Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

doi: 10.3791/50830 Published: October 11, 2013

Summary

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

Abstract

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), חבר אב הטיפוס של סוג Avulavirus של המשפחה 1 Paramyxoviridae, הוא שאינם מפולח תחושה שלילית,, חד גדילים, עטף וירוס RNA (איור 1) עם יישומים פוטנציאליים כוקטור לחיסון ו טיפול במחלות אנושיות. חקירה לעומק של יישומים אלה הפכה להיות אפשרית רק לאחר הקמתה של טכניקות גנטיקה הפוכה כדי להציל וירוסי רקומביננטי מפלסמידים קידוד הגנום המלא שלהם כcDNA 2-5. cDNA הנגיפי יכול להיות שונה בנוחות במבחנה באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים לשנות את גנוטיפ של הווירוס ו / או לכלול יחידות תעתיק חדשות. הצלה של וירוסים מהונדסים גנטי כזה מספקת כלי רב ערך כדי להבין את הגורמים המשפיעים על שלבים רבים של זיהום, כמו גם מאפשר פיתוח והשיפור של וקטורים לביטוי והאספקה ​​של אנטיגניםלחיסון וטיפול. כאן אנו מתארים פרוטוקול להצלת NDVs רקומביננטי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), paramyxovirus עופות המשתייכים לסוג Avulavirus 1, הוא סוכן zoonotic כלכלי רלוונטי ובכך נחקר באופן נרחב ומעקבים, אשר באופן חמור יכול להשפיע על גידול עופות בכל רחבי העולם. למרות שלא הפתוגן אנושי, NDV גם נחקר ביסודיות מעבר לשדה הווטרינר הן כparamyxovirus מודל ובשל המאפיינים שלה מעניינים מאוד, הטבעיים oncolytic 6. מחקר על NDV תועלת רב מהפיתוח של טכניקות גנטיקה הפוכה לוירוסים חד גדילים, שאינם מפולחים תחושה השלילית RNA, שתוארו לראשונה על ידי וירוס כלבת Conzelmann וcoleagues 2. מגוון של NDVs מהונדס גנטי, שנשא גנים או שינויים של הגנום הסוג הבר זרים נחקרו בהרחבה מאז. עבודה עם וירוסי רקומביננטי אלה הייתה קריטית כדי לאפיין גורמים ארסי שונים, לא רק של NDV אלא גם של הומא הרלוונטי האחרn פתוגנים כמו שפעת 7 וירוס - וירוס Nipah או מתהווה 8. יתר על כן, מספר מחקרים שונים בחנו את השימוש בטכניקות הללו כדי לשפר את פעילות antitumoral המולדת של NDV 6,9,10, בעיקר על ידי שיפור מאפייני immunostimulatory של הנגיף. אזור רלוונטי אחר של מחקר על NDVs רקומביננטי היה הדור של מועמדי חיסון נגד מחלות ויראליות אחרות כמו שפעת 5,11,12, 13 איידס, חצבת 14, 15 סארס, או שנגרם על ידי נגיף sincytial הנשימה (RSV) 16. בין היתרונות הבולטים השונים הניתנים על ידי NDV הם חוסר החסינות קיימת מראש באוכלוסיות אנושיות, היציבות מוסיף חוץ גנטי, חוסר פעילות recombinatory וכולל פרופיל בטיחות גבוה בשילוב עם מאפייני immunostimulatory הטבעיים האמורים 17. זה גם ראוי לציון השימוש הפוטנציאלי של חיסונים דו ערכי רקומביננטי בעמ 'oultry, שפעת עופות מגנה מפני שני NDV ופתוגניים מאוד וירוסי 11,12. זו עשויה להיות דרך מצוינת כדי להפחית את הסיכויים של האחרון מתפשטים מטבע לבעלי חיים מבויתים, ובכך גם עוזרים למנוע קפיצת היתר ספציפית אפשרית של שפעת עופות חשש לבני אדם. לבסוף, NDV-להביע כתב היה בשימוש להערכה של תגובות חיסוניים מולדים, כמו גם זיהוי של אנטגוניסט אינטרפרון המקודד על ידי וירוסים מרובים 18-27.

תהליך ההצלה של רקומביננטי, שאינו מפולח, נגיף RNA שלילי תקוע בעצם מורכב באופן מלאכותי מאלץ את מחזור שכפול נגיפי בתא ייצור על ידי transfecting קידוד cDNA המכונות מינימליות התולעת מולקולרית, המכונים ribonucleoprotein או RNP (איור 2). RNPs מורכב של פולימראז הנגיפי (P וחלבונים L), nucleoprotein (NP) ורנ"א antigenomic באורך המלא של הנגיף. RNA + antigenome זו הוא התבנית דואר הנדרשת עבור הדור של RNA-הגנום המשלים, אשר, קשור גם עם שאר החלבונים של RNP הנגיפי, משחזרת את אותו מורכב מדבק שנגיף טבעי ישחרר בציטופלסמה של התא על זיהום (איור 2A ). משלב זה ואילך, המחזור הנגיפי יכול להמשיך באופן טבעי וויריונים רקומביננטי, encapsidating גנומים שונה, יופקו (איור 2). למרבה הפלא, transfection של cDNA גנומי במקום cDNA antigenomic מאוד פוגע או לחלוטין מבטל את יעילות הצלת 2,28-30. גם כאשר cDNA antigenomic הוא transfected, את היעילות של encapsidation של RNA רקומביננטי לRNPs בתאי transfected היא כנראה נמוכה מאוד. בגלל זה, פרוטוקולי הצלה לNDV לעתים קרובות כוללים צעדים שונים להגברה של כמה חלקיקים נגיפיים שוחררו מתאי transfected במקור על ידי coculturing אותם עם תאים מתירנית ו / או על ידיזיהום של ביצי embryonated.

לפני ההצלה, ניתן להשפיע cDNA על ידי נהלי שיבוט סטנדרטיים על מנת ליצור את השינויים הרצויים. בעוד מוטציות ספציפיות של מוצרי גן השונים ורצפים רגולטוריים של הנגיף יכולות להיות מושגת בדרך זו בצורה ישירה, רבים של העבודה שפורסמה מעורבת NDV רקומביננטי דרש תוספת של יחידת תעתיק חדשה לתוך הגנום NDV. כמו חברים אחרים במשפחת paramyxovirus, הגנום מקודד NDV שמונה חלבונים שונים לשש יחידות תעתיק, אשר באות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בהתאם למיקום שלהם ביחס לסוף '3 ​​בשיפוע יורד קריטי עבור מחזור החיים הנגיפי 1. בגלל זה, את המיקום של יחידת תעתיק החדשה בתוך הגנום חייב להיות שנבחר בקפידה כדי להשיג איזון בין הביטוי של transgene וירידת הערך של שכפול נגיפי. הכנסה בין P וגני M כבר בשימוש, לא הכיאתרים אחרים האף גם נבדקו 13,31.

לא משנה מה להוסיף, השיבוט לNDV cDNA צריך לעקוב אחר כמה כללים כדי ליצור מבנה rescuable: (i) כל גן חדש שייכלל לתוך הגנום NDV צריך להיות תחת שליטה של ​​האותות המתאימים לRNA תלוי-RNA הנגיפי פולימראז. רצפים אלה יש להוסיף במעלה הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה החדשה (ORF) כך פולימראז יכול לזהות את הסוף של הגן הקודם (GE) ותחילתו של transgene החדש (GS), במרווחים של רצף intergenic נוקלאוטיד יחיד (IG) . תוספת של קוזאק תקף (K) רצף כדי לשפר את תרגום ריבוזומלי אוקריוטים מומלץ גם לחלבון זר ביטוי טוב יותר 32 (ii) שכפול יעיל של NDV, כמו עבור רוב בני משפחת Paramyxoviridae, תלוי באורך הגנום להיות מרובה של שש 33, ולכן כל כניסה לתוך NDV יש לעקוב "השלטון של שש" הזה. במידת צורך, reqניתן להוסיף נוקלאוטידים נוספים uired מורד הזרם ORF החדש, וכן (iii) את הרצף של transgene צריך להיבדק כדי למצוא אפשרי GE ו GS כמו רצפים אשר עלול לפגוע ביעילות הצלה, ביטוי transgene ו / או כדאיות וירוס. אם קיימים, רצפים אלה יש להסיר על ידי mutagenesis השקט. הדור של cDNA באורך המלא רקומביננטי הבא כללים הנ"ל הוא הצעד הראשון כדי לייצר ביעילות NDV מהונדס גנטי כמפורט כאן.

במערכת כל בונה DNA נמצא תחת שליטה של אמרגן פולימראז T7-RNA (איור 3). פולימראז cytoplasmic זה מסופק בטרנס ידי coinfection עם vaccinia וירוס אנקרה הותאם רקומביננטי (MVA-T7) 34. איור 3 א מציג את פלסמיד pNDV-B1, אשר מקודד cDNA antigenomic באורך מלא 5. איור 3 ב מציג פלסמידים pTM1 קידוד NP, ORFs P ו-L. פלסמידים pCITE-GFP, אשר מקודד, under אמרגן T7, החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP), וpCAGGS GFP 18, אשר מקודד באותו ORF תחת האמרגן אקטין בטא עוף 35, משמשים כקבוצת ביקורת. בפרוטוקול זה אנו מציגים את ההליך כדי להציל NDV רקומביננטי מcDNA של B1 lentogenic NDV Hitchner זן 5 (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת תאי יונקים (איור 4A, יום 1)

פיצול הפ-2 או A549 תאי היום לפני transfection ב6 גם צלחות. צפיפות של התאים צריכה להגיע למפגש 80-90% ביום שלמחרת. בדרך כלל, 100 מנה מ"מ מחוברות ניתן לפצל 8 בארות (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל טוב). שליציל את כל וירוס, יש לכלול 2-4 בארות שונות, כמו גם 2 בארות נוספות עבור פקדי pCAGGS-GFP וpCITE-GFP 18, שמטרתה לפקח על transfection ויעילות זיהום MVA-T7, בהתאמה.

2. זיהום של תאי יונקים עם וירוס Vaccinia אנקרה רקומביננטי השתנה הבעת קטריופאג T7-RNA פולימראז (MVA-T7) (איור 4 א, יום 2)

  1. לחמם את PBS 1x/BA/PS ותקשורת ב 37 ° C.
  2. שטוף תאים, פעמיים, עם 1 מיליליטר של PBS 1x/BA/PS.
  3. להדביק את תאי יונקים בתרבית בנגיף MVA-T7 בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 1 pfu / תא בנפח סופי של μl 200 ב-PBS / התואר הראשון / PS עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר.
  4. במהלך הדגירה זיהום ויראלי, להכין את תערובת transfection כמתואר ב3.

3. Transfection של תאי יונקים (איור 4A, יום 2)

  1. הכנת Lipofectamine: מערבבים 1-2 מיקרוגרם של LPF2000 עם 250 μl של OptiMEM לניסיון חילוץ ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. הכנה של ה-DNA: להפוך את קוקטייל פלסמיד עבור כל הצלה ב50 μl של OptiMEM. הוספת 0.4 מיקרוגרם של pTM1-NP, 0.2 מיקרוגרם של pTM1-P, ו0.2 מיקרוגרם של pTM1-L לכל צינור. הוספת 1 מיקרוגרם של שיבוט cDNA באורך המלא של NDV להינצל לצינור אחד. כמו כן להכין שני transfections שליטה, אחד עם 2 מיקרוגרם של pCAGGS-GFP (כדי לבדוק את יעילות transfection) והשני עם 2 מיקרוגרם של pCITE-GFP (כדי לבדוק פולימראז T7 מונע על ידי ביטוי MVA-T7).
  3. לאחר פתרון LPF2000-OptiMEM כבר preincubated במשך 5 דקות (שלב 3.1), להוסיף 250μl של הפתרון לצינורות ה-DNA (שלב 3.2) ו דגירה של 20-30 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. לאחר הדגרה עם MVA-T7, להסיר את הבידוד הנגיף על ידי שאיפה ולהחליף עם תערובת ה-DNA-LPF2000 transfection (שלב 3.3).
  5. הוסף 1 מיליליטר של DMEM 10% FBS / PS לכל מנה.
  6. דגירה התאים הנגועים / transfected ל6-8 שעות (או הלילה) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להחליף את תקשורת transfection עם 1.5 מיליליטר של 10% FBS / PS DMEM הטרי.
  7. ב24 לאחר transfection שעה, ניתן לצפות בארות שליטה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את יעילות transfection (pCAGGS-GFP) ופעילות T7 פולימראז (pCITE-GFP) (איור 5 א). להמשיך בשיתוף התרבות של התאים הנגועים / transfected עם fibroblasts עופות כפי שיתואר להלן.

4. התרבות משותפת של תאי יונקים עם תאי עופות (איור 4 א, יום 3)

בדרך כלל, מנה מחוברות 100 מ"מ רקמת תרבות של עוף (CEFs) ofibroblasts עובר ברווז r (defs) משמש לשתי בארות transfected. הקפד להכין, מראש, מספיק מנות בתרבית רקמת 100 מ"מ של תאי עופות לכל ניסיונות ההצלה. להצלה יעילה של הווירוס, מדיה 10% FBS DMEM / PS היא בתוספת 5% מנוזל allantoic ו30 מ"מ MgCl 2. בשלב זה, 24 pi שעות, בתאי יונקים יכולים להתחיל להראות השפעת cytopathic (CPE) עקב זיהום MVA-T7, asevident באיור 5 א.

  1. להתחמם 1x ותקשורת PBS 37 ° C.
  2. שטוף תאי יונקים, 2x, עם 1 מיליליטר של PBS 1X.
  3. Trypsinize תאי יונקים עם 0.2 מיליליטר של EDTA-טריפסין עד שהם מנותקים. Resuspend תאי 1 מיליליטר של DMEM 10% FBS / PS, 5% נוזל allantoic, 30 מ"מ MgCl 2 והעברה לצלחת תרבית רקמת 100 מ"מ. הוסף 3 מיליליטר של אותה תקשורת.
  4. שטוף תאי עופות, פעמיים, עם 4 מיליליטר של PBS 1X.
  5. Trypsinize תאי עופות עם 1 מיליליטר של EDTA-טריפסין ודגירה של 1-2 דק 'ב 37 מעלות צלזיוס עד תאים לניתק. ה resuspendתאי דואר והוסיפו 8 מיליליטר של 10% FBS / PS, 5% נוזל allantoic DMEM, 30 מ"מ MgCl 2 ולהוסיף 4 מיליליטר של תאי trypsinized לתאי יונקים בצלחת שיתוף התרבותית 100 מ"מ רקמת התרבות להיקף כולל של 8 מיליליטר (4 יונקים מיליליטר, תאי עופות 4 מיליליטר).
  6. נער בעדינות ביד תאי שיתוף התרבותיים בצלחת 100 מ"מ כדי שתהיה התפלגות אחידה ואז למקם אותם בחממה ב37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. הקריטריונים להדבקת ביצים 3 או 4 ימים לאחר שיתוף התרבות של תאי יונקים ועופות תלוי כמה השפעת cytopathic (עיגול תא, מוות, ניתוק מהשטח, וכו '.) הוא ציין בזיהום ויראלי MVA-T7.

5. זיהום של עוף embryonated ביצים (איור 4 א, ימי 6-7)

  1. אחרי 3-4 ימים של התרבות המשותפת של תאי יונקים ועופות, הסר 1 מיליליטר של supernatant תרבית הרקמה ולהוסיף לצינור Eppendorf.
  2. צנטריפוגה supernatant תרבית רקמת 1 דקות ב12,000 סל"ד בספסלצנטריפוגה בראש כדי להסיר פסולת הסלולר.
  3. נר הביצים באמצעות תיבה לקט את ביצים באור כדי לראות את הממשק שבין שק האוויר וחלל allantoic. להטביע את חותמו על גבול ממשק הימנעות לוקליזציה כלי דם. תרסיס אתנול 70% מעל הביצים להקים תנאים סטריליים. בעדינות להפוך את החור בקליפת הביצה על המקום המסומן ולחסן 500 μl של supernatant באמצעות מזרק אינסולין (1 מיליליטר), במטרה את המחט בצורה אנכית ובאופן ישיר לתוך חלל allantoic. (איור 4).
  4. חותם את הכינוי בקליפת הביצה בשעווה או פרפין נמסה.
  5. לדגור על הביצים ל2-3 ימים ב 37 ° C.

6. קציר של נוזל allantoic ממאשרום עוף embryonated ביצים (איור 4 א, ימי 8-10)

  1. לדגור על הביצים הנגועים ל2-4 שעה או הלילה ב 4 ° C כדי להרוג את עובר העוף ולהקריש את הדם.
  2. לרסס את הביצים עם 70% אתנול (כדי לשמור על תנאים סטריליים).
  3. ברז בזהירות את סעיף הקודקוד של הביצה, על חלל האוויר, בכפית. ברגע שקליפת הביצה סדוקה, להסיר את שברים עם מלקחיים ומלואו לחשוף את קרום allantoic.
  4. לחשוף את חלל allantoic ידי מוציא את קרום allantoic עם מלקחיים ומספריים, הימנעות נזק לכלי הדם והחלמון.
  5. לדחוף בזהירות את העובר עם מרית ולאסוף את נוזל upflowing allantoic (8-12 מיליליטר לביצה) עם טפטפת 10 מיליליטר. להימנע מפגיעה בקרום החלמון. מעביר את נוזל allantoic לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר על קרח (שימוש צינור אחד לכל ביצה).
  6. להבהיר את נוזל allantoic ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,500 סל"ד. מעביר את supernatant לצינור טרי מבלי להפריע גלולה.
  7. דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1, עד שבודק אותם לנוכחות של NDV ידי assay hemagglutination.

7. Hemagglutination Assay (HA)

הנוכחות של נגיף בAllantנוזל OIC מהביצים נגועים ניתן לקבוע macroscopically ידי היכולת שלהם hemagglutinate תאי דם אדומים טורקיה (RBC). במקרה של NDV, כ 10 6 פלאק להרכיב יחידות (pfu) לכל מיליליטר נדרש לתת איתות חיובית בassay HA. מבחני HA מתבצעים בצלחות 96 היטב V-תחתון. שלילי (PBS 1x, נוזל allantoic נגוע), כמו גם חיובי (נוזל allantoic מכל וירוס NDV) תמיד צריכה להיות כלולות דגימות שליטה בכל assay HA כדי לאמת את זה. כדי לבצע assay HA:

  1. פיפטה 50 μl של 1x PBS לכל גם בצלחת 96 היטב V-תחתון.
  2. פיפטה 50 μl של דגימות נוזל allantoic לתוך הבורות בעמודה הראשונה של הצלחת. לבצע דילולים סדרתי פי 2 דרך שאר הצלחת וזורקים 50 μl האחרון, נוסף מבארות בעמודה האחרונה.
  3. לוותר 50 μl של .0.5% RBC טורקיה ב PBS 1x בכל טוב. נער בעדינות את הצלחת על ידי הקשה.
  4. דגירה את הצלחת על 4 ° C (או קרח) ואו 30-45 דקות או עד גלולה ברורה נוצר בבארות ביקורת השליליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הצלה של NDV היא הליך מבוסס היטב, מבוצע באופן שיגרתי במעבדות שיש להם גישה לcDNA של הנגיף השלם. עם זאת, הטבע סטוכסטיים המהותי של השיטה הופך אותו לקשה להשגה 100% יעילות הצלה. ניטור השלבים המוקדמים של התהליך, במיוחד את יעילות transfection והזיהום עם MVA-T7, מסייע בזיהוי בעיות אפשריות. איור 5A תערוכות transfection סטנדרטי ויעילות transfection / זיהום שאינן מספיק להצלת NDV מוצלחת. אחרי הסיבובים של הגברה בשיתוף תרבויות עופות יונקות וביצי embryonated, נוכחות של וירוס הציל הוא זוהה על ידי בארות חיוביות בassay HA. NDV גורם hemagglutination ידי קישור אריתרוציטים ובכך מונע שקיעתם בתחתית בצורת V כן. לכן, חוסר פעילות HA יכול בקלות להיות מכובד על ידי היווצרות של גלולה אדומה, עגולה של RBC (איור 5). תוצאות שליליותבassay HA יכול להיות בגלל כייל מספק של נגיף בנוזל allantoic: כייל מינימאלי של כ 10 6 pfu מיליליטר / נדרש לי תוצאת HA חיובית. עדיין יכולות להיות מזוהות על ידי assay immunofluorescence (IFA) כותרות נגיפיות נמוכות באמצעות נוגדני NDV אנטי ספציפיים. מעבר חדש בביצים להגברה נוספת של הווירוס הנמצא בביצים מחוסנת הראשונות מומלץ במקרים אלה.

איור 1
איור 1. ארגון הגנום של נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) שאינו מפולח הגנום, חד גדילים שלילי תחושת RNA של NDV הוא 15,186 נוקלאוטידים (NT) ארוך ומקודד שמונה פוליפפטידים שונים בשש יחידות תעתיק:. NP, P, M, F, ח"נ ו-L בתוספת V וחלבונים W, שמקורה אחרי המשמרות במסגרת הקריאה של ORF P במהלך שעתוק. Noncoding, רצפים רגולטוריים האגףהגנום בה 3 '(מנהיג) ו5' (קרוואן) מסתיים. בהמשך noncoding סוף הגן (GE), intergenic (IG) ותחילת גן רצפים (GS) להסדיר את פעילות פולימראז הנגיפי בין ORFs השונים. רמות הביטוי של גנים השונים על הגנום הנגיפי תלויות בכבוד מיקומם היחסי ל3 'סוף (כלומר תמלילי NP הם נפוצים ביותר, L תמלילים לפחות), ביעילות יצירת שיפוע קריטי לווירוס' מחזור 1 חיים.

איור 2
איור 2. בסיס של הצלת NDV מ-DNA המשובט. השוואה סכמטית בין טבעי () ואת המחזור באופן מלאכותי-Induced (ב ') במהלך תהליך ההצלה. (א) לאחר שחבר לתא המטרה, הווירוס משחרר תוכן הגנומי שלו לתוך הציטופלסמה encapsidated בRNPs. RNA פולימראז מעתיק RNA-הגנום לתוך mRNAs השונים של החלבונים נגיפיים ולתוך RNA משלים, באורך מלא antigenomic + עותק, שהוא תבנית לייצור מספר עותקים של הגנום המקורי שישולבו ויריונים המתהווים. (B ) במהלך תהליך החילוץ, הרכיבים של RNPs (NP, P וחלבונים L, כמו גם באורך מלא, RNA antigenomic בדרך כלל שונה) מסופקים על ידי transfection cDNA. עם הכינון מחדש של RNPs antigenomic בציטופלסמה של תא transfected, הם יכולים לייצר RNPs המשלים, רקומביננטי הגנומי וכל מחזור אז יכול להתחיל מחדש, שהסתיים עם שחרורו של וירוסי רקומביננטי.

איור 3
איור 3. T7-מונע פלסמידים ביטוי עבור הדור של NDV רקומביננטי. () CDNA הנגיפי אורך מלא: הפלסמיד דואר באורך מלא pNDV-B1 אמפיצילין התנגדות נהיגה ביטוי לantigenome lentogenic NDV מתח Hitchner B1 תחת אמרגן T7 (T7 P) ורצף שליחות קטלנית T7 (T7 T) המכיל את ribozyme דלתא הפטיטיס מחשוף (HDR). PNDV-B1 תוכנן במקור לשאת מוסיף זר בין גנים P ו-M 5. החדרה של גן חדש (אתר XbaI) דורשת תוספת של סוף הרגולציה הגנטי (GE), intergenic (IG) ותחילת גן הרצפים (GS), כדי לאפשר ההכרה הפונקציונלית שלה על ידי פולימראז הנגיפי. יעילות ביטוי של transgene ניתן לשפר עם התוספת של רצף קוזאק (K) במעלה הזרם תחילת קודון 32. כל הקלטת הציגה לתוך cDNA NDV צריכה להיות מספר כולל של נוקלאוטידים מתחלק שש לבצע את "השלטון של שישה" 33 שמניע שכפול יעיל של רוב הגנום paramyxovius פלסמידים ביטוי חלבון (ב '):. NP ויראלי, P, ו ORFs L, מוקףעל ידי אמרגן T7 (T7 P), UTR של נגיף encephalomyocarditis (EMC) והשליחות קטלנית T7 (T7 T) רצפים היו משובטים לתוך וקטור התנגדות אמפיצילין עמוד השדרה pTM1 5,36.

איור 4
איור 4. טכניקות גנטיקה הפוכה מבוססות פלסמיד עבור הדור של וירוס ניוקאסל מחלות רקומביננטי. () ההצלה ויראלי: A549 או HEP-2 תאים נגועים בנגיף vaccinia הותאם אנקרה מביעה פולימראז T7 bacteriophage (MVA-T7). לאחר זיהום נגיפי, תאים הם שיתוף transfected עם הביטוי פלסמיד הנדרש לשכפול ושעתוק של הגנום הנגיפי NDV (NP, P, ו-L), יחד עם באורך המלא NDV cDNA, תחת אמרגן T7. עשרים וארבע שעות post-infection/transfection, תאי יונקים הם שיתוף תרבותיים עם fibroblasts עוף או ברווז עובר (CEF וDEF, בהתאמה). שלושה עד ארבעה ימים לאחר ביצי שיתוף תרבות, עוף 8-10 בן יום embryonated הם מחוסן עם supernatants תרבית רקמה של תאי שיתוף התרבות להגברה נוספת. שני עד שלושה ימים לאחר הדגירה של ביצי 8-10 בן יומו על 37 מעלות צלזיוס, נוזל allantoic מן הביצים שנקטפו ונותח לחילוץ מוצלח של נגיף רקומביננטי על ידי assay HA. (+) וירוסי הצלה חיוביים מאופיינים יותר בגנומית (RT-PCR) וחלבון (assay למשל immunofluorescence (IFA) וכתם מערבי רמות (WB) שלילי (-). HA תוצאות יכולות להיות בגלל חוסר מספיק וירוסים כדי להיות . זוהה על ידי HA הדבקה חוזרת של ביצי תרנגולת embryonated טריות כדי להגביר את הווירוס מצויינים זיהום (B) של ביצי תרנגולת embryonated:. 8-10 ביצי embryonated עוף לאור נר, כדי לסמן את הממשק שבין שק האוויר וחלל allantoic עם אינסולין. (1 מיליליטר) במזרק, ביצים נגועים בsupernatant תרבית הרקמה בתוך קאווי allantoicty, כפי שצוין.

איור 5
איור 5. נציג תוצאות. Transfection () ויעילות זיהום MVA-T7: ניאון נציג (משמאל) ו( מימין) שדות בהירים של תאי A549 transfected עם pCAGGS-GFP (למעלה) או נגועים בMVA-T7 וtransfected עם pCITE-GFP (למטה) מומחשים . הביטוי של GFP מכונן מונע על ידי pCAGGS הוא אינדיקטור של יעילות transfection, ואילו אמרגן T7 מונע ביטוי של GFP ידי pCITE הוא שליטה על זיהום MVA-T7 ופעילות פולימראז T7. תאים הם צילמו ב24 post-transfection/post-infection שעה assay hemagglutination (HA) (ב): הנוכחות של חלקיקים נגיפיים בנוזל allantoic גורם hemagglutination, המוצג על ידי חוסר גלולה בתחתית בצורת V כן. היעדר הווירוס מאפשר היווצרות של גלולה אדומה בחלק התחתון של הדואר כן. איור מראה שני הפקדים דרושים לכל assay HA (נוזל שלילי, נקי allantoic; חיובי, מדגם NDV כבר מאופיין), ואת התוצאות של שלוש דגימות ידועות המתקבלות לאחר חילוץ, עם שתי חיוביים (+) ושלילי (-) תוצאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מספר גורמים שיש להתחשב על מנת להשיג תוצאות טובות בזמן הצלת NDV. ראשית, מבנה cDNA באורך מלא כדי לשמש צריך להיות מתוכנן כדי לאפשר את השילוב הפונקציונלי של transgenes / השינויים החדשים לתוך הגנום NDV. משמעות דבר היא, כאמור לעיל, שרצפי הסוף (i) מתאים גנטית (GE), intergenic (IG) ותחילת גן (GS) הם שיש להוסיף אם נדרשו, (ii) אין רצפי GE או GS המשוערת לזרים גן, וכן (iii) הגנום רקומביננטי המלא כדלקמן "השלטון של שש".

באשר לתהליך ההצלה, איכות הכנות פלסמיד, מניות MVA-T7, כמו גם תחזוקה נאותה של תאים הן קריטיות. עבור רוב המקרים, טיהור maxiprep סטנדרטית של ה-DNA פלסמיד היא מספיק, אם כי תהליכי שיבוט וההצלה קשים, בשל גודלו או מהותו של transgenes, ניתן לשפר על ידי טיהור DNA באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות CsCl. יעילות transfection באמצעות Lipofectamine הוא בדרך כלל מספיק לחילוץ מוצלח, גם אם כי ניתן להשתמש בשיטות transfection אחרות כגון nucleofection. בכל מקרה, היחס של פלסמידים השונים צריך להישמר (0.4:0.2:0.2:1 לNP-PL-pNDV, בהתאמה) בהחלט. בשל האופי מייגע ואיכשהו סטוכסטיים של תהליך החילוץ, לפחות 2-4 בארות שונות צריכים להיות transfected למבנה כדי להינצל, ושיבוטים שונים של אותו המבנה צריכים להיות assayed.

בפרוטוקול שתארנו כאן, אנו משתמשים MVA-T7 לספק בטרנס פולימראז T7 נדרש לביטוי של מבני cDNA נגיפיים. בזמן הזה הוא ההליך הרגיל במעבדה שלנו, זה לא הגישה היחידה אפשרית. לדוגמא, קבוצות אחרות שחולצו בהצלחה NDV ונגיפים אחרים שאינו מפולחים, שליליים גדיל RNA באמצעות שורות תאי constitutively מבטא רמות גבוהות של פולימראז T7 4,37. הזמינות של וקטור רקומביננטיאו פולימראז שורת תאי T7 הקידוד, כמו גם את הביצועים הספציפיים של כל אחד גישה במעבדה מסוימת, יש לשקול בעת הקמת מחדש את מערכת ההצלה לNDV.

לאחר קביעת נוכחות NDV בנוזל allantoic ידי HA, מחקרים נוספים שיש לבצע על מנת לאפיין את הנגיף שחולץ זה עתה, כמו RT-PCR ואחריו רצף של הגנום הנגיפי באופן מלא, IFA ומערבי סופג (WB) כדי לקבוע ביטוי של הגן הזר (אם רלוונטי). בהתאם לאופי של השינויים שוירוסי רקומביננטי נושאים, יכול גם להיות נחוץ סוג של מבחני ביוכימיים ופונקציונליים אחר.

ההצלה של NDV רקומביננטי מcDNA היא טכניקה שימושית מסיבות רבות. ראשון והברור ביותר, בטכניקה זו מספקת לך את היכולת לנתח את הביולוגיה של NDV, וירוס רלוונטי מבחינה כלכלית עבור תעשיית העופות, על ידי שינוי באופן ניסיוני את הגנים שלו ורצפים רגולטוריים. NDV הוא paramyxovirus הקשור קשר הדוק לפתוגנים אנושיים כמו חצבת, חזרת או וירוסים לי עובריים בדרכי הנשימה, כמו גם המתהווה, Hendra פתוגניים מאוד ווירוסים Nipah; מחקר על מחזור החיים הבסיסי של משפחה זו של וירוסים חשוב להבין הביולוגיה שלהם. מעבר למחקר בסיסי, יש לי NDVs רקומביננטי פוטנציאל גדול כמו חיסון וvectos oncolytic, המשלב את האפשרות של ביצוע גנים foreing בהגנום שלהם עם פרופיל בטיחות ביולוגי העריך היטב. מכל הסיבות הללו, פרוטוקול הצלת NDV יכול להיות נכס יקר למעבדות רבות בעולם מתעניינים במחקר וירוס, פיתוח חיסון וטיפול בסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אדולפו גרסיה ססטרה היא ממציא פטנטים על וירוסי מחלת רקומביננטי ניוקאסל אשר בבעלות בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני.

Acknowledgments

מחברים מבקשים להודות לחברים בעבר ובהווה במעבדות של בני הזוג. פיטר Palese ואדולפו גרסיה ססטרה לפיתוח NDV הפוך טכניקות גנטיקה ולסיוע טכני. מחקר בנגיף מחלת ניוקאסל במעבדה AG-S ממומן חלקית על ידי NIAD להעניק R01AI088770 ועל ידי המחלקה לביטחון מולדת מרכז מדע וטכנולוגיה של אקסלנס למתעורר ומחלות zoonotic בעלי החיים (CEEZAD, מספר הפרס 2010-ST-061-AG001). מחקר במעבדה של LM-S ממומן על ידי מענקי NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, מרכזי NIAID למצוינות לחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700008C), ואוניברסיטת רוצ'סטר המרכז לBiodefense חיסון דוגמנות (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80, (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).
הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter