Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

Newcastle disease virus (NDV) har blitt grundig studert i de siste årene for å utvikle nye vektorer for vaksinering og behandling, blant andre. Disse studiene har vært mulig på grunn av teknikker for å redde rekombinant virus fra cDNA, for eksempel de som beskrives her.

Abstract

Newcastle sykdomsvirus (NDV), prototypen medlem av slekten Avulavirus av familien Paramyxoviridae 1, er en ikke-segmentert negativ-sense, enkjedet, innhyllet RNA-virus (figur 1) med potensielle anvendelser som en vektor for vaksinasjon og behandling av menneskelige sykdommer. I inngående utforskning av disse programmene har bare blitt mulig etter etableringen av revers genetikk teknikker for å redde rekombinante virus fra plasmider som koder sine komplette genomer som cDNA 2-5. Viral cDNA kan enkelt modifiseres in vitro ved hjelp av standard-kloningsfremgangsmåter for å endre genotypen av viruset og / eller å inkludere nye transkripsjonelle enheter. Redning av slike genetisk modifiserte virus gir et verdifullt verktøy for å forstå faktorer som påvirker flere stadier av infeksjonen, samt gir mulighet for utvikling og forbedring av vektorer for ekspresjon og levering av antigenerfor vaksinering og behandling. Her beskriver vi en protokoll for redning av rekombinante NDVs.

Introduction

Newcastle disease virus (NDV), en aviær paramyxovirus tilhører Avulavirus slekten 1, er en økonomisk relevant og dermed mye forsket på og overvåket zoonotiske agent, som kan alvorlig påvirke fjørfe landbruk over hele verden. Selv ikke en menneskelig patogen, NDV har også blitt grundig studert utover veterinær feltet både som modell paramyxovirus og på grunn av sin svært interessante natur onkolytiske egenskaper seks. Forskning på NDV stor nytte av utviklingen av revers genetikk teknikker for single-strandet, ikke-segmenterte negative-sense RNA virus, først beskrevet for rabies virus ved Conzelmann og coleagues to. En rekke av genmodifiserte NDVs, bærer utenlandske gener eller modifikasjoner av deres villtype genom har vært mye studert siden den gang. Arbeidet med disse rekombinante virus har vært kritisk til å karakterisere ulike virulensfaktorer ikke bare av NDV men også av annen relevant Human patogener som influensa A virus 7 - eller den emergent Nipah viruset åtte. Videre har en rekke forskjellige undersøkelser utforsket anvendelsen av disse teknikker for å forbedre den iboende antitumoraktivitet av NDV 6,9,10, for det meste ved å styrke de immunstimulerende egenskaper av viruset. Annen relevant område for forskning på rekombinante NDVs har vært dannelsen av vaksinekandidater mot andre virale sykdommer som influensa 5,11,12, HIV 13, meslinger 14, SARS 15, eller som er forårsaket av luft sincytial virus (RSV) 16. Blant de ulike bemerkelsesverdige fordeler som tilbys av NDV er mangelen på preexisting immunitet i menneskelige populasjoner, stabiliteten av de utenlandske genetiske inserts, en mangel på recombinatory aktivitet og samlet en høy sikkerhetsprofil kombinert med de nevnte naturlige immunstimulerende egenskaper 17. Det er også verdt å merke seg den potensielle bruken av rekombinante toverdige vaksiner i poultry, virus beskyttende mot både NDV og høypatogen aviær influensa 11,12. Dette kan være en utmerket måte å redusere sjansene for sistnevnte sprer seg fra vill til husdyr, og dermed også bidra til å forhindre en mulig inter-spesifikk hoppe av den fryktede fugleinfluensa hos mennesker. Endelig reporter-uttrykk NDV har blitt benyttet for evaluering av medfødte immunresponser, samt identifikasjon av interferon antagonist kodet av flere virus 18-27.

Rednings prosess med et rekombinant, ikke-segmentert, består negativ-trådet RNA-virus i utgangspunktet på kunstig måte å tvinge et viralt replikasjonssyklus i en produserende celler ved transfeksjon av cDNA som koder for den minimale infeksiøs molekyl maskiner, kjent som ribonucleoprotein eller RNP (figur 2). De RNPs består av viral polymerase (P-og L-proteiner), til nukleoprotein (NP) og full-lengde RNA antigenomic av viruset. Dette RNA + antigenome er the mal nødvendig for genereringen av de komplementære RNA-genom, noe som også er forbundet med de andre proteiner av virus RNP, sammenfatter det samme infeksiøse kompleks som en naturlig virus vil frigjøre til cytoplasma av cellen ved infeksjon (figur 2A ). Fra dette trinnet og utover, kan den virale syklusen fortsette naturlig og rekombinant virioner, encapsidating de modifiserte genomer, vil bli generert (figur 2B). Bemerkelsesverdig, transfeksjon av det genomiske cDNA i stedet for det antigenomic cDNA i stor grad svekker eller helt opphever rednings effektivitet 2,28-30. Selv når antigenomic cDNA blir transfektert, er effektiviteten av den encapsidation av det rekombinante RNA til RNPs i transfekterte celler sannsynligvis svært lav. På grunn av dette, rednings-protokoller for NDV ofte inneholde forskjellige trinn for forsterkning av de få virus-partikler som frigjøres fra de opprinnelig transfekterte celler ved coculturing dem med ettergivende celler og / eller avinfeksjon av embryonated egg.

Forut for redning, kan cDNA bli manipulert ved hjelp av standard kloningsprosedyrer for å generere de ønskede modifikasjoner. Mens spesifikke mutasjoner av de forskjellige genprodukter og regulatoriske sekvenser av viruset kan være oversiktlig oppnås på denne måten, har mange av de publiserte arbeid med rekombinant NDV nødvendig tillegg av en ny transkripsjonsenhet inn i NDV genom. I likhet med andre medlemmer av familien paramyxovirus, koder for NDV-genomet åtte forskjellige proteiner i seks transkripsjonelle enheter, som er differensielt uttrykt avhengig av deres plassering i forhold til 3'-enden i en avtagende gradient kritisk for viral livssyklus 1.. På grunn av dette, må plasseringen av nye transkripsjons-enhet i genomet velges med omhu for å oppnå en balanse mellom ekspresjonen av transgenet og nedskrivning av viral replikasjon. Innsetting mellom P og M gener har blitt brukt for de fleste, tHough andre nettsteder har også blitt testet 13,31.

Når innsatsen, kloning inn i NDV cDNA behov for å følge noen regler for å generere en rescuable konstruksjon: (i) eventuelle nye genet som skal inkluderes i det NDV-genomet har til å være under kontroll av de hensiktsmessige signaler til det virale RNA-avhengig-RNA polymerase. Disse sekvensene må tilsettes oppstrøms for det nye åpne leseramme (ORF), slik at polymerase kan gjenkjenne slutten av forrige genet (GE) og begynnelsen av den nye transgenet (GS), adskilt av et enkelt nukleotid intergenic sekvens (IG) . Tilsetning av en gyldig Kozak (K) sekvens for å forbedre eukaryot ribosomal oversettelsen er også anbefalt for bedre fremmed protein ekspresjon 32, (ii) effektiv replikasjonen av NDV, som for de fleste medlemmer av familien Paramyxoviridae, er avhengig av genomet lengden være multiplum av seks 33, og derfor har noen innsetting i NDV å følge denne "regelen av seks". Hvis det er nødvendig, required ytterligere nukleotider kan bli lagt til den nye nedstrøms ORF, og (iii) en sekvens av transgenet bør kontrolleres for å finne mulige GE-og GS-lignende sekvenser som kunne nedsette rednings effektivitet, transgene ekspresjon og / eller virus levedyktighet. Hvis til stede, må disse sekvenser kan fjernes ved stille mutagenese. Den generasjonen av rekombinant full lengde cDNA etter nevnte regler er det første skrittet for å effektivt produsere en genmodifisert NDV som beskrevet her.

I det system som alle DNA-konstruksjoner er under kontroll av T7 RNA polymerase promoter (figur 3). Det cytoplasmatiske polymerase er gitt i trans ved coinfection med en rekombinant modifisert vaccinia-virus Ankara (MVA-T7) 34. Figur 3A viser pNDV-B1-plasmidet, som koder for full-lengde cDNA antigenomic 5. Figur 3B viser pTM1 plasmider som koder for NP, P-og L-ORF'er. Plasmider pCITE-GFP, som koder, under til T7-promoteren, Green Fluorescent Protein (GFP) og pCAGGs GFP 18, som koder for den samme ORF under kylling beta-aktin promoter som 35, blir brukt som kontroller. I denne protokollen viser vi prosedyren for å redde rekombinant NDV fra cDNA av lentogenic NDV belastningen Hitchner B1 5 (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Fremstilling av pattedyrceller (figur 4A, dag 1)

Split HEp-2 eller A549 celler dagen før transfeksjon i 6-brønn plater. Tetthet av cellene skal nå 80-90% samløpet neste dag. Vanligvis kan en konfluent 100 mm fatet bli delt inn i åtte brønner (rundt 1 x 10 6 celler per brønn). For hver virus å bli reddet, bør 2-4 forskjellige brønner inkluderes, samt to ekstra brønner for kontrollene pCAGGs-GFP og pCITE-GFP 18, tok sikte på å overvåke transfeksjon og MVA-T7 infeksjon effektivitet, henholdsvis.

2. Infeksjon av pattedyrceller med rekombinant Modified Vaccinia Ankara Virus Uttrykke bakteriofag T7 RNA Polymerase (MVA-T7) (Figur 4A, Dag 2)

  1. Varm opp PBS 1x/BA/PS og media ved 37 ° C.
  2. Vask cellene to ganger med 1 ml PBS 1x/BA/PS.
  3. Infisere dyrkede pattedyrceller med MVA-T7-viruset på et mangfold av infeksjon (moi) Av en pfu / celle i et sluttvolum på 200 pl i PBS / BA / PS i 1 time ved romtemperatur.
  4. I løpet av viral infeksjon inkubasjon forberede transfeksjon blanding som beskrevet i 3..

Tre. Transfeksjon av pattedyrceller (figur 4A, Dag 2)

  1. Utarbeidelse av Lipofectamine: Bland 1-2 mikrogram LPF2000 med 250 mL av OptiMEM per redningsforsøk og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
  2. Utarbeidelse av DNA: Lag en plasmid cocktail for hver redning i 50 mL av OptiMEM. Til 0.4 ug pTM1-NP, 0.2 ug pTM1-P, og 0,2 ug av pTM1-L per rør. Tilsett 1 ug av full-lengde cDNA-klon av NDV å bli reddet til hvert rør. Også forberede to kontroll transfections, en med 2 mg av pCAGGs-GFP (for å sjekke transfeksjon effektivitet) og den andre med to mikrogram av pCITE-GFP (for å sjekke T7 polymerase drevet uttrykk av MVA-T7).
  3. Etter LPF2000-OptiMEM løsningen er preinkuberes for 5 min (trinn 3.1), tilsett 250ul av løsningen på DNA-rør (trinn 3.2) og inkuberes i 20-30 minutter ved romtemperatur.
  4. Etter inkubasjon med MVA-T7, fjerne viruset inokulumet ved aspirasjon og erstatte med DNA-LPF2000 transfeksjon mix (trinn 3.3).
  5. Tilsett 1 ml DMEM 10% FBS / PS på hver tallerken.
  6. Inkuber de infiserte / transfiserte celler i 6-8 timer (eller over natten) ved 37 ° C, 5% CO2, og deretter erstatte den transfeksjon media med 1,5 ml frisk DMEM 10% FBS / PS.
  7. På 24 timers post-transfeksjon, kan kontrollbrønner observeres under et fluorescens mikroskop for å vurdere transfeksjon effektivitet (pCAGGs-GFP) og T7 polymerase aktivitet (pCITE-GFP) (figur 5A). Fortsett med co-kulturen i de infiserte / transfekterte celler med aviær fibroblaster som beskrevet nedenfor.

4. Co-kulturen i pattedyrceller med Avian Cells (Figur 4A, Dag 3)

Vanligvis, en konfluent 100 mm vev kultur rett av kylling (cefs) or duck (DEFS) embryo fibroblaster brukes per to transfekterte brønner. Pass på å forberede seg, på forhånd, nok 100 mm vevkulturskåler av aviær celler per alle redningsforsøk. For effektiv redning av viruset, er DMEM 10% FBS / PS media supplert med 5% av allantoic fluid og 30 mM MgCl2. På dette tidspunkt 24 timer pi, kan pattedyrceller begynne å vise cytopatisk effekt (CPE) på grunn av MVA-T7-infeksjon, asevident i figur 5A.

  1. Varm opp PBS 1x og media til 37 ° C.
  2. Vask pattedyrceller, 2x, med en ml PBS 1x.
  3. Trypsinize pattedyrceller med 0,2 ml EDTA-trypsin inntil de frittliggende. Resuspender cellene i 1 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoic fluid, 30 mM MgCl 2, og overføring til en 100 mm vevskultur fatet. Tilsett 3 ml av samme mediene.
  4. Vask fugleceller, to ganger med 4 ml PBS 1x.
  5. Trypsinize avian celler med 1 ml av EDTA-trypsin og inkuberes i 1-2 min ved 37 ° C inntil cellene løsner. Suspender the celler legge 8 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoic fluid, 30 mM MgCl 2 og tilsett 4 ml av cellene trypsinisert til pattedyrcellene i ko-dyrket på 100 mm vevskultur Skål for et totalt volum på 8 ml (4 ml pattedyr, 4 ml fugleceller).
  6. Rist forsiktig for hånd i ko-dyrkede celler i 100 mm fatet for å få en jevn fordeling, og deretter plassere dem i inkubator ved 37 ° C i 3-4 dager. Kriteriene for å infisere egg tre eller fire dager etter at co-kultur av pattedyr og fugle celler avhenger av hvor mye cytopatisk effekt (celle avrunding, død, løsrivelse fra overflaten, etc.) Er observert i MVA-T7 virusinfeksjon.

5. Infeksjon av Chicken embryonated Eggs (Figur 4A, Days 6-7)

  1. Etter 3-4 dager etter ko-kultur av pattedyr og fugleceller, fjerner en ml av vevskultur-supernatanten og legge til et Eppendorf-rør.
  2. Sentrifuger vevskultur supernatant i 1 min ved 12 000 rpm i en benksentrifuge for å fjerne mobilnettet rusk.
  3. Candle eggene ved hjelp av en lett candling boksen for å vise grensesnittet mellom luftsekken og allantoic hulrom. Lag et merke på grensesnittet grensen unngå blodåre lokalisering. Spray 70% etanol i løpet av de egg for å etablere sterile betingelser. Forsiktig lage et hull i eggeskallet på det markerte sted og inokuler 500 pl av supernatanten ved hjelp av en insulin (1 ml) sprøyten, med sikte nålen vertikalt og direkte inn i hulrommet allantoic. (Figur 4B).
  4. Tett nick i eggeskallet med smeltet voks eller parafin.
  5. Inkuber eggene i 2-3 dager ved 37 ° C.

6. Harvest of Allantoic Væske fra infiserte kylling embryonated Eggs (Figur 4A, Days 8-10)

  1. Inkuber infiserte egg til 2-4 timer eller over natten ved 4 ° C for å drepe kylling embryo og koagulerer blodet.
  2. Spray eggene med 70% etanol (for å opprettholde sterile forhold).
  3. Tappe forsiktig den apikale delen av egget, over luftespalten, med en skje. Når eggeskallet er sprukket, fjerne fragmenter med pinsett og fullt utsett allantoic membran.
  4. Utsett allantoic hulrom ved excising allantoic membran med pinsett og saks, unngå skader på blodkar og eggeplomme.
  5. Skyv forsiktig ned embryoet med en slikkepott og samle oppstrømmende allantoic væske (8-12 ml per egg) med en 10 ml pipette. Unngå skader på plommesekken. Overfør allantoic væske til en 15 ml sentrifugerør på is (bruk ett rør per egg).
  6. Avklare allantoic væske ved sentrifugering i 5 min ved 1500 rpm. Overfør supernatanten til et nytt rør, uten å forstyrre pelleten.
  7. Oppbevar prøver ved 4 ° C i opptil en uke, til å kontrollere dem i nærvær av NDV ved hemagglutinering assay.

7. Hemagglutinering (HA) Assay

Tilstedeværelsen av viruset i Allantoic fluid fra infiserte egg kan bestemmes makroskopisk ved deres evne til å hemagglutinere kalkun røde blodceller (RBC). I tilfelle av NDV, er omtrent 10 6 plakkdannende enheter (pfu) per ml som kreves for å gi et positivt signal i HA-analysen. HA-analysene er utført i V-bunn 96-brønners plater. Negativ (PBS 1x, infisert allantoic væske) samt positive (allantoic væske fra alle NDV virus) kontrollprøver bør alltid være med i noen HA analysen å bekrefte det. For å utføre en HA-analysen:

  1. Pipetter 50 pl PBS 1x per brønn i en V-bunn 96-brønns plate.
  2. Pipetter 50 ul av de allantoic væskeprøver i brønnene på den første kolonnen av platen. Utfør 2-ganger serie-fortynninger gjennom resten av platen og kast den siste, ekstra 50 ul fra brønner i den siste kolonnen.
  3. Tilsett 50 mL 0,5% kalkun RBC i PBS 1x per brønn. Rist plate ved å trykke.
  4. Inkuber platen ved 4 ° C (eller is) feller 30 til 45 minutter eller inntil en klar pellet er dannet i de negative kontrollbrønnene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Redningen av NDV er en godt etablert prosedyre, rutinemessig utført i laboratoriene som har tilgang til den komplette cDNA av viruset. Imidlertid gjør den iboende stokastiske karakter av metoden er det vanskelig å oppnå 100% rednings effektivitet. Overvåking av de tidlige trinn av prosessen, spesielt transfeksjon effektivitet og infeksjon med MVA-T7, bidrar til å identifisere mulige problemer. Figur 5A viser standard transfeksjon og transfeksjon / infeksjonseffektivitet som er tilstrekkelig for en vellykket redning NDV. Etter runder med forsterkning i avian-pattedyr co-kulturer og embryonated egg, er tilstedeværelsen av reddet virus oppdaget av positive brønner i HA analysen. NDV induserer hemagglutinering ved å koble erytrocytter, og derved hindrer deres sedimentering i bunnen av den V-formede bra. Derfor kan mangel på HA-aktivitet lett kan skilles ut ved dannelse av et rødt, rund pellet av RBC (figur 5B). Negative resultateri HA-analysen kan være på grunn av en utilstrekkelig titer av viruset i allantoic fluid: en minimums titer på ca 10 6 pfu / ml er nødvendig for å få en positiv HA resultat. Lavere virale titere kan fortsatt detekteres ved immunfluorescens-analyse (IFA) ved å bruke spesifikke anti NDV-antistoffer. En ny passasje av egg til ytterligere forsterkning av viruset til stede i den første inokulerte egg anbefales i disse tilfellene.

Figur 1
Figur 1. Genome organisering av Newcastle disease virus (NDV) Den ikke-segmentert, single-strandet negativ forstand RNA genomet av NDV er 15186 nukleotider (nt) lang og koder åtte forskjellige polypeptider i seks transkripsjonsenheter:. NP, P, M, F, HN og L pluss V og W proteiner, oppsto etter skift i leserammen av P ORF under transkripsjon. Kodende, regulatoriske sekvenser flankegenomet i sin 3 '(leder) og 5' (trailer) ender. Ytterligere kodende genet ende (GE), intergenic (IG), og genet start (GS) sekvenser regulere viral polymerase-aktivitet i mellom de forskjellige ORF'er. Expression nivåer av de forskjellige gener på det virale genomet er avhengig av deres relative plassering i forhold til 3'-enden (dvs. NP-transkripter er de mest tallrike, L-transkripter mildt), effektivt skape en gradient kritisk for virusets livssyklus 1..

Fig. 2
Figur 2. Grunnlag for NDV redning fra klonede DNA. Skjematisk sammenligning mellom en naturlig (A) og kunstig-indusert (B) syklus under redningsprosessen. (A) Etter å ha festet til målcellen, utgivelser viruset dens genomisk innhold inn i cytoplasma encapsidated i RNPs. Den RNA polymerase transcribes RNA-genom inn i de forskjellige mRNAer av de virale proteiner, og inn i et komplementært, i full lengde antigenomic RNA + kopi, som er mal for fremstilling av flere kopier av den opprinnelige genom som vil bli innlemmet i begynnende virioner. (B ) Under redningsprosessen, blir komponentene i de RNPs (NP-, P-og L-proteiner, så vel som et full-lengde, vanligvis modifisert antigenomic RNA) levert av cDNA-transfeksjon. Ved tilberedning av de antigenomic RNPs i cytoplasma i transfektert celle, kan de produsere de komplementære, rekombinante genomisk RNPs og en hel syklus kan deretter starte på nytt, og endte med utgivelsen av rekombinante virus.

Figur 3
Figur 3. T7-drevet ekspresjonsplasmider for generering av rekombinant NDV. (A) Full lengde viral cDNA: The full lengde pNDV-B1 ampicillinresistens plasmid drivende ekspresjon av NDV lentogenic belastningen Hitchner B1 antigenome under T7-promoter (P T7) og T7 terminator-sekvens (T T7) som inneholder hepatitt Delta Ribozyme (HDR) spalting. Den pNDV-B1 ble opprinnelig designet for å bære utenlandske innstikk mellom P og M gener fem. Innsetting av et nytt gen (XbaI-setet) krever tilsetning av den regulatoriske gen ende (GE), intergenic (IG), og genet start (GS) sekvenser for å tillate dens funksjonelle gjenkjennelse av viral polymerase. Ekspresjon effektiviteten av transgenet kan forbedres med tilsetning av en Kozak (K)-sekvens oppstrøms for startkodonet 32.. Hele kassetten introdusert i NDV cDNA må ha et totalt antall nukleotider delelig med seks til følge "regelen av seks" 33 som driver effektiv replikering av de fleste paramyxovius genomer (B) Protein ekspresjonsplasmider:. Viral NP, P, og L ORF'er, flankertved T7-promoter (P T7), den UTR av encefalomyocardittvirus (EMC) og T7-terminator (T T7)-sekvenser ble klonet inn i pTM1 ryggrad ampicillinresistens vektor 5,36.

Figur 4
Figur 4. Plasmid-baserte revers genetikk teknikker for generering av rekombinant Newcastle Disease Virus. (A) Viral redning: A549 eller HEp-2 celler er infisert med den modifiserte vacciniavirus Ankara uttrykker bakteriofag T7 polymerase (MVA-T7). Etter viral infeksjon, celler blir ko-transfektert med ekspresjonsplasmidet som kreves for replikasjon og transkripsjon av NDV virale genom (NP, P og L), sammen med den fulle lengde NDV-cDNA, under T7 promoter. Tjuefire timer post-infection/transfection, pattedyrceller er co-kultivert med kylling eller and embryo fibroblaster (CEF ogDEF, henholdsvis). Tre til fire dager etter at co-kultur, 8-10 dager gammel kylling embryonated egg er vaksinert med vev dyrkningssupernatanter av co-kultur celler for ytterligere forsterkning. To til tre dager etter inkubering av 8-10 dager gamle egg ved 37 ° C, er allantoic fluid fra egg høstet og analysert for vellykket redning av det rekombinante virus ved HA-analysen. Positive (+) rednings virus er videre kjennetegnet ved genomisk (RT-PCR) og protein (f.eks immunfluorescens assay (IFA) og western blot (WB) nivåer Negativ (-.) HA resultatene kan skyldes mangel på nok virus til å være . oppdaget av HA Reinfeksjon av fersk kylling embryonated egg å forsterke viruset indikeres (B) Infeksjon av kylling embryonated egg:. 8-10 kylling embryonated egg er candled å markere grensesnittet mellom luft sac og allantoic hulrom Med en insulin. (1 ml) sprøyten, blir eggene infisert med vevskultur-supernatanten inne i allantoic Cavity, som angitt.

Figur 5
Figur 5. Representative resultater. (A) Transfection og MVA-T7 infeksjon effektivitet: representant fluorescerende (til venstre) og lyse (høyre) felt av A549 celler transfektert med pCAGGS-GFP (øverst) eller smittet med MVA-T7 og transfektert med pCITE-GFP (nederst) er illustrert . Konstitutiv GFP ekspresjon drevet av pCAGGS er en indikator for transfeksjon effektivitet, mens T7 promoter drevet GFP-ekspresjon ved pCITE er en kontroll for MVA-T7-infeksjon og T7-polymerase-aktivitet. Cellene ble fotografert ved 24 timers post-transfection/post-infection (B) Hemagglutineringen assay (HA): Tilstedeværelse av virale partikler i allantoic fluid induserer hemagglutinering, noe som er vist ved en mangel på pellet i bunnen av et V-formet brønn. Fravær av virus tillater dannelsen av en rød pellet i bunnen av the godt. Figuren viser både kontrollene som er nødvendig for en hvilken som helst HA assay (negativ, rene allantoic væsken; positive, et allerede preget NDV prøven), og resultatene av tre ukjente prøver oppnådd etter å ha en rednings, med to positive (+) og en negativ (-) resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere faktorer som skal vurderes for å oppnå gode resultater, mens redde NDV. For det første må den full-lengde cDNA-konstruksjon som skal benyttes til å være utformet for å tillate den funksjonelle inkorporering av de nye transgener / modifikasjoner i det NDV-genomet. Dette betyr, som nevnt ovenfor, at (i) passende genet end (GE), intergenic (IG) og genet start (GS) sekvenser er å bli lagt om nødvendig, (ii) det er ingen antatte GE eller GS sekvenser inn i utenlandske gen, og (iii) den fullstendige rekombinante genom følger "rule of six".

Som for redningsprosessen, kvaliteten av plasmid preparater, er MVA-T7 bestander, samt tilfredsstillende vedlikehold av celler er kritiske. For de fleste tilfeller er standard maxiprep rensing av plasmid-DNA nok, selv vanskelige kloning og redningsprosesser, på grunn av størrelsen og arten av transgener, kan forbedres ved rensing av DNA ved CsCl densitetsgradient sentrifugering. Transfeksjon effektivitet ved hjelp av Lipofectamine er vanligvis tilstrekkelig for en vellykket redning, skjønt andre transfeksjonsmetoder som nucleofection kan også brukes. I alle tilfeller må forholdet av de forskjellige plasmider for å være strengt opprettholdt (0.4:0.2:0.2:1 for NP-PL-pNDV, henholdsvis). På grunn av det arbeidskrevende og noe stokastisk natur av redningsprosessen, bør minst 2-4 forskjellige brønner bli transfektert per konstruksjon som skal reddes, og forskjellige kloner av samme konstruksjon skal analyseres.

I protokollen som vi har beskrevet her, bruker vi MVA-T7 å gi i trans T7 polymerase nødvendig for uttrykket av de virale cDNA konstruerer. Selv om dette er den vanlige fremgangsmåten i vårt laboratorium, er det ikke den eneste mulige metode. For eksempel er andre grupper med hell reddet NDV og andre ikke-segmenterte, negative tråd-RNA-virus ved hjelp av cellelinjer konstitutivt uttrykker høye nivåer av T7 polymerase 4,37. Tilgjengeligheten av en rekombinant vektoreller cellelinje som koder T7 polymerase, så vel som den spesifikke utførelsen av enten tilnærming i en gitt laboratorie, bør tas i betraktning ved etablering av nytt redningssystem for NDV.

Etter bestemmelse av NDV nærvær i allantoic væske ved HA, videre studier skal utføres en fullstendig karakterisering av nylig reddet virus, så som RT-PCR etterfulgt av sekvensering av det virale genom, IFA-og Western-blotting (IM) for å bestemme ekspresjon av den utenlandske genet (hvis aktuelt). Avhengig av arten av de modifikasjoner som de rekombinante virus som bærer, kan andre typer av biokjemiske og funksjonelle analyser også være nødvendig.

Redningen av rekombinant NDV fra cDNA er en nyttig teknikk for flere grunner. Først, og mest åpenbare, gir denne teknikk med evnen til å analysere biologi av NDV, en økonomisk relevante viruset for avian industrien, ved eksperimentelt å forandre dets gener og regulerende sekvenser. NDV er et paramyxovirus nært knyttet til menneskelige patogener som meslinger, kusma eller syncytialt virus, samt emergent, høypatogen Hendra og Nipah virus, forskning på den grunnleggende livsløpet til denne familien av virus er viktig å forstå deres biologi. Utover grunnleggende forskning, rekombinante NDVs har et stort potensial som vaksine og onkolytiske vectos, som kombinerer muligheten for å gjennomføre foreing gener i sine genomer med et godt vurdert biosikkerhet profil. For alle disse grunner, kan The NDV redning protokollen være en verdifull ressurs for mange laboratorier over hele verden er interessert i virusforskning, vaksineutvikling og kreftbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Adolfo Garcia-Sastre er en oppfinner av patenter på rekombinante Newcastle disease virus som er eid av Icahn School of Medicine ved Mount Sinai.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke tidligere og nåværende medlemmer i laboratorier av legene. Peter Palese og Adolfo Garcia-Sastre for utvikling av NDV revers genetikk teknikker og for teknisk assistanse. Forskning i Newcastle disease virus i AG-S Laboratoriet er delvis finansiert av NIAD gi R01AI088770 og av Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence for Emerging og zoonotiske sykdommer hos dyr (CEEZAD, award nummer 2010-ST-061-AG001). Forskning i LM-S laboratoriet er finansiert av NIH tilskudd RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAID Centers of Excellence for Influensa Forskning og overvåkning (HHSN266200700008C), og The University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Tags

Immunologi , Vaksiner Oncolytic virotherapy immunitet medfødt Newcastle disease virus (NDV) MVA-T7 revers genetikk teknikker plasmid transfeksjon rekombinant virus HA analyse
Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A.,… More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter