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Immunology and Infection

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Abstract

O vírus da doença de Newcastle (VDN), o membro protótipo do gênero Avulavirus da família Paramyxoviridae 1, é um não-segmentado, negativo-sentido, de fita simples, envolto vírus RNA (Figura 1) com potenciais aplicações como um vetor para a vacinação e tratamento de doenças humanas. Exploração em profundidade dessas aplicações só se tornou possível após o estabelecimento de técnicas de genética reversa para resgatar vírus recombinantes de plasmídeos que codificam seus genomas completos como cDNA 2-5. ADNc viral pode ser convenientemente modificado, in vitro, utilizando procedimentos de clonagem padrão para alterar o genótipo do vírus e / ou para incluir novas unidades de transcrição. Resgate de tais vírus geneticamente modificados fornece uma ferramenta valiosa para entender os fatores que afetam vários estágios da infecção, bem como permite o desenvolvimento e aperfeiçoamento de vetores para a expressão e entrega de antígenospara a vacinação e terapia. Aqui nós descrevemos um protocolo para o resgate de NDVs recombinantes.

Introduction

O vírus da doença de Newcastle (VDN), um paramyxovirus aviária pertencente ao gênero Avulavirus 1, é um agente zoonótico economicamente relevante e, portanto, amplamente pesquisados ​​e vigiado, o que pode afetar gravemente a avicultura em todo o mundo. Embora não seja um patógeno humano, NDV também tem sido minuciosamente estudados para além do campo veterinário tanto como um modelo paramyxovirus e, devido às suas propriedades muito interessantes, oncolíticos naturais 6. Pesquisa sobre NDV beneficiaram com o desenvolvimento de técnicas de genética reversa para, não-segmentadas vírus de RNA de sentido negativo de fita simples, primeiro descrito para o vírus da raiva por Conzelmann e coleagues 2. Uma variedade de NDVs geneticamente modificados, portadores de genes ou modificações de seu tipo selvagem genoma estrangeiros têm sido amplamente estudado desde então. Trabalhar com estes vírus recombinantes tem sido fundamental para caracterizar diferentes fatores de virulência, não só de NDV, mas também de outros huma relevanten patógenos, como vírus da gripe A 7 - ou o emergente Nipah vírus 8. Além disso, um certo número de diferentes estudos têm explorado o uso destas técnicas para melhorar a actividade anti-tumoral inato de NDV 6,9,10, na maior parte, aumentando as propriedades imunoestimulantes dos vírus. Outra área relevante da pesquisa sobre NDVs recombinantes tem sido a geração de vacinas candidatas contra outras doenças virais, como a gripe 5,11,12, 13 de HIV, sarampo 14, SARS 15, ou que causada pelo vírus sincytial respiratório (RSV) 16. Entre as várias vantagens notáveis ​​fornecidas por NDV são a ausência de imunidade preexistente em populações humanas, a estabilidade das inserções estrangeiras genéticas, falta de actividade recombinatórios e um perfil de segurança global elevada combinada com as acima mencionadas propriedades imunoestimulantes naturais 17. Também é digno de nota o uso potencial de vacinas bivalentes recombinantes em poultry, a gripe aviária de proteção tanto contra NDV e altamente patogênico vírus 11,12. Esta pode ser uma excelente maneira de diminuir as chances de o último espalhamento de selvagem a animais domesticados, contribuindo assim para evitar um possível salto inter-específica da gripe aviária temida para os seres humanos. Finalmente, o NDV-expressando repórter têm sido utilizados para a avaliação de respostas imunitárias inatas, bem como a identificação de antagonistas de interferão codificado por vários vírus 18-27.

O processo de salvamento de uma forma recombinante, não segmentado, vírus de RNA de cadeia negativa consiste basicamente em forçar artificialmente um ciclo de replicação viral de uma célula produtora por transfecção de ADNc que codificam a maquinaria molecular infecciosa mínima, conhecido como ribonucleoproteína ou RNP (Figura 2). Os RNPs consistem em a polimerase viral (P e proteínas G), a nucleoproteína (NP) e o comprimento total de ARN antigenómico de vírus. Este RNA + antigenoma é thMolde e necessária para a geração dos genomas de ARN-complementares, as quais, também associados com o resto das proteínas da RNP virai, recapitula o mesmo complexo que um vírus infeccioso natural seria libertar no citoplasma da célula após a infecção (Figura 2A ). A partir deste passo em diante, o ciclo viral pode continuar naturalmente e os viriões recombinantes, encapsidar os genomas modificados, irá ser gerado (Figura 2B). Notavelmente, a transfecção de ADNc genómico, em vez do ADNc antigenï prejudica grandemente ou elimina completamente a eficiência de recuperação 2,28-30. Mesmo quando cDNA antigenï é transfectada, a eficiência da encapsidação do ARN recombinante em RNPs em células transfectadas é provavelmente muito baixo. Devido a isso, os protocolos de salvamento para NDV geralmente incluem diferentes passos para a amplificação das poucas partículas virais libertadas das células originalmente transf por coculturing los com células permissivas e / ou pelainfecção de ovos embrionados.

Antes da recuperação, o cDNA pode ser manipulado por procedimentos de clonagem convencionais, de modo a gerar as modificações desejadas. Embora as mutações específicas dos diferentes produtos de genes e sequências reguladoras dos vírus pode ser directamente obtida desta maneira, muitos dos trabalhos publicados envolvendo NDV recombinante foi necessária a adição de uma nova unidade de transcrição no genoma de NDV. Como outros membros da família dos paramixovírus, o genoma de NDV codifica oito proteínas diferentes em seis unidades de transcrição, que são diferencialmente expressos em função da sua localização relativamente à extremidade 3 'de um gradiente decrescente crítico para o ciclo de vida do vírus 1. Devido a isso, o local da nova unidade de transcrição dentro do genoma deve ser cuidadosamente escolhida para alcançar um equilíbrio entre a expressão do transgene e insuficiência de replicação viral. Inserção entre os genes P e M tem sido o mais usado, toutros sites Hough também foram testados 13,31.

Seja qual for a inserção, a clonagem de cDNA para o NDV tem de seguir algumas regras para gerar um constructo rescuable: (i) qualquer novo gene a ser incluída dentro do genoma de NDV tem de estar sob o controlo dos sinais adequados para o vírus de ARN dependente de ARN- polimerase. Estas sequências devem ser adicionado a montante da nova estrutura de leitura aberta (ORF), de modo a polimerase pode reconhecer o fim do gene anterior (GE) e o início da nova transgene (GS), espaçadas por uma única sequência de nucleótidos intergénica (IG) . A adição de uma Kozak válido (K) de sequência para melhorar a tradução ribossomal eucariótica, também é recomendado para uma melhor expressão da proteína externa de 32, (ii) uma replicação eficiente de NDV, assim como para a maioria dos membros da família Paramyxoviridae, é dependente do comprimento do genoma sendo múltiplo de seis de 33 e, portanto, qualquer inserção na NDV tem que seguir essa "regra de seis". Se necessário, reqnucleotídeos adicionais uired podem ser adicionados a jusante da nova ORF, e (iii) a seqüência do transgene devem ser verificadas para encontrar possíveis GE e GS como sequências que possam prejudicar a eficiência de recuperação, a expressão do transgene e / ou viabilidade vírus. Se presente, estas sequências devem ser removidas por mutagénese silenciosa. A geração de cDNA de comprimento total recombinante a seguir regras acima referidas é o primeiro passo para produzir eficientemente um NDV geneticamente modificado tal como descrito aqui.

No sistema de todas as construções de ADN está sob o controlo do promotor da polimerase de ARN de T7 (Figura 3). Esta polimerase citoplasmática é fornecido em trans pela co-infecção com um recombinante de vaccinia modificado Ankara vírus (MVA-T7) 34. Figura 3A mostra o plasmídeo pNDV-B1, que codifica o ADNc de comprimento completo antigenï 5. Figura 3B mostra os plasmídeos pTM1 codificando NP, P e L ORF. Os plasmídeos pCite-GFP, que codifica, under o promotor T7, a proteína verde fluorescente (GFP), e pCAGGS GFP 18, que codifica para o mesmo ORF sob o promotor de beta actina de frango 35, são utilizados como controlos. Neste protocolo, mostram o procedimento para resgatar NDV recombinante a partir do ADNc do NDV lentogénico estirpe Hitchner B1 5 (Figura 4).

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Protocol

1. Preparação de células de mamíferos (Figura 4A, Dia 1)

Dividir HEp-2 ou células A549 no dia anterior transfeco em placas de 6 poços. Densidade das células deve atingir 80-90% de confluência no dia seguinte. Normalmente, um prato de 100 mm confluentes podem ser divididos em 8 poços (cerca de 1 x 10 6 culas por po). Para cada vírus para ser resgatado, 2-4 poços diferentes devem ser incluídos, bem como dois poços adicionais para os controles pCAGGS-GFP e pCite GFP-18, com o objetivo de monitorar a transfecção e MVA-T7 eficiência de infecção, respectivamente.

2. A infecção de células de mamíferos com o vírus vaccinia recombinante Modificado Ancara Expressando o bacteriófago T7 ARN polimerase (MVA-T7) (Figura 4A, Dia 2)

  1. Aqueça PBS 1x/BA/PS e media a 37 ° C.
  2. Lavar as células, duas vezes, com 1 ml de PBS 1x/BA/PS.
  3. Infectar as células de mamíferos em cultura com o vírus MVA-T7 com uma multiplicidade de infecção (moi) De 1 pf u / célula a um volume final de 200 ul de PBS / BA / PS durante 1 hora à temperatura ambiente.
  4. Durante a incubação da infecção viral, preparar a mistura de transfecção como descrito em 3.

3. A transfecção de células de mamíferos (Figura 4A, Dia 2)

  1. Preparação de Lipofectamina: Misturar 1-2 ug de LPF2000 com 250 ul de OptiMEM por tentativa de resgate e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  2. Preparação de DNA: Faça um cocktail plasmídeo para cada resgate em 50 ul de OptiMEM. Adicionar 0,4 g de pTM1-NP, 0,2 ug de pTM1-P, e 0,2 ug de pTM1-L por tubo. Adicionar 1 mg de a-clone de cDNA de NDV para ser resgatado a cada tubo. Também preparar dois transfections de controle, um com 2 mg de pCAGGS-GFP (para verificar a eficiência de transfecção) e outro com 2 mg de pCite-GFP (para verificar T7 polimerase impulsionado expressão pelo MVA-T7).
  3. Após a solução LPF2000-OptiMEM foi pré-incubada durante 5 min (passo 3.1), adicionar 250ul da solução para os tubos de DNA (passo 3.2) e incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente.
  4. Após incubação com MVA-T7, remova o inóculo do vírus por aspiração e substituir com a mistura de transfecção de DNA LPF2000 (passo 3.3).
  5. Adicionar 1 ml de meio DMEM 10% FBS / PS para cada prato.
  6. Incubar as células transfectadas / infectadas durante 6-8 horas (ou durante a noite) a 37 ° C, 5% de CO 2 e, em seguida substituir o meio de transfecção com 1,5 ml de DMEM fresco de 10% FBS / PS.
  7. Em 24 horas após a transfecção, os poços de controlo pode ser observado sob um microscópio de fluorescência para avaliar a eficácia de transfecção (pCAGGS-GFP) e a actividade da polimerase de T7 (pCite-GFP) (Figura 5A). Continuar com a co-cultura das células transfectadas / infectadas com fibroblastos aviárias, como descrito abaixo.

4. Co-cultura de células de mamíferos com células aviárias (Figura 4A, Dia 3)

Geralmente, um confluente 100 milímetros de cultura de tecidos prato de frango (CEFs) or pato (defs) fibroblastos de embrião é utilizada por dois poços transfectadas. Certifique-se de preparar, com antecedência, o suficiente 100 milímetros pratos de cultura de tecidos de células aviárias por todas as tentativas de resgate. Para resgate eficiente do vírus, meio DMEM 10% FBS / PS é suplementado com 5% de fluido alantóide e 30 mM de MgCl 2. Neste ponto, 24 hr pi, as células de mamíferos podem começar a exibir o efeito citopático (CPE), devido à infecção MVA-T7, asevident na Figura 5A.

  1. Aqueça 1x e mídia PBS a 37 ° C.
  2. Lave as células de mamíferos, 2x com 1 ml de PBS 1x.
  3. Tripsinizar as células de mamífero com 0,2 ml de EDTA-tripsina, até que isolada. Ressuspender as células em 1 ml de meio DMEM 10% FBS / PS, 5% de fluido alantóide, 30 mM de MgCl 2 e de transferência de um tecido de 100 milímetros prato de cultura. Adicionar 3 ml de mesma mídia.
  4. Lavar as células de aves, por duas vezes, com 4 ml de PBS 1x.
  5. Tripsinizar as células de aves com 1 ml de EDTA-tripsina e incubar durante 1-2 min a 37 ° C até as células separar. ª Ressuspendercélulas e adicionando 8 ml de DMEM 10% FBS / PS, 5% de fluido alantóide, 30 mM de MgCl 2 e adicionar 4 ml de células tratadas com tripsina para as células de mamíferos na co-cultura de tecido 100 milímetros prato de cultura para um volume total de 8 ml (4 ml de mamíferos, células de aves 4 ml).
  6. Agitar suavemente à mão as células co-cultivadas na placa de 100 mm, a fim de ter uma distribuição uniforme e, em seguida, colocá-los na incubadora a 37 ° C durante 3-4 dias. Os critérios para infectar os ovos de 3 ou 4 dias após a co-cultura de células de mamíferos e de aves depende da quantidade de efeito citopático (arredondamento celular, morte, descolamento da superfície, etc.) É observada na infecção viral MVA-T7.

5. Infecção de ovos embrionados de galinha (Figura 4A, Dias 6-7)

  1. Depois de 3-4 dias de co-cultura de células de mamíferos e de aves, remover um ml de sobrenadante de cultura de tecidos e adicionar a um tubo Eppendorf.
  2. Centrifuga-se o sobrenadante de cultura de tecidos durante 1 minuto a 12.000 rpm em um bancocentrífuga de topo para remover os detritos celulares.
  3. Vela os ovos usando uma caixa de miragem luz para ver a interface entre o saco de ar e na cavidade alantóide. Faça uma marca na fronteira de interface evitando localização dos vasos sanguíneos. Spray de etanol de 70% sobre os ovos para estabelecer condições estéreis. Suavemente fazer um buraco na casca do ovo no local marcado e inocular 500 mL do sobrenadante usando uma insulina (1 ml) da seringa, com vista vertical e directamente a agulha para dentro da cavidade alantóide. (Figura 4B).
  4. Selar o corte na casca de ovo com cera derretida ou parafina.
  5. Incubar os ovos de 2-3 dias a 37 ° C.

6. Colheita de líquido alantóico de Infected ovos embrionados de galinha (Figura 4A, dias 8-10)

  1. Incubar os ovos infectados por 2-4 horas ou durante a noite a 4 ° C, a fim de matar o embrião de galinha e de coagular o sangue.
  2. Pulverizar os ovos com etanol a 70% (para manter condições estéreis).
  3. Toque cuidadosamente a porção apical do ovo, por cima da cavidade de ar, com uma colher. Uma vez que a casca do ovo está rachado, remover os fragmentos com uma pinça e totalmente expor a membrana alantóide.
  4. Expor a cavidade alantóide por excisão da membrana alantóico com fórceps e tesouras, evitando danos aos vasos sanguíneos e a gema.
  5. Empurre cuidadosamente para baixo o embrião com uma espátula e recolher o fluido alantóide upflowing (8-12 ml por ovo) com uma pipeta de 10 ml. Evite danificar a membrana da gema. Transferir o fluido alantóico a um tubo de centrífuga de 15 ml em gelo (usar um tubo por ovo).
  6. Clarificar o fluido alantóide por centrifugação durante 5 min a 1500 rpm. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, sem perturbar o sedimento.
  7. Armazene as amostras a 4 ° C por até uma semana, até que verificá-los para a presença de NDV por ensaio de hemaglutinação.

7. Hemaglutinação (HA) Assay

A presença do vírus no allantóico fluido a partir de ovos infectados pode ser determinada macroscopicamente pela sua capacidade para hemagglutinate peru glóbulos vermelhos (RBC). No caso de NDV, de cerca de 10 6 unidades formadoras de placas (pfu) por ml são necessárias para dar um sinal positivo no ensaio de HA. Os ensaios de HA são realizadas em placas de 96 poços de fundo em V. Negativo (PBS 1x, fluido alantóide não infectado), bem como positivo (fluido alantóide de qualquer vírus NDV) amostras de controle deve sempre ser incluído em qualquer ensaio HA para validá-lo. Para realizar um ensaio de HA:

  1. Pipetar 50 ul de 1x PBS por cavidade em uma placa de fundo em V de 96 poços.
  2. Pipetar 50 ul das amostras de fluido alantóico nas cavidades na primeira coluna da placa. Efectuar diluições em série de 2 vezes através do resto da placa e descartar o último, 50 ul adicionais de poços na última coluna.
  3. Dispensar 50 ul de 0,5% de peru RBC em PBS 1x por poço. Agite suavemente a placa tocando.
  4. Incubar a placa a 4 ° C (ou gelo) fou 30-45 minutos ou até que um pelete é formado clara nos poços de controlo negativo.

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Representative Results

Resgate de NDV é um procedimento bem estabelecido, realizada rotineiramente nos laboratórios que têm acesso ao cDNA completo do vírus. No entanto, a natureza estocástica intrínseca do método faz com que seja difícil de alcançar 100% de eficácia de recuperação. Monitorando as primeiras etapas do processo, em especial a eficácia de transfecção e a infecção com o MVA-T7, ajuda a identificar possíveis problemas. Figura 5A mostra transfecção padrão e a eficiência de transfecção / infecção que são suficientes para um resgate de NDV bem sucedida. Após os ciclos de amplificação, em co-culturas de mamíferos, de aves e de ovos embrionados, a presença de vírus resgatado é detectado por cavidades positivas no ensaio de HA. NDV induz a hemaglutinação de eritrócitos ligando e, portanto, impede a sua sedimentação no fundo da forma de V bem. Portanto, a falta de actividade de HA podem ser facilmente distinguidos pela formação de um sedimento de vermelho, rodada de RBC (Figura 5B). Os resultados negativosno ensaio de HA pode ser devido a um título suficiente de vírus no fluido alantóico: uma titulação mínima de aproximadamente 10 6 pfu / ml é necessária para ter um resultado positivo para HA. Os títulos virais mais baixas pode ainda ser detectada por ensaio de imunofluorescência (IFA), utilizando anticorpos específicos anti-NDV. Uma nova passagem em ovos para a amplificação do vírus presente nos primeiros ovos inoculados é recomendado nestes casos.

Figura 1
Figura 1. Organização do genoma do vírus da doença de Newcastle (NDV) A não segmentado, o RNA do genoma de sentido negativo em cadeia simples de NDV é 15186 nucleótidos (nt) de comprimento e codifica oito polipéptidos diferentes em seis unidades transcricionais:. NP, P, M, F, HN e L mais proteínas V e W, originou, após alterações na grelha de leitura da ORF P durante a transcrição. Não codificante, seqüências regulatórias flancodo genoma no seu 3 '(líder) e 5' (reboque) termina. Além disso não codificante final gene (GE), intergênica (IG) e de início gene (GS) seqüências de regular a atividade da polimerase viral entre os diferentes ORFs. Os níveis de expressão dos diferentes genes no genoma viral dependem da sua localização em relação ao que diz respeito à extremidade 3 '(isto é, as transcrições NP são os mais abundantes, L transcritos a menos), criando eficazmente um gradiente crítico para o vírus' do ciclo de vida 1.

Figura 2
Figura 2. Bases de NDV salvamento de ADN clonado. Comparação esquemática entre natural (A) e o ciclo-induzida artificialmente (B) durante o processo de salvamento. (A) Após colocar a célula-alvo, o vírus liberta o seu conteúdo para o citoplasma genómico encapsidado em RNPs. A RNA polimerase transcreve o ARN do genoma nas diferentes ARNm de proteínas virais e para um, total de RNA complementar comprimento antigenï + cópia, o qual é molde para a produção de múltiplas cópias do genoma original que irão ser incorporados nos viriões nascentes. (B ) Durante o processo de salvamento, os componentes das RNPs (NP, P e proteínas G, bem como um de comprimento completo, geralmente o ARN antigenómico modificado) são fornecidos por transfecção de ADNc. Após a reconstituição das RNPs antigenï no citoplasma da célula transfectada, eles podem produzir os RNPs genómicas complementares, recombinantes e um ciclo inteiro pode então começar de novo, terminando com a liberação de vírus recombinantes.

Figura 3
Figura 3. T7-driven plasmídeos de expressão para a produção recombinante de NDV. (A) comprimento cDNA viral completa: The comprimento total pNDV-B1 ampicilina plasmídeo de resistência a expressão da estirpe de NDV lentogénica Hitchner B1 antigenoma condução sob o promotor de T7 (T7 P) e a sequência de terminador de T7 (T7 T) contendo a ribozima da hepatite delta (HDR) de clivagem. O pNDV-B1 foi originalmente projetado para transportar inserções estrangeiros entre P e M genes 5. A inserção de um novo gene (local XbaI) requer a adição do final do gene regulador (GE), intergénica (IG) e início do gene (GS), sequências para permitir o seu reconhecimento funcional pela polimerase viral. A eficiência de expressão do transgene pode ser melhorada com a adição de uma sequência de Kozak (K) a montante do codão de iniciação 32. Toda a cassete introduzida na NDV cDNA precisa ter um número total de nucleotídeos divisível por seis a seguir a "regra de seis" 33 que impulsiona a replicação eficiente da maioria dos genomas paramyxovius (B) plasmídeos de expressão de proteínas:. NP Viral, P, e ORFs L, ladeadopelo promotor de T7 (T7 P), a UTR do vírus da encefalomiocardite (EMC) e o terminador de T7 (T7 T) sequências foram clonadas no vector de resistência a ampicilina espinha dorsal pTM1 5,36.

Figura 4
Figura 4. Baseados no plasmídeo de genética inversa de técnicas para a geração de recombinante do vírus da Doença de Newcastle. (A) Viral resgate: A549 ou células HEp-2 infectadas com o vírus vaccinia Ankara modificado que expressa a polimerase T7 de bacteriófago (MVA-T7). Após a infecção virai, as células são co-transfectadas com o plasmídeo de expressão necessárias para a replicação e transcrição do genoma viral de NDV (NP, P, e L), em conjunto com o comprimento total de cDNA de NDV, sob o promotor de T7. Vinte e quatro horas post-infection/transfection, as células de mamíferos são co-cultivadas com galinha ou pato fibroblastos de embrião (CEF eDEF, respectivamente). Três a quatro dias após a co-cultura, de frango de 8-10 dias de idade são ovos embrionados inoculados com sobrenadantes de cultura de tecidos de células de co-cultura para subsequente amplificação. Dois a três dias após a incubação dos 8-10 dias de idade, os ovos a 37 ° C, o fluido alantóico dos ovos é colhido e analisado para resgate com sucesso do vírus recombinante pelo ensaio de HA. (+) Os vírus de resgate positivos são ainda caracterizados pelo genómico (RT-PCR) e de proteína (por exemplo, ensaio de imunofluorescência (IFA) e WB (níveis) de western blot negativo (-). HA resultados pode ser devida à falta de vírus suficiente para ser . detectado por HA reinfecção de galinha embrionados de ovos frescas para amplificar o vírus é indicada (B) Infecção de galinha embrionados de ovos:. 8-10 ovos de galinha embrionados, são candled para marcar a interface entre o saco de ar e a cavidade alantóide Com uma insulina. (1 ml) de seringa, os ovos são infectados com o sobrenadante de cultura de tecido no interior da cavi alantóicoty, como indicado.

Figura 5
Figura 5. Os resultados representativos. (A) A transfecção e MVA-T7 eficiência de infecção: fluorescente representante (à esquerda) e os campos luminosos (direita) de células A549 transfectadas com pCAGGS-GFP (em cima) ou infectadas com MVA-T7 e transfectadas com pCite-GFP (em baixo) são ilustradas . GFP expressão constitutiva dirigida por pCAGGS é um indicador da eficiência da transfecção, ao passo que o promotor T7 dirigida a expressão da GFP por pCite é um controlo de infecção de MVA-T7 e a actividade da polimerase de T7. As células foram fotografadas em 24 hr post-transfection/post-infection (B) Ensaio de hemaglutinação (HA): A presença de partículas virais no fluido alantóico induz hemaglutinação, o que é demonstrado pela ausência de sedimento no fundo de uma forma de V bem. A ausência de vírus, permite a formação de um sedimento de vermelho na parte inferior do poE bem. Figura mostra tanto os controles necessários para qualquer ensaio HA (fluido alantóide negativo, limpo; positivo, uma amostra NDV já caracterizados), e os resultados de três amostras desconhecidas obtidos depois de um resgate, com dois positivo (+) e um negativo (-) resultado.

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Discussion

Vários fatores devem ser considerados para alcançar bons resultados ao resgatar NDV. Em primeiro lugar, a construção de cDNA completo para ser usado precisa ser projetado para permitir a incorporação funcional dos novos transgenes / modificações no genoma NDV. Isso significa que, como dito acima, que as seqüências (i) end apropriado gene (GE), intergênica (IG) e de início gene (GS) estão a ser adicionado, se necessário, (ii) não existem sequências GE ou GS putativos para o estrangeiro gene, e (iii) o genoma recombinante completo segue a "regra de seis".

Tal como para o processo de salvamento, a qualidade das preparações de plasmídeos, os estoques de MVA-T7, bem como a manutenção adequada das células são críticas. Para a maioria dos casos, a purificação padrão de maxiprep de ADN do plasmídeo é suficiente, embora os processos de clonagem e de salvamento difícil devido ao tamanho ou natureza dos transgenes, podem ser melhoradas por meio de purificação do ADN através de centrifugação em gradiente de densidade de CsCl. A eficiência de transfecção usando Lipofectamine é geralmente suficiente para um resgate com sucesso, embora outros métodos de transfecção, tais como nucleofection também pode ser usado. Em qualquer caso, a razão entre os diferentes plasmídeos necessita de ser mantido estritamente (0.4:0.2:0.2:1 para o NP-PL-pNDV, respectivamente). Devido à natureza de alguma forma laboriosa e estocástica do processo de recuperação, pelo menos, 2-4 poços diferentes devem ser transfectadas por construção para ser resgatado, e diferentes clones da mesma construção deve ser ensaiado.

No protocolo que se descreveram aqui, usamos o MVA-T7 para fornecer em trans a polimerase de T7 é necessária para a expressão das construções de cDNA viral. Embora este seja o procedimento padrão em nosso laboratório, não é a única abordagem possível. Por exemplo, outros grupos têm resgatado com sucesso NDV e outros não-segmentadas, vírus de RNA de cadeia negativa, usando linhas de células que expressam constitutivamente altos níveis de T7 polimerase 4,37. A disponibilidade de um vector recombinanteou linhagem celular codificação T7 polimerase, bem como o desempenho específico de cada abordagem em um determinado laboratório, devem ser considerados quando do estabelecimento de novo o sistema de recuperação de NDV.

Após determinação da presença de NDV no fluido alantóide por HA, mais estudos devem ser realizados para caracterizar totalmente o vírus resgatado recentemente, tais como RT-PCR seguida por sequenciação do genoma viral, IFA e Western-blot (WB) para determinar a expressão do gene estranho (se aplicável). Dependendo da natureza das modificações que os vírus recombinantes são de transporte, também pode ser necessário outro tipo de ensaios bioquímicos e funcionais.

O salvamento do recombinante de cDNA de NDV é uma técnica útil para várias razões. Primeiro e o mais óbvio, esta técnica proporciona a capacidade de analisar a biologia de NDV, um vírus economicamente relevantes para a indústria das aves, por experimentalmente alterando os seus genes e sequências reguladoras. NDV é um paramyxovirus intimamente relacionado com patógenos humanos como o sarampo, a papeira ou vírus sincicial respiratório, assim como o emergente, altamente patogênico Hendra e vírus Nipah; pesquisa sobre o ciclo básico de vida desta família de vírus é importante entender sua biologia. Além da pesquisa básica, NDVs recombinantes têm um grande potencial como vacina e vectos oncolíticos, combinando a possibilidade de realizar genes foreing em seus genomas com um perfil de biossegurança bem avaliada. Por todas estas razões, o protocolo de resgate NDV pode ser um recurso valioso para muitos laboratórios em todo o mundo interessados ​​em pesquisa de vírus, desenvolvimento de vacinas e tratamento do câncer.

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Disclosures

Adolfo García-Sastre é um inventor de patentes sobre o vírus da doença de Newcastle recombinantes que são de propriedade da Escola Icahn de Medicina Monte Sinai.

Acknowledgments

Autores gostariam de agradecer aos membros passados ​​e presentes nos laboratórios do drs. Peter Palese e Adolfo García-Sastre para o desenvolvimento de NDV reverter genética técnicas e de assistência técnica. Pesquisa em vírus da doença de Newcastle em AG-S laboratório é parcialmente financiado pelo NIAD conceder R01AI088770 e pelo Departamento de Segurança Interna Ciência e Tecnologia Centro de Excelência para emergentes e zoonoses animais (CEEZAD, número prêmio 2010-ST-061-AG001). Pesquisa em LM-S laboratório é financiado pelos subsídios NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, os Centros de Excelência para NIAID Influenza Pesquisa e Vigilância (HHSN266200700008C), e da Universidade de Rochester Center for Biodefense Imune Modeling (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

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References

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