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Immunology and Infection

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

doi: 10.3791/50830 Published: October 11, 2013

Summary

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

Abstract

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV), 가족 Paramyxoviridae 1의 Avulavirus 속의 프로토 타입 멤버가 아닌 분할, 음의 의미는 단일 가닥, 예방 접종에 대한 벡터 잠재적 인 응용 프로그램과 RNA 바이러스 (그림 1)을 포위하고있다 인간의 질병의 치료. 이러한 응용 프로그램의 심층 탐사는 cDNA를 2-5로 자신의 완전한 게놈을 암호화하는 플라스미드로부터 재조합 바이러스를 구출하는 역 유전학 기술의 설립 후 수있게되었다. 바이러스 cDNA를 편리 바이러스의 유전자형을 변경 및 / 또는 새로운 전사 단위를 포함하는 표준 클로닝 절차를 사용하여 시험 관내에서 수정 될 수있다. 이러한 유 전적으로 변형 된 바이러스의 구조는 인자 감염의 여러 단계에 영향을 미치는뿐만 아니라 항원의 발현 및 전달을위한 벡터의 개발 및 개선을 허용을 이해하기 위해 유용한 도구를 제공한다예방 접종 및 치료를위한. 여기에서 우리는 재조합 NDVs의 구조에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

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뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 Avulavirus 속 1에 속하는 조류 paramyxovirus은 심각하게 전 세계의 가금류에 영향을 미칠 수있는 경제 관련 때문에 널리 연구되고 감시를 받고 인수 공통 에이전트입니다. 아니 인간의 병원체이지만, NDV는 철저 모델 paramyxovirus로 인해 고도의 흥미, 자연, 온 콜리 틱 속성 6 모두 수의사 필드 이상으로 연구되고있다. NDV에 대한 연구는 크게 첫 번째 Conzelmann 및 coleagues 2로 광견병 바이러스에 대한 설명 단일 가닥이 아닌 분할 된 음의 센스 RNA 바이러스에 대한 역 유전학 기술의 개발 혜택. 외국 유전자 또는 야생형 유전자의 변형을 운반 유전자 변형 NDVs의 다양한 널리 그 이후로 연구되고있다. 이러한 재조합 바이러스로 작업은 NDV의뿐만 아니라 관련 구호 물자의뿐만 아니라 다른 독성 요소를 특성화하는 것이 중요했습니다N 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체 7 - 나 응급 니파 바이러스 8. 또한, 서로 다른 다수의 연구는 주로 바이러스의 면역 자극 특성을 향상시킴으로써, NDV 6,9,10의 타고난 항 종양 활성을 개선하기 위해 이러한 기술을 사용하는 방법을 살펴 보았다. 재조합 NDVs에 대한 연구의 관련 영역이 인플루엔자 5,11,12와 같은 다른 바이러스 성 질병에 대한 백신 후보의 생성하고있다, HIV (13)는, SARS 15, 14 홍역, 또는 그 호흡 sincytial 바이러스 (RSV) (16)에 의해 발생합니다. NDV 의해 제공된 다양한 주목할만한 장점은 인간 개체군에서 기존 면역 결핍이다 사이에, 외래 유전자 삽입, recombinatory 활성의 결여와 전체적으로 전술 천연 면역 자극 특성 (17)과 결합 된 높은 안전성 프로파일의 안정성. 또한 P의 재조합 이가 백신의 잠재적 인 사용을 주목할oultry, NDV 모두에 대한 보호 및 고병원성 조류 인플루엔자는 11, 12를 바이러스. 이 때문에 또한 인간에 지칠대로 지친 조류 독감의 가능한 간 특정 점프를 방지하는 데 도움이, 길 들여진 동물을 야생에서 확산 후자의 가능성을 줄일 수있는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 마지막으로, 리포터 발현 NDV은 선천성 면역 반응의 평가뿐만 아니라 여러 바이러스 18-27 의해 인코딩 인터페론 길항 물질의 식별을 위해 사용되었다.

재조합의 구조 과정은 비 분할, 음의 가닥 RNA 바이러스는 기본적으로 인위적으로 리보 또는 RNP로 알려진 최소한의 감염성 분자 기계, (그림 2)를 코딩하는 cDNA를 형질 전환에 의해 생산 세포에서 바이러스의 복제 사이클을 강제에 구성되어 있습니다. RNP들이 바이러스 중합 효소 (P와 L 단백질)로 구성되어, 핵 단백질 (NP)와 바이러스의 전체 길이 antigenomic RNA. 이 RNA + antigenome는 일입니다또한 바이러스 RNP의 단백질의 나머지 부분과 연관된 상보적인 RNA-게놈의 생성에 필요한 전자 서식, 천연 바이러스 감염시 세포의 세포질 (도 2A에 출시 것이라고 같은 감염성 복잡한 되풀이되었습니다 ). 이후이 단계에서 바이러스 성주기는 자연스럽게 진행하고 수정 된 게놈을 encapsidating 재조합 비리는 (그림 2B)를 생성됩니다. 현저하게, 대신 antigenomic의 cDNA 게놈 cDNA를 형질 크게 손상 또는 완전히 복구 효율 2,28-30을 폐지. antigenomic cDNA를 형질 감염이 되어도, 형질 감염된 세포에서 RNP들로 재조합 RNA의 이입의 효율은 아마도 매우 낮다. 이 때문에, NDV에 대한 구조 프로토콜은 종종 관대 한 세포 및 / 또는에 의해를 공동 배양하여 원래 형질 세포에서 방출되는 몇 가지 바이러스 입자의 증폭에 대해 서로 다른 단계를 포함유정란의 감염.

이전 구조로, cDNA를 원하는대로 수정을 생성하기 위해 표준 복제 절차에 의해 조작 할 수 있습니다. 다른 유전자 생성물 및 바이러스 조절 서열의 특정 돌연변이는 똑 바르게 이러한 방법을 달성 할 수 있지만, 재조합 NDV 관련된 발행 작업의 대부분은 NDV 게놈에 전사 단위의 새로운 첨가를 요구했다. paramyxovirus 제품군의 다른 제품과 마찬가지로, NDV 게놈 차등 바이러스의 생활주기 1 중요한 감소 그라데이션의 3 '말단에 자신의 위치와 관련에 따라 표현되는 여섯 전사 단위로 8 개의 서로 다른 단백질을 인코딩합니다. 이 때문에, 게놈 내 새로운 전사 유닛의 위치는 신중 바이러스 복제의 형질 전환 유전자 및 장애의 발현 사이의 균형을 달성하도록 선택되어야한다. P와 M의 사이 유전자 삽입은 대부분, t를 사용되어왔다무릎 다른 사이트는 13,31을 테스트되었습니다.

(I) NDV 게놈에 포함되는 새로운 유전자가 바이러스 성 RNA 의존-RNA에 해당하는 신호의 통제하에 있어야한다 : 무엇이든간에 삽입, NDV의 cDNA에 복제는 rescuable 구조를 생성하기 위해 몇 가지 규칙을 따라야합니다 중합 효소. 이러한 시퀀스는 새로운 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 상류에 추가되어야하므로 폴리머는 단일 염기 intergenic 서열 (IG)에 의해 이격 된, 이전의 유전자 (GE)과 새로운 형질 전환 유전자 (GS)의 시작 부분의 끝을 인식 할 수있다 . Paramyxoviridae 가족의 대부분의 회원으로 NDV의 (II)의 효율적인 복제, 게놈 길이의 여러 존재에 의존, 유효한 코작 (K) 진핵 생물의 리보솜의 번역을 개선하기 위해 일련의 추가는 또한 더 나은 외국 단백질 발현 32에 추천 여섯 (33)는, 따라서, NDV에 모든 삽입이 "6의 규정"에 따라해야합니다. 필요한 경우, REQuired 추가 뉴클레오티드 하류 새로운 ORF를 추가 할 수 있습니다, 그리고 (iii) 유전자의 순서가 찾아 확인해야 할 GE 및 구조의 효율성, 유전자 발현 및 / 또는 바이러스의 생존 능력에 지장을 줄 수있는 시퀀스 등 GS. 존재하는 경우,이 시퀀스는 침묵 돌연변이에 의해 제거해야합니다. 상술 한 규칙에 따라 재조합 전체 길이 cDNA를 효율적으로 생성 여기서 설명하는대로 유전자 재조합 NDV를 생성하기 위해 첫 번째 단계이다.

시스템의 모든 DNA 구조는 T7 RNA 중합 효소 프로모터 (그림 3)의 제어하에 있습니다. 이 세포질 효소는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스 (MVA-T7) (34)와 동시 감염에 의해 트랜스에 제공된다. 그림 3a는 전체 길이 antigenomic cDNA를 5 인코딩 pNDV-B1 플라스미드를 보여줍니다. 그림 3b는 pTM1 플라스미드는 NP를 인코딩을 보여줍니다, P와 L의 ORF. , U를 인코딩 플라스미드 pCITE-GFP,개 nder T7 프로모터, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 닭 베타 액틴 프로모터 35에서 동일한 ORF를 암호화는 pCAGGS GFP (18)는, 컨트롤로 사용됩니다. 이 프로토콜에서 우리는 lentogenic NDV 변형 Hitchner의 B1 5 (그림 4)의 cDNA의에서 재조합 NDV를 구출하는 절차를 보여줍니다.

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Protocol

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1. 포유 동물 세포의 준비 (그림 4A, 1 일)

분할 HEP-2 또는 A549 세포를 6 - 웰 플레이트에 형질 전날. 세포의 밀도는 다음 날 80-90% 합류에 도달해야합니다. 일반적으로 합류 100mm 요리 8 우물에 (물론 당 6 ~ 10 x 1 주위 세포)를 분할 할 수 있습니다. 각각의 바이러스가 구출 될 때까지, 2-4 다른 우물이 포함되어야한다,뿐만 아니라 각각 형질 전환 및 MVA-T7 감염의 효율성을 모니터링하기위한 제어는 pCAGGS-GFP 및 pCITE-GFP 18 2 여분의 우물,,.

2. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소 (MVA-T7)를 발현하는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스와 포유 동물 세포의 감염 (그림 4A, 2 일)

  1. 37 ° C에서 PBS 1x/BA/PS와 미디어를 따뜻하게
  2. PBS 1x/BA/PS 1 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
  3. 감염의 다중성 (AT MVA-T7 바이러스로 배양 된 포유 동물 세포를 감염 모이1) 실온에서 1 시간 동안 PBS / BA / PS 200 μL의 최종 볼륨 PFU / 셀.
  4. 3에 설명 된대로 바이러스 감염 배양하는 동안, 형질 믹스를 준비합니다.

3. 포유 동물 세포의 형질 (그림 4A, 2 일)

  1. 리포 펙 타민의 준비 : 구출 작전 당 티멤 250 ㎕ 씩 LPF2000 1-2 μg을 혼합하고 실온에서 5 분 동안 품어.
  2. DNA의 준비 : 티멤 50 μL의 각 구조에 대한 플라스미드 칵테일을 확인합니다. 0.4 pTM1-NP ㎍의, pTM1-P 0.2 μg, 튜브 당 pTM1-L의 0.2 μg을 추가합니다. 각 튜브에 구출 할 NDV의 전체 길이의 cDNA 클론의 1 μg을 추가합니다. 또한 두 개의 제어 형질,는 pCAGGS-GFP의 2 μg 하나 (형질 전환 효율을 확인하기 위해) 및 (T7 효소가 MVA-T7에 의해 발현을 구동 확인) pCITE-GFP의 2 μg과 다른 준비를합니다.
  3. LPF2000-티멤 용액을 5 분 (단계 3.1)에 대한 예비 인큐베이션 한 후, 추가 250DNA 튜브에 대한 해결책의 μL (3.2 단계) 및 실온에서 20 ~ 30 분 동안 품어.
  4. MVA-T7과 부화 후, 흡인에 의해 바이러스 접종을 제거하고 DNA-LPF2000 형질 믹스 (단계 3.3)로 교체합니다.
  5. 각 요리에 DMEM 10 % FBS / PS의 1 ML을 추가합니다.
  6. 37 ° C, 5 % CO 2에서 6 ~ 8 시간 (또는 야간)에 감염된 / 형질 전환 세포를 품어하고 신선한 DMEM 10 % FBS / PS 1.5 ㎖로 형질 미디어를 교체합니다.
  7. 24 시간 후 형질에서 제어 우물은 형질 전환 효율 (는 pCAGGS-GFP) 및 T7 효소 활동 (pCITE-GFP) (그림 5A)을 평가하기 위해 형광 현미경으로 관찰 할 수있다. 아래에 설명 된대로 새 섬유 아 세포로 감염된 / 형질 전환 세포의 공 배양을 진행합니다.

4. 조류 세포와 포유 동물 세포의 공동 문화 (그림 4A, 3 일)

일반적으로 닭의 합류 100mm 조직 배양 접시 (CEFs) OR 오리 (인증 된 정의) 배아 섬유 아 세포는 두 개의 형질 우물 당 사용된다. 사전에 모든 구조 시도 당 조류 세포의 충분한 100mm 조직 문화 요리를 준비해야합니다. 바이러스의 효율적인 구조를 들어, DMEM 10 % FBS / PS 미디어는 막액 30 mM의 MgCl2를 5 %로 보충된다. 이 시점에서 24 시간 파이, 포유 동물 세포 인해 MVA-T7 감염,도 5a에 asevident에 세포 변성 효과 (CPE)를 보여주는 시작할 수 있습니다.

  1. 37 ° C.에 PBS의 1X 및 미디어 워밍업
  2. PBS 1X 1 ㎖로 2 배, 포유 동물 세포를 씻으십시오.
  3. 그들은 분리 될 때까지 EDTA-트립신의 0.2 ml의 포유 동물 세포를 Trypsinize. DMEM 10 % FBS / PS 1 ㎖로 세포를 재현 탁 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를하고 100mm 조직 배양 접시로 전송. 동일한 매체의 3 ML을 추가합니다.
  4. PBS 1X의 4 ㎖로, 두 번, 조류 세포를 씻으십시오.
  5. 세포가 분리 될 때까지 1 EDTA-트립신 ㎖ 및과를 Trypsinize 조류 세포는 37 ° C에서 1 ~ 2 분 동안 품어. 재현 탁 일8 DMEM 10 % FBS / PS, 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를 2 ㎖ 및 8의 총 볼륨의 공 배양 100mm 조직 배양 접시에있는 포유 동물 세포에 트립신 세포 4 ㎖를 추가를 추가 전자 셀 ML (4 ML의 포유류, 4 ㎖의 조류 세포).
  6. 부드럽게 균일 한 분포가 다음 3 ~ 4 일 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 위해 손으로 100mm 접시에 공동 배양 된 세포를 흔들. 3 4 일 포유류 및 조류 세포의 공동 배양 후 계란을 감염에 대한 기준은 (세포 반올림, 죽음, 표면 박리 등이.) MVA-T7 바이러스 감염에서 관찰 얼마나 많은 세포 변성 효과에 따라 달라집니다.

5. 닭 유정란의 감염 (그림 4A, 일 6 ~ 7)

  1. 포유 동물 및 조류 세포의 공 배양 3-4 일 후, 조직 배양 상등액 1 ㎖를 제거하고 에펜 도르프 튜브에 추가한다.
  2. 벤치에서 12,000 rpm에서 1 분 동안 조직 배양 상층 액을 원심 분리기세포 파편을 제거하는 최고 원심 분리기.
  3. 공기 주머니와 뇨 공동 사이의 인터페이스를 확인하기 위해 빛을 불빛에 비춰 조사 상자를 사용하여 계란을 촛불. 인터페이스 테두리 혈관 지역화를 피하는 표시를합니다. 무균 조건을 확립하기 위해 계란을 통해 70 % 에탄올 스프레이. 부드럽게 표시된 자리에 달걀 껍질에 구멍을 뚫어 뇨 공동으로 수직으로 직접 바늘을 목표로, 인슐린 (1 ㎖)을 주사기를 사용하여 상층 액 500 μl를 접종. (그림 4B).
  4. 녹은 왁스 나 파라핀 달걀 껍질에 흠을 봉인.
  5. 37 ℃에서 2 ~ 3 일 계란을 품어

6. 감염된 닭 유정란에서 뇨의 유체 (그림 4A, 8 ~ 10 일)의 수확

  1. 닭 배아를 죽이고 피를 응고하기 위해 4 ° C에서 2-4 시간 또는 하룻​​밤 감염된 알을 품다.
  2. 70 % 에탄올 (멸균 조건을 유지하기 위해)으로 스프레이 계란.
  3. 조심스럽게 숟가락으로 공기 구멍을 통해 계란의 꼭대기 부분을, 누르십시오. 달걀 껍질에 균열이되면, 집게와 조각을 제거하고 완전히 뇨 막을 노출.
  4. 혈관의 손상과 노른자를 피하고, 집게와 가위로 뇨 막을 절개하여 뇨 구멍을 노출합니다.
  5. 조심스럽게 주걱으로 배아를 아래로 누르고 10 ㎖ 피펫으로 상향 유동 막액 (달걀 당 8 ~ 12 ㎖)에 수집합니다. 노른자 막 손상을 방지. 얼음에 15 ML의 원심 분리기 튜브 (달걀 당 하나의 튜브를 사용)에 막액을 전송합니다.
  6. 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 막액 명확화. 펠렛을 방해하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  7. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 저장 샘플, 혈구 응집 분석에 의해 NDV의 존재를 확인한까지.

7. 혈구 응집 (HA) 분석

allant에서 바이러스의 존재감염된 계란에서 OIC 유체는 칠면조 적혈구 (RBC)를 hemagglutinate 할 수있는 능력에 의해 육안으로 확인할 수 있습니다. NDV의 경우에는, 밀리리터 당 단위를 형성하는 약 10 6 플라크 (PFU)는 HA 분석에서 양성 신호를 제공하기 위해 요구된다. HA의 분석은 V-바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시된다. 네거티브 (PBS 1X, 비감염 막액)뿐만 아니라 양극 (모든 NDV 바이러스로부터 막액) 컨트롤 샘플은 항상 검증을 어떤 HA 분석에 포함되어야한다. HA 분석을 수행하려면 :

  1. 피펫 V-바닥 96 - 웰 플레이트에 웰 당 PBS의 1X의 50 μL.
  2. 피펫 판의 첫 ​​번째 열에서 우물에 막액 샘플 50 μL. 판의 나머지 부분을 통해 2 배 시리얼 희석을 수행하고 마지막 열에서 우물에서 마지막으로, 추가 50 μl를 폐기합니다.
  3. 잘 당 PBS 1X 0.5 % 칠면조 RBC의 50 μl를 분배. 부드럽게 눌러 판을 흔들.
  4. 4 ° C에서 (또는 얼음) F에서 접시를 품어또는 30 ~ 45 분 또는 클리어까지 펠릿은 음성 대조군 웰에 형성된다.

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Representative Results

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NDV의 구조는 정기적으로 바이러스의 전체 cDNA를 액세스 할 수있는 실험실에서 수행 잘 설립 절차입니다. 그러나, 본 방법의 본질적인 스토캐스틱 자연 어려운 100 % 복구 효율을 달성 할 수있다. 프로세스의 초기 단계, MVA-T7과 특수 형질 전환 효율과 감염을 모니터링 가능한 문제. 그림 5A 표준 형질 성공적인 NDV 구조에 대한 충분한 형질 전환 / 감염의 효율을 보여줍니다를 식별하는 데 도움이됩니다. 조류 - 포유류의 공동 문화와 유정란 증폭 라운드 후, 구조 바이러스의 존재는 HA 분석에서 긍정적 인 우물에 의해 검출된다. NDV는 적혈구를 연결하여 혈구 응집을 유도하고, 따라서 잘 V 자형의 하부에 그 침강을 방지한다. 따라서 HA 활성의 결여는 쉽게 RBC의 빨강, 둥근 펠릿 (도 5b)의 형성에 의해 구별 될 수있다. 부정적인 결과HA 분석에 의한 막액에있는 바이러스의 부족 역가에 할 수있다 : 약 10 6 PFU / ㎖의 최소 역가가 긍정적 인 HA 결과를 가지고 있어야합니다. 낮은 바이러스 역가가 여전히 특정 항 NDV 항체를 이용하여 면역 형광 분석 (IFA)에 의해 검출 될 수있다. 첫 번째 접종 달걀에 존재하는 바이러스의 더 증폭 계란에 새로운 통로가 이러한 경우에 권장합니다.

그림 1
그림 1. 뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)의 게놈 조직 NDV의 비 분할, 단일 가닥 음의 센스 RNA 게놈 (NT) 긴 15,186 뉴클레오타이드 여섯 전사 단위로 8 개의 서로 다른 폴리 펩타이드를 인코딩합니다. NP, P, M, F, HN 및 L 플러스 V 및 W 단백질은 전사 동안 P ORF의 리딩 프레임의 변화 이후에 유래. 비 암호화, 규제 시퀀스는 측면에의 게놈은 3 '(리더) 및 5'(트레일러) 끝납니다. 또한 intergenic 유전자 끝 (GE), (IG)를 비 암호화 유전자의 시작 (GS) 시퀀스는 여러 개의 ORF 사이에 바이러스 중합 효소의 활동을 조절한다. 바이러스 게놈의 다른 유전자의 발현 수준은 수명주기 1 '을 효과적으로 바이러스에 대한 중요한 그라데이션을 만들어 (즉, NP 성적표는 L이 적어도 성적 증명서, 가장 풍부) 3'말단에 상대적인 위치와 관련에 따라 달라집니다.

그림 2
그림 2. 클로닝 된 DNA로부터 NDV 구조. 내츄럴 (A) 간의 회로도 비교 및 복구 과정에서 인공적으로 유도 (B)주기에 기초. (A) 표적 세포에 부착 한 후, 바이러스는 encapsidated 세포질로의 게놈 콘텐츠를 출시 RNP들에. RNA 중합 효소가 바이러스 성 단백질 및 초기 비리에 포함됩니다 원래 게놈의 여러 사본의 생산을위한 템플릿입니다 보완, 전체 길이 antigenomic RNA + 복사에 다른의 mRNA에 RNA 게놈을 표기하고 있습니다. (B ) 구조 과정 RNP들 (NP, P 및 L 단백질뿐만 아니라, 전체 길이, 보통 변경됨 antigenomic RNA)의 구성 요소는 cDNA를 형질 감염에 의해 제공된다. 형질 세포의 세포질에서 antigenomic RNP들의 재구성하면, 그들은 보완, 재조합 게놈 RNP들을 생성 할 수 및 전체 사이클은 재조합 바이러스의 출시로 끝나는, 새롭게 시작할 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 재조합 NDV의 생성을위한 발현 플라스미드를 T7 구동. (A) 전체 길이 바이러스의 cDNA : 목T7 프로모터 (P의 T7) 및 간염 델타 리보 자임 (HDR) 분열을 포함하는 T7의 종결 자 시퀀스 (T의 T7)에서 lentogenic NDV 변형 Hitchner의 B1의 antigenome의 발현을 구동 전자 전체 길이 pNDV-B1 암피실린 내성 플라스미드. pNDV-B1은 원래 P와 M 유전자 (5) 사이에 외국의 삽입을 수행하도록 설계되었습니다. 새로운 유전자 (를 XbaI 사이트)의 삽입은 바이러스 중합 효소에 의해 그 기능을 인식 할 수 있도록 규제 유전자의 끝 (GE)의 추가, intergenic (IG) 유전자의 시작 (GS) 시퀀스가​​ 필요합니다. 형질 전환 유전자의 발현 효율이 32 코돈 상류 개시 코작 (K) 서열의 첨가로 개선 될 수있다. NDV의 cDNA에 도입 된 전체 카세트 가장 paramyxovius 게놈의 효율적인 복제를 구동 (33) "6의 규정"에 따라 여섯으로 나누어 뉴클레오티드의 총 수를 가질 필요가 (B) 단백질 발현 플라스미드 :. 바이러스 NP, P, 및 측면에 L의 ORF를,T7 프로모터 (P의 T7), encephalomyocarditis 바이러스 (EMC)의 UTR과 T7 터미네이터 (T의 T7)에 의해 시퀀스는 pTM1 백본 암피실린 저항 벡터 5,36에 클로닝 하였다.

그림 4
그림 4. 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 생성을위한 플라스미드 - 기초 역 유전학 기술. (A) 바이러스 성 구조 : A549 또는 HEP-2 세포는 수정 된 우두 바이러스 앙카라는 박테리오파지 T7 폴리머 (MVA-T7을) 표현에 감염된. 바이러스 감염 후, 세포는 T7 프로모터 하에서 함께 전장 NDV cDNA를 가진, NDV 바이러스 게놈 (NP, P 및 L)의 복제와 전사에 필요한 발현 플라스미드와 공동 - 형질 감염된다. 주야 post-infection/transfection, 포유 동물 세포는 (CEF 닭 또는 오리 배아 섬유 아 세포와 공동 배양 및DEF, 각각). 공동 문화, 8-10 일 된 닭 유정란은 더욱 증폭을위한 공동 배양 세포의 조직 배양 상층 액에 접종 3-4 일 후. 2 ~ 삼일 37 ° C에서 8-10 일 된 계란의 부화 후, 계란에서 막액은 HA의 분석에 의해 재조합 바이러스의 성공적인 구조 수확하고 분석한다. 양 (+)의 구조 바이러스가 더 게놈 (RT-PCR)에 특징과 단백질 (예를 들면 면역 형광 분석 (IFA)와 웨스턴 블롯 (WB) 수준 음수 (-.) HA 결과로 인해 수있을 정도로 바이러스의 부족 일 수 있습니다 . 바이러스를 증폭하는 신선한 닭 유정란의 HA 다시 감염에 의해 감지 표시됩니다 닭 유정란의 (B) 감염 :. 8-10 닭 유정란이 공기 주머니와 뇨 공동 사이의 인터페이스를 표시하는 불빛에하는 인슐린. (1 ㎖) 주사기, 계란 막액의 CAVI 내부 조직 배양 상청액에 감염된타이, 표시된.

그림 5
그림 5. 대표 결과. (A) 형질과 MVA-T7 감염 효율 : 대표 형광등 (왼쪽)과는 pCAGGS-GFP (TOP)로 형질 또는 MVA-T7에 감염 pCITE-GFP (아래)로 형질 A549 세포의 밝은 (오른쪽) 필드는 도시된다 . 는 pCAGGS에 의해 구동 제정 GFP 발현은 T7 프로모터가 pCITE하여 GFP 발현을 구동하는 반면, MVA-T7 감염과 T7 효소의 활동을 제어하고, 형질 전환 효율을 나타내는 지표이다. 막액의 바이러스 입자의 존재 혈구 응집을 유도, 잘 모양의 V의 하단에있는 펠렛의 부족에 의해 표시됩니다 : 세포는 24 시간 post-transfection/post-infection (B) 혈구 응집 분석 (HA)에 몇 군데 있었다. 바이러스의 부재는 수 일의 바닥에 빨간색 펠렛의 형성전자 아니라. 그림은 모두 표시 모든 HA 분석에 필요한 관리 (음, 깨끗한 막액 양수, 이미 특징 NDV 샘플), 긍정적 두 (+)와 구조 후의 세 미지 시료의 결과와 음수 (-) 결과.

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Discussion

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몇몇 요인 NDV 구출하면서 좋은 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 첫째, 사용되는 전장 cDNA 구조체는 NDV 게놈에 트랜스 진 새로운 / 수정 기능 내장 할 수 있도록 설계 될 필요가있다. (II)에는 추정 GE 또는 GS 시퀀스가​​ 외국에없는, 위에서 언급 한 바와 같이이 (I) 해당 유전자의 끝 (GE), intergenic (IG) 유전자의 시작 (GS) 시퀀스가​​ 필요한 경우 추가 할 수 있다는 것을, 의미 유전자, 그리고 (iii) 전체 재조합 게놈은 "6의 규정"을 다음과 같습니다.

구조 과정으로, 플라스미드 준비의 품질, MVA-T7 주식뿐만 아니라 세포의 적절한 유지 관리가 중요합니다. 도입 유전자의 크기 또는 특성상 어렵다 복제 및 복구 프로세스, CSCL 밀도 구배 원심 분리를 통해 DNA를 정제함으로써 개선 될 수 있지만, 대부분의 경우를 들어, 플라스미드 DNA의 표준 maxiprep 정화는 충분하다. 리를 사용하여 형질 전환 효율같은 nucleofection 다른 형질 전환 방법도 사용할 수 있지만 pofectamine는 성공적인 구조에 대한 일반적으로 충분하다. 어떠한 경우에도, 상이한 플라스미드의 비율은 엄격 (각각 NP-PL-pNDV위한 0.4:0.2:0.2:1) 유지 될 필요가있다. 인해 복구 프로세스의 힘들고 든 확률 특성상 적어도 2-4 상이한 웰 구출 될 구조체 당 형질되어야하고, 동일 구조의 상이한 클론을 정량한다.

우리가 여기에서 기술 한 프로토콜에서, 우리는 트랜스에 바이러스 cDNA를 구조의 표현에 필요한 T7 폴리머를 제공하기 위해 MVA-T7을 사용합니다. 이것은 우리 실험실에서 표준 절차이지만, 그것은 가능한 유일한 방식이 아니다. 예를 들어, 다른 그룹이 성공적으로 구성 적으로 T7 폴리머 라제 4,37 높은 수준으로 발현하는 세포주를 이용하여 NDV 및 다른 비 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 구출. 재조합 벡터의 사용 가능 여부NDV 대한 구조 시스템을 새롭게 형성 할 때 또는 세포주 엔코딩 T7 중합 효소뿐만 아니라 관련 실험실에서 어느 방식의 특정 성능은 고려되어야한다.

HA에 의해 막액의 NDV 존재의 결정 후, 추가 연구가 완전히 바이러스 게놈의 시퀀싱 다음과 같은 RT-PCR로 새로 구출 바이러스, 특성을 수행 할 수 있으며, IFA와 웨스턴 블로 팅 (WB)는 식 결정 외래 유전자의 (해당되는 경우). 재조합 바이러스를 운반하는 수정의 성격에 따라, 생화학 적 및 기능적 분석의 다른 종류가 필요할 수도 있습니다.

의 cDNA에서 재조합 NDV의 구조는 여러 가지 이유에 대한 유용한 기술이다. 먼저 가장 눈에 띄는,이 기술은 실험적으로는 유전자와 조절 서열을 변경하여 NDV, 조류 산업의 경제적으로 중요한 바이러스의 생물학을 분석하는 기능을 제공합니다. NDV 밀접하게 인간의 홍역, 유행성 이하선염 또는 호흡기 세포 융합 바이러스 같은 병원균뿐만 아니라, 긴급, 고병원성 헨드라 및 니파 바이러스와 관련된 paramyxovirus이며, 바이러스의 가족의 기본 수명주기에 대한 연구는 생물학을 이해하는 것이 중요합니다. 기초 연구를 넘어, 재조합 NDVs는 잘 평가 바이오 안전성 프로필과 자신의 게놈에 foreing 유전자를 운반의 가능성을 결합 백신 콜리 틱 vectos으로 큰 잠재력이있다. 이러한 모든 이유를 들어, NDV 구조 프로토콜은 바이러스 연구, 백신 개발 및 암 치료에 관심이 전 세계적으로 많은 실험실에 귀중한 자산이 될 수 있습니다.

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Disclosures

아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 시나이 산에서 의학의 아이칸 학교가 소유하고 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 대한 특허의 발명가이다.

Acknowledgments

저자는 박사 부부의 실험실에서 과거와 현재 회원에게 감사의 말씀을 전합니다. 피터 Palese의와 NDV의 개발을위한 아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 유전학 기술과 기술 지원을 역방향. NIAD이 R01AI088770를 부여하고 우수의 국토 안보부 과학 기술 센터의 부서에 의해 의해 AG-S 실험실에서 뉴캐슬 질병 바이러스의 연구는 부분적으로 재정 지원 신흥 및 동물 매개 동물의 질병 (CEEZAD, 보너스 번호 2010-ST-061-AG001). LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시 (HHSN266200700008C)에 대한 우수의 NIAID 센터, Biodefense에 면역 모델링을위한 로체스터 센터의 대학 (HHSN272201000055C)에 의해 자금 지원 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

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References

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의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조
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Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

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