Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

CDNA'dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

doi: 10.3791/50830 Published: October 11, 2013

Summary

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

Abstract

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), ailenin Paramyxoviridae 1'in Avulavirus cinsinin prototip üyesi, segmentli olmayan, negatif sens, tek iplikçikli bir aşılama için bir vektör olarak olası uygulamaları ile RNA virüsü (Şekil 1) saran ve bir insan hastalıklarının tedavisi. Bu uygulamaların derinlemesine keşif sadece cDNA 2-5 olarak tam genomu kodlayan plazmid rekombinant virüsleri kurtarmak için ters genetik tekniklerin kurulmasından sonra mümkün hale gelmiştir. Viral cDNA uygun bir virüsün genotipinin değiştirilmesi için ve / veya yeni transkripsiyon birimleri dahil etmek için, standart klonlama prosedürlerini kullanarak, in vitro olarak modifiye edilebilir. Bu tür genetik olarak modifiye edilmiş virüsler Rescue faktörleri çok sayıda enfeksiyon aşamaları etki, hem de antijenlerinin ifadesi ve dağıtımı için vektörlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için izin anlamak için değerli bir araç sağlarAşılama ve tedavisi için. Burada rekombinant NDVs kurtarılması için bir protokol açıklar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), Avulavirus cinsine 1 ait bir kuş paramyxovirus, ciddi, tüm dünyada kanatlı hayvancılığın etkileyebilir ekonomik kuruluşları ve dolayısıyla yaygın olarak araştırılmış ve surveilled zoonotik ajandır. Bir insan patojeni rağmen, NDV de iyice bir model olarak paramixovirüsün nedeniyle son derece ilgi çekici doğal onkolitik özellikleri 6'ya hem de veteriner alanının ötesine incelenmiştir. NDV'nin Araştırma ölçüde ilk Conzelmann ve coleagues 2 ile kuduz virüsü için açıklanan tek iplikli, non-segmentli negatif anlamda RNA virüsler için ters genetik tekniklerin geliştirilmesi yararlanmıştır. Yabancı genlerin ya da vahşi tip genomun modifikasyonlarını taşıyan genetik olarak değiştirilmiş NDVs, bir dizi geniş beri incelenmiştir. Bu rekombinant virüsler ile çalışma NDV nin değil, aynı zamanda diğer ilgili huma sadece farklı hastalık oluşturma faktörlerini tanımlamak için önemli olmuşturn, influenza A virüsünün 7 gibi patojenler - veya acil Nipah virüsü 8. Ayrıca, farklı bir dizi çalışma çoğunlukla virüs immün sistemi uyarıcı özelliklerini geliştirerek, NDV 6,9,10 doğuştan gelen anti-tümör aktivitesini geliştirmek için bu tekniklerin kullanımı denenmiştir. Rekombinant NDVs araştırma diğer ilgili alanı, grip 5,11,12 gibi diğer viral hastalıklara karşı aşı adaylarının üretimi olmuştur HIV 13, SARS 15, 14, kızamık, ya da solunum sincytial virüsü (RSV) 16 kaynaklanır. NDV tarafından sağlanan çeşitli önemli avantajlar, insan popülasyonlarında önceden varolan bağışıklık eksikliği olan arasında, yabancı genetik uçlar, recombinatory bir etkinlik eksikliği ve genel olarak yukarıda sözü edilen doğal immün sistemi uyarıcı özellikleri 17, ve yüksek bir güvenlik profili kararlılığı. Ayrıca, p rekombinant bivalent aşıların potansiyel kullanımı çekicidiroultry, NDV karşı hem koruyucu ve çok patojen Avian influenza virüsleri 11,12. Bu nedenle de insanlar için korkunç bir kuş gribi olası arası özel atlama önlemek için yardım, evcil hayvanlara vahşi yayılan ikincisinin şansını azaltmak için mükemmel bir yol olabilir. Son olarak, raportör salgılayan NDV doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin değerlendirilmesi yanı sıra birden fazla virüs 18-27 tarafından kodlanan interferon antagonistinin tanımlanması için kullanılmıştır.

