिकर्मक दक्षता का सूचक है. द्रव्य में वायरल कणों की उपस्थिति hemagglutination लाती है, अच्छी तरह से आकार का एक वी के तल में गोली की कमी के द्वारा दिखाया गया है जो: प्रकोष्ठों 24 घंटा post-transfection/post-infection (बी) hemagglutination परख (हेक्टेयर) में imaged थे. वायरस की अनुपस्थिति की अनुमति देता वें के तल में एक लाल गोली का गठनई अच्छी तरह से. चित्रा पता चलता है दोनों किसी भी हा परख के लिए आवश्यक नियंत्रण (नकारात्मक, स्वच्छ द्रव्य, सकारात्मक, एक पहले से ही विशेषता NDV नमूना), और सकारात्मक दो (+) के साथ एक बचाव के बाद प्राप्त तीन अज्ञात के नमूनों के परिणाम और एक नकारात्मक (-) परिणाम.

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Discussion

कई कारकों NDV बचाव करते हुए अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना है. सबसे पहले, प्रयोग की जाने वाली पूर्ण लंबाई सीडीएनए निर्माण NDV जीनोम में नए transgenes / संशोधनों के कार्यात्मक समावेश अनुमति देने के लिए तैयार होने की जरूरत है. (Ii) कोई ख्यात जीई या जी एस दृश्यों विदेशी में कर रहे हैं, जैसा कि ऊपर कहा यह (मैं) उपयुक्त जीन अंत (जीई), intergenic (आईजी) और जीन प्रारंभ (जीएस) दृश्यों यदि आवश्यक हो गयी हो रहे हैं, इसका मतलब है, जीन, और (iii) पूर्ण पुनः संयोजक जीनोम "छह के नियम" इस प्रकार है.

बचाव की प्रक्रिया के रूप में, प्लाज्मिड तैयारी की गुणवत्ता, एमवीए-T7 शेयरों के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के उचित रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं. Transgenes के आकार या प्रकृति के कारण मुश्किल क्लोनिंग और बचाव प्रक्रियाओं,, CSCL घनत्व ढाल centrifugation के माध्यम से डीएनए शुद्ध द्वारा सुधार किया जा सकता है, हालांकि मामलों से ज्यादातर के लिए, प्लास्मिड डीएनए के मानक maxiprep शुद्धि, पर्याप्त है. ली का उपयोग अभिकर्मक दक्षताऐसे nucleofection के रूप में अन्य अभिकर्मक तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि pofectamine, एक सफल बचाव के लिए आमतौर पर पर्याप्त है. किसी भी मामले में, विभिन्न plasmids के अनुपात सख्ती से (क्रमशः एनपी पी एल pNDV के लिए 0.4:0.2:0.2:1,) बनाए रखने की जरूरत है. कारण बचाव प्रक्रिया की श्रमसाध्य और किसी भी तरह स्टोकेस्टिक प्रकृति के लिए, कम से कम 2-4 अलग कुओं बचाया जा निर्माण प्रति ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए, और एक ही निर्माण के विभिन्न क्लोन assayed किया जाना चाहिए.

हम यहाँ का वर्णन किया है कि प्रोटोकॉल में, हम ट्रांस में वायरल सीडीएनए निर्माणों की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक T7 पोलीमर्स प्रदान करने के लिए एमवीए-T7 का उपयोग करें. यह हमारी प्रयोगशाला में मानक प्रक्रिया है, यह तभी संभव दृष्टिकोण नहीं है. उदाहरण के लिए, अन्य समूहों सफलतापूर्वक अनिवार्यता से T7 पोलीमर्स 4,37 के उच्च स्तर व्यक्त सेल लाइनों का उपयोग करके NDV और अन्य गैर खंडों, नकारात्मक किनारा आरएनए वायरस बचाया है. एक पुनः संयोजक वेक्टर की उपलब्धताNDV के लिए बचाव प्रणाली को नए सिरे से स्थापित करने जब या सेल लाइन एन्कोडिंग T7 पोलीमर्स, साथ ही एक दिया प्रयोगशाला में या तो दृष्टिकोण के विशिष्ट प्रदर्शन, विचार किया जाना चाहिए.

हा द्वारा द्रव्य में NDV उपस्थिति के निर्धारण के बाद आगे की पढ़ाई पूरी तरह से वायरल जीनोम का अनुक्रमण द्वारा पीछा ऐसे RT-पीसीआर के रूप में नव बचाया वायरस, को चिह्नित करने के लिए प्रदर्शन हो रहे हैं, यूके और पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए विदेशी जीन की (यदि लागू हो). पुनः संयोजक वायरस ले जा रहे हैं कि संशोधनों की प्रकृति पर निर्भर करता है, जैव रासायनिक और कार्यात्मक assays के अन्य प्रकार भी जरूरत हो सकता है.

सीडीएनए से पुनः संयोजक NDV से बचाव के कई कारणों के लिए एक उपयोगी तकनीक है. पहली और सबसे स्पष्ट है, इस तकनीक का प्रयोगात्मक इसके जीन और विनियामक दृश्यों बदलकर NDV, एवियन उद्योग के लिए एक आर्थिक रूप से प्रासंगिक वायरस, के जीव विज्ञान का विश्लेषण करने की क्षमता के साथ उपलब्ध कराता है. एनडीवी निकट मानव खसरा, कण्ठमाला का रोग या श्वसन syncytial वायरस की तरह रोगजनकों, साथ ही आकस्मिक, उच्च रोगजनक Hendra और Nipah वायरस से संबंधित एक paramyxovirus है, वायरस के इस परिवार की बुनियादी जीवन चक्र पर शोध उनके जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. बुनियादी अनुसंधान के अलावा, पुनः संयोजक NDVs एक अच्छी तरह से आकलन किया जैव सुरक्षा प्रोफाइल के साथ उनके जीनोम में foreing जीन ले जाने की संभावना के संयोजन, टीका और oncolytic vectos के रूप में एक महान क्षमता है. इन सभी कारणों के लिए, NDV बचाव प्रोटोकॉल वायरस अनुसंधान, टीके के विकास और कैंसर के इलाज में दिलचस्पी दुनिया भर में कई प्रयोगशालाओं के लिए एक मूल्यवान संपत्ति हो सकती है.

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Disclosures

Adolfo गार्सिया-Sastre माउंट सिनाई में मेडिसिन के Icahn स्कूल के स्वामित्व में हैं कि पुनः संयोजक न्यूकासल रोग वायरस पर पेटेंट के आविष्कारक है.

Acknowledgments

लेखक डीआरएस की प्रयोगशालाओं में अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. पीटर Palese और NDV के विकास के लिए Adolfo गार्सिया-Sastre आनुवांशिकी तकनीक और तकनीकी सहायता के लिए रिवर्स. NIAD R01AI088770 अनुदान और उत्कृष्टता के होमलैंड सुरक्षा विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र के विभाग द्वारा लिए द्वारा एजी-प्रयोगशाला में न्यूकासल रोग वायरस में रिसर्च आंशिक रूप से वित्त पोषित है उभरते और जूनोटिक पशु रोग (CEEZAD, पुरस्कार संख्या 2010-ST-061-AG001). एल एम एस प्रयोगशाला में रिसर्च एनआईएच अनुदान RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी (HHSN266200700008C) के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्र, और biodefense इम्यून मॉडलिंग के लिए रोचेस्टर सेंटर के विश्वविद्यालय (HHSN272201000055C) द्वारा वित्त पोषित है .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

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