Den optokinetiske Response som et kvantitativt mål for synsskarphet i sebrafisk

Summary

Sebrafisk har vært et verdifullt verktøy for mange forskningsområder. Her viser vi en metode for å lokke fram en visuell respons og beregne en funksjonell synsskarphet i den voksne sebrafisk.

Abstract

Sebrafisk er en velprøvd modell for synsforskning, men mange av de tidligere metoder generelt fokusert på larve fisk eller demonstrert en enkel respons. Mer nylig voksen visuell atferd i sebrafisk er blitt av interesse, men metoder for å måle konkrete tiltak er nye som kommer. For å møte dette gapet, setter vi ut for å utvikle en metode for å gjentatte ganger og nøyaktig utnytte den optokinetiske respons (okr) for å måle synsskarphet i voksen sebrafisk. Her viser vi at den voksne sebrafisk synsskarphet kan måles, inkludert både kikkerter og monokular acuities. På grunn av at fisken ikke blir skadet under prosedyren, kan den synsskarphet måles og sammenlignes over kortere eller lengre perioder. Visus målinger beskrevet her kan også gjøres raskt slik at for høy gjennomstrømming og for ytterligere visuelle prosedyrer hvis ønskelig. Denne typen analyse er som bidrar til narkotika intervensjonsstudier eller undersøkelser av sykdomsprogresjon.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) er en god modell for å studere visuell fysiologi på grunn av likheten med deres netthinnen til andre virveldyr, deres kort livssyklus, og tilgjengeligheten av genetisk endrede mutanter ^1,2. Den optokinetiske refleks / respons / nystagmus (okr) er en kombinasjon av glatt jakten og raske saccade øyebevegelser. For mer enn 60 år klinikere har vist at okr kan brukes for en objektiv måling av synsskarphet hos pasienter, og er spesielt nyttig til å bestemme tilleggs visuelle egenskapene ^3-5. Den første registrerte bruken av okr hos dyr var med duer i 1950 ^6. Mer nylig har det okr blitt et verdifullt verktøy for vurdering av visuell funksjon i larvesebrafisk, og er ofte brukt til å screene for genetiske mutanter som har en synshemming ^1,2. Mens okr har vært mye brukt for å bestemme visuell funksjon i larvesebrafisk, har det nylig blitt demonstrert i voksen sebrafiske ^7-10. En fersk artikkel av Tappeiner et al. Bruker en kommersielt tilgjengelig optomotor system tradisjonelt brukt for mus, OptoMotry, for å demonstrere at synsskarphet av den voksne sebrafisk er fortsatt ganske konstant, ~ 0,59 sykluser per grad (CPD), også på tvers av forskjellige vinkelhastigheter ⁷ .

Selv om okr har vist seg å være ganske nyttig i larvesebrafisk studier, har andre metoder for visuell atferd blitt brukt i sebrafisk voksne med varierende grad av suksess. Flukten respons analysen viste at albino og rubin sebrafisk, både pigmentering mutanter, har redusert syns responser i skarpe lysforhold ^11,12. Denne samme flukt respons analysen har også lykkes med å identifisere nattblindhet d mutanter, om enn på to år ^13. Men, er flukten respons analysen ikke uten feil. Det er vanskelig å tillegge en eksakt synsfunksjon og er bare en grov approximation av visuelle endringer - som betyr at det tar en stor forandring før endringen blir identifisert.

En annen metode som er utviklet for å identifisere voksen sebrafisk med synshemming er optomotor respons (OMR) ^11. I denne analysen, blir fisken plassert i en sirkulær tank med et ugjennomsiktig spalte i midten. Svarte og hvite striper rotere rundt tanken og fisken har som oppgave å svømme i retning av stripe bevegelse. Som flukten respons, fokuserer OMR på visuomotor egenskapene til den voksne sebrafisk. Det har imidlertid vært brukt med hell for å identifisere fisk med synshemming, slik som lrp2/bugeye mutanter ^14. De lrp2/bugeye sebrafisk utstillingen buphthalmos, forhøyet intraokulært trykk, redusert OMR, og progressiv retinal degenerasjon ^14,15.

Mange studier har brukt visuomotor evner i voksen sebrafisk, som ofte er subjektive og kan ikke være Quantitatively analysert. Som bruker okr, kan man studere synsskarphet på voksen fisk mer objektivt. Vi har bygget vår egen okr enhet, modellert etter en opprinnelig brukt for larvestudier ^en. I denne studien viser vi at okr kan brukes til å beregne både monokulær og binokulær synsskarphet på sebrafisk.

Protocol

Alle husdyrhold og eksperimenter skal være godkjent og gjennomført i henhold til retningslinjer fastsatt av Institutional Animal Care og bruk komité den respektive institusjon eller andre juridiske krav.

En. Sebrafisk Care

1. Oppretthold sebrafisk under standardbetingelser ved 28,5 ° C på en 10 timers mørk-14 timers lys syklus ^16.
2. Hold voksen sebrafisk på en tank tetthet på ca 3 fisk / L.

2. Optokinetiske respons (okr)

1. Bygg skikken okr opptaksenhet ved hjelp av en 14,5 cm diameter roterende trommel, en stereo mikroskop med justerbar lysintensitet (300-8,000 lux) og en datamaskin (Figur 1a).
   1. Fest et kamera til mikroskop som vil gi en live feed på en tilstøtende skjerm og mulighet for fotografering og opptak.
   2. Styr roterende trommel ved hjelp av en mikrokontroller koblet til en datamaskin som vil Accommodato ulike hastighet og retning valg.
2. Anesthetize fisken i 0.016% Tricaine i 2-3 min og deretter legg fisken på en liten plattform med øyne og gjeller suspendert over kanten.
3. Plasser en tynn svamp / håndkle over kroppen av fisk og pin 2-3 stykker av skum, formet til å ta imot fisken, over fisken til å holde den immobiliserte. Å begrense bevegelsen av halen av fisken ble funnet å være et viktig aspekt for immobilisering uten å forårsake skade på fisken, og er best oppnås ved hjelp av et flatt stykke av skum. (Figur 1b)
4. Plasser fisk innenfor en sylindrisk vannfylt tank, som passer inne i den roterende trommelen i okr opptaksenhet. Bruk magneter på plattformen for å plassere fisken oppreist, med øynene ca 7,3 cm fra kanten av trommelen. Fisken bør gjenopplive fra anestesi i løpet av få minutter - normal pust vil gjenoppta og tilfeldige øyebevegelser bør følges.
5. Plasser en base rist på 0,07 sykluser per grad (CPD) inn i roterende trommel og engasjere datamaskinen kontrollene til å begynne rotasjonen og videoopptak (en hastighet på 12 rpm ble brukt for dette papiret, men hastigheter på 8-16 rpm skal gi tilsvarende resultater).
6. Når en innledende okr er fremkalt ved basen grating, stoppe rotasjonen kort, og erstatte rist med en mindre rist (høyere romlig frekvens).
7. Gjenta denne prosessen til en okr kan ikke lenger fremkalte. Retest med den minste rist som forårsaket en okr etter en modifisert trapp tilnærming og deretter gjenta bruker rist som ikke klarte å lokke fram en respons for å bekrefte tap av okr. Denne prosessen kan gjentas for å kontrollere en sann reaksjon på den minste påvisbare gitter hvis den endelige gitter endret i forhold til den første utryddelse event.
8. Skaffe monokulære skarphet målinger ved å plassere en svart plastlukker over striper ved siden av det motsatte øyet. Gjenta prosedyren ovenfor (trinn 02.06 til 02.07).
9. Skaff visus på det motsatte øyet ved å flytte på occluder og gjenta trinn 02.06 til 02.07 igjen.
10. Merk avstanden hvert øye er fra de striper i løpet av testprosedyren ved å bruke referansemåle stripen under fisken tank slik at nøyaktige skarphet tiltak kan beregnes på følgende trinn.

Tre. Beregning av synsskarphet

1. Skaff synsskarphet ved å beregne CPD: hvor a er avstanden fra sentrum av linsen til gitteret, og h er lengden av en periode av det minste gitter ved hvilken okr ble observert (figur 1c).
2. For kombinerte synsskarphet målinger, den i gjennomsnitt en-verdi fra både venstre og høyre øye brukes.

Representative Results

Okr Device Funksjonalitet

Den okr-enheten slik det er forklart ovenfor og vist i figur 1 funksjoner med et minimum av vedlikehold. Som nevnt i punkt 2.3, immobilisering halen er avgjørende for å holde fisken behersket under innspillingen. Tilstrekkelig immobilisert, kan fisken holdes i okr enhet for lengre perioder av gangen. Derfor bør man være forsiktig under de innledende immobilisering trinnene, slik at flere data kan samles inn for hver enkelt fisk.

Synsskarphet målinger

Kikkerten okr er lett fremkalte i normal voksen fisk. Ved å følge fremgangsmåten ovenfor kan man finne visuelle acuities for sebrafisk av mange aldersgrupper (Figur 2). Den beste kikkerten romlig skarphet vi registrerte var 0,74 CPD. Som det fremgår av figur 2, at kikkerten skarphet generelt øker med alderen (n = 46, p = 0,002 ANOVA ved hjelp av SPSS v14), men flater utetter ca 12 måneders alder. Når vi sammenlignet den målte synsskarphet i fem måneder gamle vill type fisk til alder-matchet lrp2/bugeye fisk, fant vi at lrp2/bugeye fisk hadde betydelig redusert visus (p <0,001; villtype: 0.49 ± 0.05 CPD, n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; Student T-test med Excel).

Ved okkludering av det høyre øye synsstyrken for det venstre øyet kan bestemmes, og vice versa. Når sammenlignet med binokulært skarphet, er binokulær summering observert på samme måte som det menneskelige øye ¹⁷ (fig. 3). Kikkerten skarphet var generelt 5-10% bedre enn både høyre (OD) eller venstre (OS) acuities målt uavhengig. For noen enkelt fisk forskjellen var en 25% forbedring.

Figur 1. Okr Recording. A) okr Enheten består av en 14,5 cm diameter roterende trommel og mikroskop med justerbar lysintensitet innstillinger (300-8,000 lux). Et kamera gir en live feed på en tilstøtende skjerm. Den roterende trommelen har ulike hastigheter i både med og mot klokken retninger og utskiftbare romlige frekvens rister settes inn og fjernes etter behov. B) Fisk er sikret og plassert i sentrum av den roterende trommelen. C) sykluser per grad (CPD) er beregnet hjelp CPD = Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Synsskarphet forandrer seg med alderen. Grafen viser uavhengige visuelle acuities målt 5 - 15 måneder i alder. Den synsskarphet øker vanligvis i løpet av første året av utvikling og haler litt på 15 måneders alder (p = 0.002 ANOVA bruker SPSS v14) da. Hvert punkt kan enten representere en eller flere fisk. Synsskarphet er målt i sykluser / grad (CPD). (N = 46 totalt, 8 på 5 måneder, fire på seks måneder, syv på åtte måneder, seks til ni måneder, 11 på 10 måneder, to på 11 måneder, to på 12 måneder, og seks på 15 måneder). Klikk her å se større bilde .

Figur 3. Binocular synsskarphet summering effekt. Kikkerten (OU) synsskarphet er generelt høyere i forhold til høyre (OD) eller venstre (OS) øye acuities. I denne spesielle gruppe OS acuities var vesentlig lavere. (* P = 0,006, n = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Noen ganger kan fisken flykte inn i vanntanken. Det er viktig å immobilisere halen. I tillegg til bruken av et tynt svamp / håndkle over fiskens kropp ble også funnet å være uvurderlig for å holde fisken opphengt i lengre perioder av gangen. Vi var i stand til å holde fisken immobilisert for mer enn 30 minutter ved hjelp av denne fremgangsmåten uten å skade fisken. Denne mengden er mer enn tilstrekkelig til å gjøre kikkerten og begge monokulære acuities.

Presentasjonen av gitteret kan enten være utført slik det er beskrevet her og andre steder ved hjelp av et fysisk roterende trommel eller ved å presentere et digitalt display ^18-22. Begge typer har spesielle fordeler og ulemper. Vi valgte å bruke den fysiske rotasjon både av kostnadsmessige hensyn og tekniske spesifikasjoner. Eksklusive datamaskinen og bildeutstyr, kan det okr enheten som er beskrevet her bygges for rundt 150 dollar.

Den okr er en objektiv måte å avgjøre visUAL skarphet i voksen sebrafisk. Mens flere andre visuomotor analyser for visjonen har blitt brukt i tidligere forsøk, og selv elektroretinogrammet har blitt gjort hos voksne sebrafisk øyne, selv om det ikke har vært tungt utnyttet, åpner den voksne sebrafisk okr døren for mange nye eksperimentelle forhold ^22. Denne studien har vist okr nytte i å måle synsskarphet endringer over tid, identifisere synsskarphet forskjell i øyet sykdom modeller, og ved fastsettelse monocular synsskarphet.

Interessant, når sammenlignet med det menneskelige øye (20/20) er voksne sebrafisk syn omtrent 20/1 000 (ved 0,60 cpd omdannes til -0,3 logMAR). Selv om dette kan virke dårlig, er de sebrafisk øyne svært godt egnet for sitt miljø. Til tross for den visuelle oppgaven med å se gjennom 6,5 cm vann, noen få millimeter av polykarbonat, og en annen centimeter av luft, fisken utføre ganske godt! Vi fant ut at den voksne sebrafisk skarphet er aboUT 70% av hva som ville bli spådd gitt sin fotoreseptor mellomrom. ²³ Kontrast at med optimal menneskelig ytelse ~ 20/12, som er ca 80% av den anslåtte 20/10, og okr teknikk for måling av synsevne i voksen sebrafisk er imponerende ^{24 , 25.}

Teknikken med måling av uavhengige øye visuelle skarphet ville tillate for studier der det ene øyet kan bli behandlet, og den andre benyttes som en kontroll. I tillegg kan fisken med asymmetrisk øye utvikling som lrp2/bugeye eller fisk som utvikler cataract kontrolleres mer nøyaktig. Det skal bemerkes at forsiktighet må utvises for å måle avstanden fra øyet til stripene, og for å avstenge hele synsfeltet. Denne teknikken bør åpne døren til mer nøyaktige og konkrete tiltak av sebrafisk visuell funksjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Super Low Light Black White Video Security Camera	Super Circuits	PC164CEX-2	Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller	Adafruit Industries		The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate	VWR	101107-950