Bir rekombinant kurtarma işlemi, segmentli olmayan, negatif-şeritli RNA virüsüdür temel olarak yapay ribonükleoprotein ve RNP olarak bilinen en az iltihaplı bir moleküler makinaları, (Şekil 2) kodlayan cDNA ile transfekte üreten bir hücre içinde viral replikasyon döngüsü zorlama üzerinde oluşur. RNP viral polimeraz (P ve L proteinleri) oluşur, nükleoprotein (NP) ve virüsün tam uzunluklu antigenomik RNA. Bu RNA + antigenome thAyrıca, viral RNP proteinlerinin geri kalanı ile ilişkili tamamlayıcı RNA-genomların, üretimi için gerekli e şablon, doğal bir virüs enfeksiyonu üzerine hücrenin sitoplazması (Şekil 2A ile ilgili serbest olacağı aynı bulaşıcı kompleksi tartışıldı .) Itibaren bu adımından, viral çevrim doğal olarak devam edebilir ve modifiye genomları encapsidating rekombinant virionları, (Şekil 2B) oluşturulur. Dikkate değer, yerine antigenomik cDNA'nın genomik cDNA transfeksiyon büyük ölçüde engelleyen ya da tamamen ortadan kaldırmaktadır kurtarma verim 2,28-30. Antigenomik cDNA transfekte edilmiş olsa bile, transfekte edilmiş hücreler içinde RNP içine rekombinant RNA encapsidation verimliliği muhtemelen çok düşüktür. Bu nedenle, NDV için kurtarma protokoller genellikle permisif hücreler ve / veya bunları coculturing tarafından orijinal olarak transfekte edilmiş hücrelerden salınan birkaç viral parçacıkların yükseltilmesi için farklı adımlar şunlardırembriyolu yumurtaların enfeksiyonu.

Önceki kurtarmak için, cDNA istenilen değişiklikleri oluşturmak için standart klonlama prosedürleri ile manipüle edilebilir. Farklı gen ürünleri ve virüs düzenleyici sekansların spesifik mutasyonlar doğrudan doğruya bu şekilde elde edilebilir olsa da, yeniden birleştirici NDV ile ilgili yayınlanmış iş birçok NDV genomuna yeni bir transkripsiyonel birim eklenmesini gerektirmiştir. Paramiksovirüs ailesinin diğer üyeleri gibi, NDV genomu farklı olarak, viral yaşam çevriminde kritik 1 azalan bir gradyanı içinde 3 'ucuna konumları bakımından bağlı olarak ifade edilmiştir altı transkripsiyon birimleri halinde sekiz farklı proteinleri kodlar. Bu nedenle, genomu içinde yeni transkripsiyon ünitesinin yeri dikkatlice viral replikasyon ve transgen sentezlenmesi yetmezliği arasında bir denge elde etmek için seçilmelidir. P ve M genleri arasında Ekleme en, t kullanılmıştırhough diğer siteler de 13,31 test edilmiştir.

(I) NDV genomuna dahil edilmesi için yeni bir gen, viral RNA-bağımlı RNA için uygun sinyallerinin kontrolü altında olduğu var ne olursa olsun, insert, NDV cDNA içine klonlama rescuable bir yapı oluşturmak için bazı kurallar takip etmek gerekiyor polimeraz. Bu sekanslar, yeni açık okuma çerçevesinin (ORF) üst akışında eklenmelidir, böylece polimerazı, bir tek nükleotid sekansı intergenik (IG) ile aralıklı, önceki geni (GE) ve yeni transgen (GS) başından sonuna tanıyabilir . Paramyxoviridae ailesinin en üyeleri için olduğu gibi, NDV nin (ii) etkili bir replikasyon, genom uzunluğu birden fazla olmak bağlıdır, geçerli bir Kozak (K) ökariyotik ribozomal Çeviri geliştirmek için dizisi eklenmesi de daha iyi bir yabancı protein ifadesi 32 için önerilir Altı 33, bu nedenle herhangi bir NDV ekleme, bu "altı kural" takip etmelidir. Gerekirse, reqedinilmiş ek nükleotidleri alt yeni ORF eklenebilir ve (iii) transgen sekansı bulmak için kontrol edilmelidir mümkün GE ve kurtarma verimlilik, transgen ekspresyonu ve / veya virüs canlılığını bozabilecek dizileri gibi GS. Eğer mevcutsa, bu diziler sessiz mutagenezi ile temizlenmelidir. Yukarıda belirtilen kurallara yeniden birleştirici tam uzunlukta bir cDNA üretimi etkili bir şekilde burada ayrıntılı biçimde açıklandığı gibi, genetik olarak değişime uğramış NDV üretmek için ilk adımdır.

Sistemde tüm DNA yapıları, T7 RNA polimeraz promoteri (Şekil 3) kontrolü altındadır. Bu sitoplazmik polimerazı, bir modifiye edilmiş rekombinant vaccinia virüsü Ankara (MVA-T7) 34 ile birlikte-enfeksiyon ile trans sağlanır. Şekil 3A, tam uzunluklu antigenomik cDNA 5 kodlayan pNDV-B1 plazmid göstermektedir. Şekil 3B PTM1 plazmidler NP kodlayan gösterir, P ve L ORF. , U kodlayan plazmidler pCITE-GFP,nder T7 promoteri, yeşil floresan proteini (GFP) ve tavuk beta aktin promoteri 35 altında aynı ORF kodlayan pCAGGs GFP 18, kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde, lentojenik NDV soyu Hitchner B1 5 (Şekil 4) yeniden birleştirici NDV cDNA'sından kurtarmak için bir işlemi göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Memeli Hücreleri hazırlanması (Şekil 4A, Gün 1)

Bölünmüş HEp-2 ya da A549 hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde transfeksiyondan bir gün önce. Hücrelerin yoğunluğu ertesi gün% 80-90 ulaşması gerekmektedir. Genellikle, 100 mm tabak birleşik 8 kuyulara (kuyu başına 6 ila 10 x yaklaşık 1 hücreleri) ayrılabilir. Her virüs kurtarılmaya için, 2-4 farklı kuyular dahil edilmelidir, yanı sıra sırasıyla transfeksiyon ve MVA-T7 enfeksiyon verimliliği takip amaçlanmıştır kontrol pCAGGs-GFP ve GFP pCITE-18 için 2 ilave kuyular,,.

2. Bakteriyofaj T7 RNA polimerazı (MVA-T7) ifade Rekombinant Vaccinia Modifiye Ankara Virüsü ile enfeksiyon Memeli Hücrelerinin (Şekil 4A, Gün 2)

  1. 37 ° C'de PBS 1x/BA/PS ve medya ısınmak
  2. PBS 1x/BA/PS 1 ml ile iki kez, hücreler yıkayın.
  3. Bir enfeksiyon çokluğu (en MVA-T7 virüs ile kültürlenen memeli hücreleri, Infect moi: 1) oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS / BA / PS 200 ul'lik bir nihai hacim içinde pfu / hücre.
  4. 3 de tarif edildiği gibi viral enfeksiyon inkübasyon sırasında transfeksiyon karışımı hazırlayın.

3. Memeli Hücreleri transfeksiyonu (Şekil 4A, Gün 2)

  1. Lipofectamine hazırlanması: kurtarma girişimi OptiMEM başına 250 ul LPF2000 1-2 ug karıştırınız ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  2. DNA hazırlanması: OptiMEM 50 ul her bir kurtarma için bir plazmid kokteyl yapın. 0,4 PTM1-NP ug PTM1-P, 0.2 ug, ve tüp başına PTM1-L 0.2 ug ekleyin. Her tüpe kurtarılmaya NDV'nin tam boy cDNA klonu 1 ug ekleyin. Ayrıca iki kontrol transfections, pCAGGs-GFP 2 mikrogram ile birini (transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için) ve (T7 polimeraz MVA-T7 ile ifade tahrik kontrol etmek) pCITE-GFP 2 mikrogram ile diğer hazırlar.
  3. LPF2000-OptiMEM solüsyonu, 5 dakika boyunca (adım 3.1) boyunca önceden kuluçkalanır sonra, ekleme 250DNA tüplere çözeltinin ul (3.2 adım) ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir.
  4. MVA-T7 ile inkübasyondan sonra, aspirasyon ile virüs aşının çıkması ve DNA-LPF2000 transfeksiyon karışımı (adım 3.3) ile değiştirin.
  5. Her yemeğin DMEM% 10 FBS / PS 1 ml ekleyin.
  6. 37 ° C,% 5 CO2 6-8 saat (ya da gece boyunca) için enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin inkübe edin ve daha sonra taze DMEM,% 10 FBS / PS 1.5 ml transfeksiyon ortamı değiştirin.
  7. 24 saat post-transfeksiyon olarak, kontrol kuyuları transfeksiyon verimi (pCAGGs-GFP) ve T7 polimeraz aktivitesi (pCITE-GFP) (Şekil 5A) değerlendirmek için bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir. Aşağıda tarif edildiği gibi kuş fibroblastlar ile enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin ko-kültürü ile devam edin.

4. Avian Hücreler, memeli hücrelerinin ko-kültür (Şekil 4A, Gün 3)

Genellikle, tavuk konfluent 100 mm doku kültürü çanağı (CEFS) or ördek (Defs) embriyoblastlarında iki transfekte kuyularının başına kullanılır. , Önceden, bütün kurtarma girişimleri başına kuş hücreleri yeterince 100 mm doku kültürü yemekleri hazırlamak için emin olun. Virüsün etkin kurtarılması için, DMEM,% 10 FBS / PS ortam alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve% 5 ile takviye edilir. Bu noktada, 24 saat pi, memeli hücreleri nedeniyle MVA-T7 enfeksiyon, Şekil 5A'da asevident için sitopatik etki (CPE) arası başlayabilir.

  1. 37 ° C'ye kadar PBS 1x ve medya ısınmak
  2. 1x PBS içinde 1 ml, 2x, memeli hücrelerini yıkayın.
  3. Bu müstakil kadar EDTA-tripsin 0.2 ml memeli hücrelerini tripsinize edin. DMEM,% 10 FBS / PS 1 ml hücrelerin tekrar,% 5'lik alantoik akışkan, 30 mM MgCI2 ve bir 100 mm doku kültürü çanağı transfer. Aynı medya 3 ml ekleyin.
  4. 1x PBS içinde 4 ml ile iki kez, kuş hücreleri yıkayın.
  5. Hücreleri ayırmak kadar 1 EDTA-tripsin ml ile tripsinize kuş hücreleri, 37 ° C'de 1-2 dakika boyunca inkübe edin. Süspanse inci8 DMEM,% 10 FBS / PS,% 5'lik alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve 8 ml toplam hacim için ko-kültürlenmiştir 100 mm doku kültürü çanağı içinde memeli hücreleri tripsinize edilmiş hücre 4 ml eklemek e hücrelerin ml (4 ml memeli, kuş hücreleri 4 mi).
  6. Yavaşça muntazam bir dağılımının ve daha sonra, 3-4 gün boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde yerleştirmek için, el ile 100 mm tabak içinde ko-kültür hücreleri sallayın. 3 ya da 4 gün memeli ve avian hücrelerinin ortak kültürden sonra yumurta enfekte edilmesi için kriterler (hücre yuvarlama, ölüm, yüzeyden ayrılması, vb.) MVA-T7 viral enfeksiyon gözlenmiştir ne kadar sitopatik etki bağlıdır.

5. Tavuk Embriyone Yumurta Enfeksiyon (Şekil 4A, Gün 6-7)

  1. Memeli ve avian hücrelerinin ko-kültür 3-4 gün sonra, yüzen doku kültürünün 1 ml çıkarın ve bir Eppendorf tüpüne ekleyin.
  2. Bir tezgah içinde 12,000 rpm'de 1 dakika için doku kültürü süpernatantı santrifüjhücresel enkaz kaldırmak için üst santrifüj.
  3. Hava kesesi ve Allantoik boşluğu arasındaki arayüzünü görmek için bir ışık ışıklı denetim kutusunu kullanarak yumurta Mum. Arayüz sınır kan damarı yerelleştirme kaçınarak bir işareti yapmak. Steril koşulları kurmak için fazla yumurta% 70 etanol sprey. Yavaşça işaretli noktada kabuğu bir delik yapmak ve allantoik oyuğuna dikey ve doğrudan iğne amaçlayan, bir insülin (1 mi) şırınga kullanılarak süpernatan 500 ul inokülasyon. (Şekil 4B).
  4. Erimiş mum veya parafin ile yumurta kabuğu içinde nick Seal.
  5. 37 ° C sıcaklıkta 2-3 gün boyunca inkübe yumurta

6. Enfekte Tavuk Embriyone Yumurta dan Alantoyik Fluid (Şekil 4A, Gün 8-10) Hasat

  1. Tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını için 4 ° C'de 2-4 saat veya gece boyunca enfekte edilmiş yumurta inkübe edin.
  2. % 70 etanol (steril koşulların muhafaza edilmesi için) ile yumurta püskürtün.
  3. Dikkatli bir kaşıkla hava boşluğunun üzerindeki yumurtanın apikal bölümüne dokunun. Yumurta kabuğu çatlamış sonra, forseps ile parçaları kaldırmak ve tam Allantoik zarı maruz.
  4. Kan damarlarının zarar görmesini ve yumurta sarısı kaçınarak, forseps ve makas ile Allantoik membran kesilmesiyle Allantoik boşluğuna maruz.
  5. Dikkatlice bir spatula ile embriyo aşağı doğru itin ve 10 ml pipet ile upflowing Allantoik sıvı (yumurta başına 8-12 ml) toplamak. Sarısı zarına zarar kaçının. Buz üzerinde bir 15 ml santrifüj tüpüne (yumurta için bir tüp kullanmak) için alantoik akışkan aktarın.
  6. 1500 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ile, allantoik akışkanın açıklığa kavuşturulacaktır. Pelet bozmadan, yeni bir tüpe transfer süpernatant.
  7. En fazla 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın örnekleri, hemaglütinasyon testi ile NDV nin varlığı için onları kontrol kadar.

7. Hemaglüsinasyon (HA) Deneyi

Allant virüsün varlığıenfekte yumurtadan oik sıvı hindi, kırmızı kan hücrelerini (RBC) hemagglutinate kabiliyetleri ile makroskopik olarak belirlenebilir. NDV nin durumunda, ml başına yaklaşık olarak 10 birim oluşturan 6 plaka (pfu) HA deneyinde pozitif bir sinyal vermek için gereklidir. HA deneyler, V-dipli, 96 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Negatif (PBS 1x, bulaşmamış allantoik sıvı) gibi pozitif (herhangi NDV virüs allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman doğrulamak için herhangi bir HA deneyde dahil edilmelidir. Bir HA deneyi gerçekleştirmek için:

  1. Pipet, bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına PBS 1x 50 ul.
  2. Pipet plakanın birinci sütun üzerindeki kuyu içine alantoik sıvı örneklerinin 50 ul. Plakanın geri kalanı ile 2 kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve son sütunda kuyulardan son, ilave 50 ul atın.
  3. Kuyu başına PBS 1x 0.5% türkiye RBC 50 ul dağıtın. Hafifçe dokunarak plaka sallayın.
  4. 4 ° C (ya da buz) f de inkübeya da 30-45 dakika ya da açık bir topak kadar negatif kontrol kuyuları oluşturulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NDV'nin Kurtarma rutin virüsün tam cDNA erişebilir laboratuarlarda yapılan köklü bir işlemdir. Bununla birlikte, yöntemin içsel stokastik doğası zor% 100 verim elde etmek için kurtarma kılar. Işlemin ilk aşamaları, MVA-T7 ile özel olarak transfeksiyon verimi ve enfeksiyon izlenmesi, olası sorunları. Şekil 5A, standart transfeksiyon ve başarılı bir NDV kurtarma için yeterli transfeksiyon / enfeksiyon verimlilik gösterir belirleme yardımcı olur. Avyan memeli ko-kültür ve embriyolu yumurtalarda amplifikasyon turundan sonra, kurtarılan virüsün varlığı HA tahlilinde pozitif olan kaynaklar tarafından tespit edilir. NDV eritrosit bağlama hemagglutinini neden olur ve bu şekilde de V-şekilli alt bunların çökmesini önler. Bu nedenle, HA aktivitesi eksikliği kolayca RBC bir kırmızı, yuvarlak pelet (Şekil 5B) oluşumu ile ayırt edilebilir. Negatif sonuçlarHA deneyde nedeniyle alantoik akışkan içinde virüs titresi için yetersiz olabilir: yaklaşık 10 6 pfu / ml 'lik bir minimum titre olumlu sonuç HA için gereklidir. Alt viral titresi yine de spesifik anti NDV antikorlar kullanılarak imüno-flüoresan deneyi (İFA) ile tespit edilebilir. İlk aşılanmış yumurta içinde mevcut olan virüs daha fazla yükseltilmesi için yumurta yeni bir geçit, bu durumda tavsiye edilir.

Şekil 1
Şekil 1. Newcastle hastalığı virüsü (NDV) genom organizasyonu NDV segmentli olmayan, tek iplikli negatif sens RNA genomu (nt) uzun 15186 nükleotidleri, ve altı transkripsiyon birimlerinde sekiz farklı polipeptidleri kodlayan:. NP, P, M, F, HN ve L ve V ve W proteinler, transkripsiyon esnasında P ORF bölgesinin okuma çerçevesi kaymalar sonra ortaya çıkmıştır. Kodlayıcı olmayan, yan yüzey düzenleyici dizilerin genom onun 3 '(lider) ve 5' (römork) sona erer. Bundan başka genler arası gen uca (GE), (IG) kodlayıcı olmayan bir gen ve start (GS) sekanslar, farklı ORF'ler arasında viral polimeraz aktivitesini düzenler. Viral genom üzerinde farklı genlerin ekspresyon seviyeleri, yaşam döngüsü 1 'etkili bir virüs için kritik bir gradyan oluşturma (örneğin NP transkript L, en az transkript en bol) sonunda 3' ile göreli konumu bakımından bağlıdır.

Şekil 2,
Şekil 2. Klonlanmış DNA'dan NDV kurtarma. Doğal, (A) ile şematik karşılaştırması ve kurtarma işlemi sırasında yapay kaynaklı (B) döngüsü temeli. (A) hedef hücreye bağlama sonra, virüs kapsül içine sitoplazma içine genomik içeriğini serbest bırakır RNP içinde. RNA polimeraz viral proteinlerin ve olgunlaşmamış viryonlar içine dahil edilecek olan orijinal genomunun birden çok kopya üretimi için bir şablon olan tamamlayıcı bir tam uzunluklu antigenomik RNA kopya +, içine, farklı mRNA içine RNA genomu transkripsiyonunu yapar. (B ) kurtarma işlemi sırasında, RNP (NP, P ve L proteinleri, hem de tam uzunluktaki, genellikle modifiye antigenomik RNA) 'in bileşenleri, cDNA transfeksiyonu ile sağlanmaktadır. Transfekte hücre sitoplazmasında antigenomik RNP yeniden oluşturulması üzerine, bu tamamlayıcı, yeniden birleştirici genomik RNP üretebilen ve bir bütün döngü sonra rekombinant virüslerin serbest bırakılması ile biten, yeniden başlayabilir.

Şekil 3,
Şekil 3,. Rekombinant NDV'nin jenere edilmesi için sentezleme plasmidleri T7 odaklı. (A) Tam boy viral cDNA: ThT7 promoteri (P T7) ve Hepatit Delta ribozim (HDR) bölünme ihtiva T7 terminatör sekansı (T T7) altında lentojenik NDV soyu Hitchner B1 antigenome ifadesini tahrik e tam uzunlukta pNDV-B1 ampisilin direnç plazmid. PNDV-B1 başlangıçta P ve M genleri arasında 5 yabancı ekler taşımak için tasarlanmıştır. Yeni gen (Xbal sitesi) yerleştirilmesi viral polimeraz ile işlevsel tanıma izin vermek için regülatör gen ucunda (GE) ilavesini, intergenik (IG) ve gen bir başlangıç ​​(GS) dizileri gerektirmektedir. Transgenin ekspresyonu verim 32 kodonunun üst akışında bir Kozak başlangıç ​​(K) dizisinin eklenmesi ile geliştirilebilir. NDV cDNA sokulan bütün kaseti en paramyxovius Genomların verimli çoğaltma sürücüler 33 "altı üstünlüğünü" takip altıya bölünebilir nükleotidlerin toplam numarası olması gerekir (B) Protein ifade plazmid:. Viral NP, P ve çevrili L AOA'ları,T7 promoteri (P T7), encephalomyocarditis virüsü (EMC) ve UTR ve T7 terminatörü (T T7) ile sekansları PTM1 omurga ampisilin direnç 5,36 vektörüne klonlanmıştır.

Şekil 4,
Şekil 4. Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü üretimi için plazmid tabanlı bir karşıt genetik teknikleri. (A) Viral kurtarma: A549 ve HEp-2 hücreleri, modifiye edilmiş vaccinia virüsü Ankara Bakteriyofaj T7 polimeraz (MVA-T7) ifade ile enfekte edilir. Viral enfeksiyondan sonra, hücreler, T7 promotörü altında, bir arada tam boy bir NDV cDNA ile, NDV viral genom (NP, P ve L) replikasyon ve transkripsiyon için gerekli olan sentezleme plazmid ile ko-transfekte edilir. Yirmi dört saat post-infection/transfection, memeli hücreleri (CEF tavuk veya ördek embriyo fibroblast ile birlikte kültürlendi veDEF, sırasıyla). Ko-kültür, 8-10 günlük civciv embriyo yumurta daha fazla yükseltilmesi için ko-kültür hücreleri, doku kültür süpernatanları ile aşılanır Üç ila dört gün sonra. İki ya da üç gün 37 ° C'de, 8-10 günlük eski yumurta inkübasyondan sonra, yumurtadan alantoik akışkan HA tahlili ile rekombinant virüsün başarılı kurtarılması için hasat edilir ve analiz edilir. Pozitif (+) kurtarma virüsler ayrıca genomik (RT-PCR) ile karakterize edilen ve protein (örneğin imüno-deney, (İFA) ve Western Blot (WB) seviyeleri negatif (-). HA sonuçlar, olacak kadar virüslerin eksikliği olabilir, . virüsü büyütmek için taze tavuk embriyolu yumurtaların tekrar enfeksiyon HA ile tespit belirtilir tavuk embriyolu yumurtaların (B) Enfeksiyon:. 8-10 tavuk embriyo yumurta hava kesesi ve allantoik oyuğuna arasındaki arayüzü işaretlemek için mumlu olan bir insülin ile. (1 mi) şırınga, yumurta alantoik Cavi içindeki doku kültürü yüzer bulaştırılırty gösterildiği gibi,.

Şekil 5,
Şekil 5,. Örnek sonuçlanır. (A) transfeksiyonu ve MVA-T7 enfeksiyon verimi: Örnek floresan (sol) ve pCAGGS-GFP (üstte) ile transfekte edilmiş ya da MVA-T7 ile enfekte edilmiş ve pCITE-GFP (alt) ile transfekte edilmiş A549 hücrelerinin parlak (sağ) alanları gösterilmiştir . PCAGGS tarafından tahrik bünye GFP ifade T7 promoter pCITE ile GFP ekspresyonunu tahrik ise MVA-T7 enfeksiyon ve T7 polimeraz aktivitesi için bir kontrol olan, transfeksiyon verimliliği bir göstergesidir. Alantoik akışkan içinde viral partiküllerin bulunması hemaglutinasyonu neden, iyi şekilli bir V alt pelet eksikliği ile gösterilir: Hücreler 24 saat post-transfection/post-infection (B) Hemaglutinasyon analizi (HA) ile görüntülendi. Virüs olmaması sağlar: th alt kırmızı bir topak oluşumue iyi. Şekil hem gösteren herhangi HA tayini için gerekli kontroller (negatif, temiz allantoik akışkan; olumlu, zaten karakterize NDV numune), ve pozitif iki (+) ile bir kurtarma sonra elde edilen üç bilinmeyen numunelerin sonuçları ve bir negatif (-) Sonuç.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Çeşitli faktörler NDV tahlisiye sırasında iyi sonuçlar elde etmek için kabul edilmelidir. İlk olarak, kullanılacak olan tam uzunluktaki bir cDNA konstruktu NDV genomuna yeni transgenler / modifikasyonlarının işlevsel dahil edilmesini sağlamak için tasarlanmış olması gerekmektedir. (Ii) herhangi bir varsayımsal GE GS sekansları, dış içine vardır, yukarıda belirtildiği gibi, bu (i) Uygun bir gen ucu (GE), intergenik (IG) ve gen start (GS) dizileri gerekirse ilave edilmesi olduğu, anlamına gelir, geni, ve (iii) tam rekombinant genom "altı kuralı" izler.

Kurtarma işlemi için olduğu gibi, plasmid preparatları kalitesi, MVA-T7 hisse senetleri gibi hücrelerin uygun bakım kritiktir. Transgenlerin boyutuna ya da doğası nedeniyle zor klonlama ve kurtarma süreçleri, CsCI yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme yoluyla DNA saflaştırılması iyileştirilebilir rağmen vakaların çoğu için, plazmid DNA standart maxiprep saflaştırılması, yeterlidir. Li kullanılarak transfeksiyon verimliliğiörneğin Nucleofection gibi diğer transfeksiyon yöntemleri de kullanılabilir olsa pofectamine, başarılı bir kurtarma için genellikle yeterlidir. Her durumda, farklı plazmitlerin oranının katı (sırasıyla, NP-PL-pNDV için 0.4:0.2:0.2:1) muhafaza edilmesi gerekmektedir. Nedeniyle kurtarma işleminin zahmetli ve bir şekilde stokastik doğası gereği, en azından 2-4 farklı kuyu kurtarılmaya yapı başına transfekte edilebilir olmalı ve aynı yapı farklı klonlar test edilmelidir.

Burada tarif edildiği olan protokol, trans viral cDNA konstruktların sentezlenmesi için gerekli olan T7 polimerazı temin etmek üzere MVA-T7 kullanın. Bu laboratuvarda standart prosedür iken, bu mümkün olan tek bir yaklaşım değildir. Örneğin, diğer grupların yapısal olarak başarılı bir şekilde T7 polimeraz 4,37 yüksek seviyelerde ifade eden hücre dizileri kullanılarak NDV ve segmentli olmayan, negatif dallı RNA virüsleri kurtarıldı var. Rekombinant bir vektör kullanılabilirliğiNDV için kurtarma sistemi yeniden kurulurken ya da hücre hattı kodlayan T7 polimeraz, hem de belirli bir laboratuar ya yaklaşımın belirli performans, dikkate alınmalıdır.

HA ile alantoik akışkan içinde NDV varlığı belirlendikten sonra, bundan başka çalışmalar tam olarak viral genom sekanslama ve ardından örneğin RT-PCR gibi yeni kurtarılan virüs, karakterize etmek için gerçekleştirilmelidir, IFA ve Western-blotting (WB) ekspresyonunu belirlemek için yabancı genin (varsa). Rekombinant virüs taşıyan modifikasyonların niteliğine bağlı olarak, biyokimyasal ve fonksiyonel deneylerde diğer tür de gerekli olabilir.

CDNA'dan rekombinant NDV'nin kurtarma birçok nedenle yararlı bir tekniktir. İlk ve en belirgin, bu teknik, deneysel olarak da genleri ve düzenleyici sekanslarının değiştirilmesi ile NDV, kuş endüstrisi için ekonomik olarak uygun bir virüs, biyolojisini analiz yeteneği sağlar. NDV yakın insan kızamık, kabakulak veya solunum sinsitiyal virüs gibi patojenlerin yanı sıra belirmiş, yüksek patojenik Hendra ve Nipah virüslerle ilgili Paramyxovirus, virüslerin bu ailenin temel yaşam döngüsü üzerinde araştırma kendi biyolojisini anlamak için önemlidir. Temel araştırma ötesinde, yeniden birleştirici NDVs iyi olarak değerlendirilen biyo-güvenlik profili ile, genomları içinde yabancı genleri taşıyan olasılığını birleştirerek, aşı ve onkolitik vectos olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Tüm bu nedenlerle için, NDV kurtarma protokolü virüs araştırma, aşı geliştirme ve kanser tedavisi ile ilgilenen dünya çapında birçok laboratuvarlar için değerli bir varlık olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Adolfo García-Sastre Mount Sinai Tıp Okulu Icahn aittir rekombinant Newcastle hastalığı virüsleri üzerinde patent bir mucit.

Acknowledgments

Yazarlar Dr laboratuvarlarında geçmiş ve bugünkü üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Peter Palese ve NDVnin gelişimi için Adolfo García-Sastre genetik teknikleri ve teknik yardım için ters. NiaD R01AI088770 hibe ve Mükemmeliyet İç Güvenlik Bilim ve Teknoloji Merkezi Bölümü tarafından tarafından AG-S laboratuvarda Newcastle hastalığı virüsü Araştırma kısmen finanse Gelişen ve Zoonotik Hayvan Hastalıkları (CEEZAD, ödül sayısı 2010-ST-061-AG001). LM-S Araştırma laboratuvarında NIH hibe RO1'e AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetleme (HHSN266200700008C) Mükemmeliyet NIAID Merkezleri ve biyosavunma Bağışıklık Modelleme için Rochester Merkezi Üniversitesi (HHSN272201000055C) tarafından finanse edilmektedir .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80, (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).
CDNA'dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter