Summary
ショウジョウバエ S2細胞および培養されたニューロンは、インビボでの電動オルガネラ輸送のイメージングのための優れたシステムである。ここでは、両方の細胞型、それらの画像化および輸送の分析を培養するための詳細なプロトコルを記載している。
Abstract
ショウジョウバエ S2細胞は一様に分極微小管で満たされた任意のアクチン脱重合薬物形の長い分岐していないプロセスの存在下でカバーガラス上にプレー。細胞小器官は、微小管モーターによって、これらのプロセスに沿って移動する。メンテナンスが容易、安定な細胞株を作成するためのRNAiを介したタンパク質ノックダウンと効率的な手順に対する高い感受性は、ショウジョウバエ S2細胞のライブイメージングによる貨物輸送を研究するための理想的なモデルシステムを作る。解離したショウジョウバエ胚由来の初代培養ニューロンにおける軸索輸送：S2細胞で得られた結果は、さらにより生理学的に関連するシステムに適用することができる。培養されたニューロンは、S2のプロセスに非常によく似てバンドルされた微小管を充填し、長い神経突起を成長させる。 S2細胞中と同様に、培養神経細胞における細胞小器官は、初期胚に注入またはトランスジーンのいずれかで発現オルガネラ特異的蛍光色素によって、またはDNAによってコードされる細胞小器官の蛍光マーカーを用いて可視化することができるICハエ。従って、細胞小器官輸送が容易に生体イメージングを用いてガラスカバースリップ上で培養ニューロンにおいて記録することができる。ここでは、 ショウジョウバエ S2細胞および一次ニューロンで貨物輸送を培養し、可視化するための手順について説明します。私たちは、これらのプロトコルは、貨物輸送を研究するラボ用両方のシステムにアクセスできるようにと考えています。
Introduction
ショウジョウバエ S2細胞は多くの細胞プロセスを研究するための人気の高まりを得ています。これらの細胞は、もともとOregonR キイロショウジョウバエのトリプシン処理し、後期胚から得られ、1。 ショウジョウバエ S2細胞は他の細胞株に比べて多くの利点を提供するマクロファージ様な機能を維持した。それらは、CO 2なしで25℃で培養し、加熱またはガス交換を必要とせず、室温で長時間撮像することができる。より重要なことには、 ショウジョウバエ S2細胞は、目的のタンパク質の高効率ノックダウンを可能にするRNAi処理に非常に敏感である。 S2細胞は、高度にトランスフェクトされ、安定な細胞株は、目的のタンパク質の安定な異所性発現を可能にするために4週間未満に選択することができる。 S2細胞は、通常はどちらかに成長緩く付着したが、フラスコにまたは懸濁液中に広がっていない。それらは、植物レクチンコンカでプレコートしたカバースリップ上に広げるように誘導することができるnavalin A（ConAを）。スプレッド細胞の周囲は特に薄く、したがって、生細胞顕微鏡検査に最適です。 S2細胞培養のための詳細なプロトコルは、RNAi処理、生光イメージングおよび免疫染色は文献2,3に記載されています。私たちの研究室では、微小管ベースの貨物輸送を研究するためのモデル系としてS2細胞を採用しています。このようなサイトカラシンD（CytoD）として、F-アクチンの脱重合または切断する任意の薬物で処理されたショウジョウバエ S2細胞は、一様に分極微小管4で満たされた長い突起を成長さその微小管の配列に沿って貨物の動きを研究する理想的なシステムにする-10、。これらのプロセスにおける輸送の異なるパラメータ（。 すなわち軌道の長さ、速度、方向など ） を容易に自動化された粒子追跡ソフトウェアを、DiaTrack（Semasopht用いて測定することができます。http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423;博士。パスカルロットン：http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx＃A4）。これらのプロパティは、S2細胞を組織培養細胞内の微小管に沿って貨物輸送を研究するための魅力的なシステムを作る。
S2細胞におけるパイロット実験は、 ショウジョウバエ一次ニューロンにおける貨物輸送研究の生理学的に重要なモデルに拡張することができる。 S2細胞と同様に、解離した胚から培養されたニューロンは、染料及び阻害剤のような小分子に対して透過性であり、細胞小器官輸送の高解像度のライブイメージングは、室温でのニューロンで行うことができる。異なる遺伝的背景を持つショウジョウバエを使って、我々はノックアウト（遺伝子の機能喪失変異が）によって一次ニューロンにおける遺伝子機能を調べることができ、ノックダウン（dsRNAを注入または式）または異所性発現（トランスジェニックハエ）。代わりに、彼らはより速く成長し、したがって、私たちは、微小管dependeを学ぶことができ、具体的には、CytoD処理を用いてアクチンフィラメントの断片化は、神経突起伸長を防ぐことはできませんアクチンフィラメント11の影響を受けずにCytoD処理したニューロンでの輸送をオルガネラNT。そのため、一次ニューロン培養は、生理学的に関連するシステム10,12に貨物輸送を研究するのに最適なシステムになり、これを組織培養細胞の利点を組み合わせると遺伝学を飛ぶ。いくつかの家族性の神経変性疾患は、に起因する、または貨物輸送の欠陥（ 例えば 、パーキンソン病13と関連付けることができたので、ハンチントン病14、アルツハイマー病15,16、筋萎縮性側索硬化症/ ALS 17、HMN7Bとペリー症候群18,19、および脊髄小脳失調タイプ5/SCA5 20）、初代神経培養は、微小管依存性輸送にこれらの疾患の原因となる特定の変異の効果の分析に役立ちます。
最後に、微小管依存性輸送の重要な特性はよく、哺乳類やハエの間で保存されているが、
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Protocol
1。 ショウジョウバエ S2細胞
ConAをコートしたカバーガラスの作製
- セラミックラックにカバースリップを置き、1時間クロム酸浸漬することによって、それらを洗ってください。 [注意：クロム酸は腐食性があり、目の刺激、鼻、喉、皮膚を引き起こす可能性があります]。
- 酸が完全に洗い流されるまで、常に30分間のdH 2 Oを実行して徹底的にカバーグラスを洗浄します。
- 30分間（DH 2 O中0.5 mg / mlの溶液）カバーガラスを空気乾燥したConAでコーティングしてみましょう。
- 15分間のdH 2 Oでカバーグラスをすすぎ、それらを空気乾燥してみましょう。 ConAをコートしたカバーガラスは、1ヶ月まで保存することができます。
細胞をプレーティング
- S2細胞が指数関数的に実験に必要な細胞の数に応じて、T25やT75のCM 2フラスコで増殖させる。
- 血球計数器を用いて細胞密度を計数する。追加の1ml増殖mをConAを被覆カバーガラスで35mmの組織培養皿にedium（例えば昆虫·エクスプレス）、ゆっくり皿に〜1×10 5個の細胞を移す。異なるセルからの処理が重ならないため、この細胞密度は、イメージングのために最適である。
- すぐに（2.5μMCytoDの最終濃度まで）皿に5μMCytoDと1ミリリットルの媒体を追加めっき後、プロセスの形成を誘導するために。イメージングの前に25℃で少なくとも2時間、細胞をインキュベートすることによって、プロセスの完全な開発を可能にする。
2。 ショウジョウバエ初代ニューロン培養
神経細胞培養のための準備
- ショウジョウバエ神経細胞増殖培地（：; 5μg/ mlのインスリン; 100μg/ mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10μg/ mlのテトラサイクリン30分55ºCで不活性化し20％ウシ胎児血清、熱を補足したシュナイダー培地）を準備。このSUPplementedシュナイダーの培地は、6ヶ月間4℃で保存することができる。
- ショウジョウバエの胚（22.5グラム寒天、2リットルのフラスコ中の12.0グラムのスクロースと750ミリリットルのH 2 Oを収集するためのバイアル寒天リンゴジュースを準備し、20〜25分間のオートクレーブ、250ミリリットルのリンゴジュースを追加し、各ショウジョウバエに〜10ミリリットルを注ぐバイアル;）凝固後、コットンボールとのバイアルを接続し、食品の乾燥をオーバーを避けるためにプラスチック製の食品ラップでバイアルを包む。寒天バイアル中のりんごジュースは、4週間のためによく密封されたビニール袋に4℃で保存することができます。
- ConAを持つコート酸洗浄25ミリメートルの円形カバースリップ（ ショウジョウバエ S2細胞のプロトコルで詳細を参照）、10〜15分間、UV光の下でそれらを殺菌する。これらのカバーガラスをヶ月間保存することができる。
ショウジョウバエの胚性ニューロンの文化
- キープヤングアダルト胚Fを収集する前に1〜2日間乾燥酵母を補足したリンゴジュース寒天バイアルに飛ぶ又はニューロン製剤。
- 収集日に、収集された胚を同期させるために、転送大人光の中で1時間のprecollection新鮮なリンゴジュース寒天バイアルへ飛行し、これらの胚を破棄。
- 転送は、1時間の胚を収集し、胚の収率を高めるために暗闇の中で両方、さらに1時間、別のバイアルにハエを転送し、新しいリンゴジュース寒天バイアルに飛ぶ。
- リンゴジュース寒天バイアルから大人のハエを削除し、胚は、室温（4-6 HR-齢の胚がステージ9月11日の間にある）で段階的に別の4時間9月11日を開発してみましょう。
- バイアルに水を噴出し、小さな絵筆（少なくとも10胚が一つの良いニューロン準備のために必要とされる）とリンゴジュース寒天から胚を緩めて胚を削除します。
- 水を排水するための移送ピペットを用いて100μmのナイロンメッシュセルストレーナーに胚を移し（ ショウジョウバエ胚洗浄緩衝液、0.4％のNaCl、0.03％トリトンにおけるトランスファーピペットを前すすぎX-100）。
- 小さ な絵筆を使ってストレーナから胚を収集し、1ミリリットルショウジョウバエ胚ウォッシュ（注：ペイントブラシまたはピペットチップを使用して、任意の寒天又は綿繊維をきれい）で満たされた1.5ミリリットルマイクロチューブにそれらを転送します。このプロトコルでは、1.5ミリリットルマイクロチューブは、一致使い捨てペレット乳棒が付属しています。
- ショウジョウバエ胚ウォッシュ3Xで胚を洗浄します。
- 10分間、新鮮な1時01市販の漂白剤の溶液および95％エタノールで胚をDechorionate [注意：漂白剤は刺激、目、鼻、喉、皮膚を引き起こす可能性があります]。
- 組織培養フードに移動し、2X補足シュナイダーの培地中で胚を洗浄します。
- 胚をチューブ内に200〜300μlの培地のままにして、ゆっくりと機械的に（10-15Xを挽く）、70％エタノールで滅菌されたキンブルチェース使い捨てペレット乳棒を使用して絨毛膜を除去した胚を解離する。
- 2分、TRAのために20×gで均質化された混合物を遠心分離新しいチューブに上清をnsfer。 [この手順は省略可能であり、それは胚の破片を除去するのに役立ちます]
- 細胞をペレットに2分間550×gで上清を遠心分離する。
- 2分間550×gで再びシュナイダー培地とスピンダウン細胞補足500μlにペレットを再懸濁し、一回の再懸濁紡糸サイクルを繰り返す。
- 最終的に約100μlにペレットを再懸濁シュナイダー培地を補充し、滅菌した35ミリメートルペトリ皿中の25ミリメートルのConA-コーティングされたカバーガラス上に細胞をプレート。細胞接着を可能にするために10分間インキュベートします。
- 付着した細胞をカバーガラスを水没から5μmCytoD補充したシュナイダー培地の2ミリリットルを追加します。
- 一晩イメージング前に加湿した25℃のインキュベーター内の皿をインキュベートする。
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Representative Results
ショウジョウバエ S2細胞は、平らな丸い「パンケーキ」形状（ 図1Aおよび1C）へのConAでコーティングされたカバースリップの広がりに取り付けられている。 S2細胞はCytoDの存在下でカバースリップ上にプレーティングし、2〜3時間拡散させしかし、それらは平行微小管（ 図1Bおよび1D）によって充填細長いプロセスを形成する。これらの微小管は、7つのプラスで終了した均一な極性を持っている。 ショウジョウバエ S2を安定に発現mCherry-チューブリンのタイムラプス蛍光イメージングは、プロセスは、特に添付ファイルの後の最初の60分（ 図2）の間に、非常に動的であることを示しています。 1時間インキュベートした後、それらの成長が遅くなり、2〜3時間インキュベートし、細胞の大部分が完全に処理を成長していることを保証する。ここでは、S2細胞内の微小管に沿って細胞小器官の輸送の2の代表的な例を示して、リソトラッカー、200 nMので標識したリソソーム（; 図3A〜B 、GFP-SKL）7（PAC-GFP-SKLとの安定したトランスフェクション; 図3D-E）。細胞のタイムラプス画像はをMetaMorphソフトウェアによって駆動パーフェクトフォーカスシステム（ニコン）とCoolsnap CCDカメラ（ローパーサイエンティフィック）を搭載したニコンのTU-2000倒立顕微鏡を用いて61フレーム毎に1秒を取った。 100-Wハロゲン光源は、光退色および光毒性を最小限にするため蛍光励起のために使用した。色右上とイメージのバーに従って符号化されたシーケンス内の61の各フレームは、色分けされたトラックを生成するために重ね合わせた。静止粒子が10個の白色が登場しつつ移動する粒子は、虹のトラックを生成した。 ImageJのプラグインを一時的なカラーコードは（ http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ）、この処理のために使用された。我々はDiaTrackソフトウェア（Semasopht Inc。）を使用オルガネラの動きの定量分析のために、我々は唯一の選択それらは容易に追跡することができ、微小管トラックの極性が知られているので、プロセスに局在する細胞小器官は図3Cおよび3Fは 、それぞれ、リソソーム及びペルオキシソームの追跡によって得られた順行性および逆行速度の典型的な分布を示している。
同様の技術は、初代培養神経細胞内小器官の輸送の解析のために私たちの研究室で使用されています。ニューロンは、ステージ9月11日の胚から得られた混合培養において優勢な細胞型である。一晩培養後、彼らは長い間（ 図4A）から50μmを超えている神経突起を有する特徴的な細胞形状によって認識するのは簡単です。これらの細胞は汎神経マーカー、ELAV 21（ 図4Bおよび4B '）に対して陽性である。神経細胞の処理が微小管（ 図4Bおよび図4B」）で満たされている。我々は、TEを使用して、神経突起に沿って細胞小器官の輸送を追跡することができますS2細胞のために、上記のchniques。ミトコンドリアは、運動ニューロン特異的プロモーターD42 22（ 図5Aおよび5A '）の制御下でミトコンドリアGFP（水戸-GFP）で標識することができ、ペルオキシソームは合胞体中に、ペルオキシソーム標的mCherry 7をコードするDNAの注入によってマークすることができる胚盤葉期胚（ 図5Bおよび図5B '）。
CytoDによって誘導された。図1。 ショウジョウバエ S2突起形成。のConA-プレコートしたカバーガラスにプレーティングした場合（A、C） ショウジョウバエ S2細胞が付着し、平らにし、丸い形に広がった。 2.5μmのCytoDの存在下でプレーティング（B、D）S2細胞を、3時間のインキュベーション後に微小管を充填した長い突起を形成する。 <強い> ABとCDはそれぞれ、光と蛍光mCherryタグ付きチューブリンの画像を送信している。スケールバーは10μmを。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 ショウジョウバエ S2細胞内のプロセスの成長の時間が経過する。2.5μMCytoDの存在下でmCherry-チューブリンを発現しているショウジョウバエ S2細胞の蛍光タイムラプス。数字は、セルがカバーガラスに付着した後の時間を示している。スケールバー、5μmのは。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 ショウジョウバエ S2細胞における細胞小器官輸送。（AC）リソソーム移動ショウジョウバエ S2細胞における。 （フィジーで作成された）人工時間的コード（B）で表される1セル（A、DIC画像）の代表1分-リソソーム輸送（200 nMのリソトラッカーで標識した）。プロセスで追跡リソソーム運動の分析から得られた速度（DiaTrack; 23細胞において663粒子）（C）。 ショウジョウバエ S2細胞における（DF）ペルオキシソーム移動。人工時間的コード（フィジーで作成された）、（E）で表される1セル内（PMT-GFP-SKLで標識した）代表1分-ペルオキシソーム輸送（D、DIC画像）。プロセスで追跡ペルオキシソーム運動の分析から得られた速度（DiaTrack; 20細胞において228粒子）（F）。リソソームが動くことに注意してくださいペルオキシソームより長く、より速く軌道を持つ。スケールバー、5μmのは。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。一晩培養物からの一次ショウジョウバエのニューロン（A）で一晩培養されたショウジョウバエのニューロンは、長い神経突起を有する特徴的な神経細胞の形態を有する。 （B）はニューロンはDM1α、ELAV（B中のB、白、赤」、DSHB、7E8A10、1:100）とB、Bと白の微小管（緑''で満たされた長い神経突起を有する、汎神経マーカーを発現した、1:1000）。スケールバーは5μm。 NK」>拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5。培養されたショウジョウバエのニューロンにおける細胞小器官輸送。運動ニューロン特異的プロモーターの制御下に水戸-GFPでマークされた培養されたショウジョウバエのニューロン は、（a）ミトコンドリア、D42。 （A）における（A '）を5分間ミトコンドリア運動は（フィジーによって作成された）人工的な一時的なカラーコードによって表される。 （B）は PAC-SKL-mCherryでマーク培養されたショウジョウバエのニューロンにおけるペルオキシソームは、初期の合胞体胞胚期の胚に注入。 （B '）、（B）中の2分-ペルオキシソーム移動は（フィジーで作成された）人工時間的カラーコードで表されます。スケールバーは5μm。ig5highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
| 細胞小器官 | 説明 |
| ペルオキシソーム | FP 25でタグ付けペルオキシソーム標的信号1トリペプチド（SKL） |
| ミトコンドリア | シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIIIのミトコンドリア標的配列は、FP 26でタグ |
| ミトコンドリア | ミトトラッカー（アクティブミトコンドリア内に蓄積する染料）27 |
| リソソーム | 携帯に蓄積リソトラッカー（染料低い内部pHのコンパートメント）28 |
表1。最も一般的なオルガネラ標識ストラテジー。
この表は、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、リソソームのラベルを含む組織培養細胞中で最も一般的なオルガネラ標識ストラテジーを、まとめたものです。
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Discussion
ここでは、 ショウジョウバエ S2細胞および一次神経細胞培養で微小管依存貨物輸送を研究するための詳細なプロトコルを提示する。両方S2プロセスや神経突起は、細胞小器官の輸送のためのトラックとして機能バンドルされた微小管アレイで満たされた構造である。
2つの戦略は、一般的に細胞小器官を標識するために使用される：ベクターのトランスフェクションは、培養液に直接添加して蛍光色素で細胞小器官標的化配列または染色で蛍光タンパク質をコードする。貨物標識の一般的な例を表1に示す。細胞を撮像するためのカバースリップ上に播種する前に、 ショウジョウバエ S2細胞の一過性トランスフェクションまたはRNAi治療が必要な場合には、懸濁液4,6,7,9,10で行われる。
S2細胞実験において信頼性のある結果を得るためには、次の点に留意しておくことが重要である。
- イメージングのための最適な密度でプレートの細胞。高デン低密度で細胞が乏しい生存率を有し、プロセスを形成することができ、一方sityは、異なるセルからのプロセスの重複をもたらすであろう。
- S2細胞が完全にプロセスを開発することができます。我々は日常的にめっき後2時間細胞をインキュベートが、必要に応じて24時間までインキュベーションまでを行うことができる。
- 彼らはConAをコートしたカバーガラスに取り付ける前に、S2細胞はCytoDで処理しなければならない。細胞が付着した後に薬物を添加すると、プロセスの形成を誘導しないであろう。
- ミトトラッカー又はリソトラッカーのいずれかを有する細胞の長期のインキュベーションは、細胞に対して毒性であり、染料、毎分20〜25を撮像するための変更のサンプルを使用した場合。
- 私たちは通常、1フレーム/秒で1分間の撮影によりS2細胞中で貨物輸送を追跡します。この条件では細胞は、光損傷していない。
- 唯一の細胞プロセスにおいて細胞小器官の動きを分析します。細胞体中の細胞小器官密度は動きの信頼できるトラッキングおよび極性が高すぎる容易に決定することができなかった。
このプロトコルでは、以下に示すいくつかの重要なステップに注意を払う必要があるかもしれません。
- 正しく期の胚。収集された胚は、外胚葉から神経芽細胞の剥離が発生したときに、同期化され、ステージ9月11日に上演される必要がある。ステージング胚は早すぎたり遅すぎ少ない各胚における神経芽細胞と解離した胚から神経細胞を採取するしたがって故障の原因となります。
- 右限りDechorionate胚（すべての胚の透明性に完全に白から色を変更）。オーバーdechorionation胚を損傷する恐れがありながら過小dechorionation、胚解離することが困難になる可能性があります。 12月horionated胚は非常に粘着性とソフトになり、そのため、ピペッティングまたは解離前の洗浄工程の間にピペットチップで胚に触れを避けるようにしてください。
- 解離を胚には特に注意してください。私たちは、プラスチックの使い捨てペレット乳棒と一致するマイクロチューブは、特に胚の数が少ないために、ガラス製ダウンスホモジナイザーよりも良い分離を与えることがわかります。過剰解離が細胞破壊および細胞破片の大量蓄積につながるながらアンダー解離は、大規模な細胞クラスターを残す。胚の番号に従って解離レベルを調整します。
- 合理的な密度にガラスカバースリップ上でニューロンをメッキする。スパースニューロンは、多くの場合、生き残るために失敗しながら、混雑したニューロンは、通常、非常に短い神経突起を開発しています。
さらに、我々は、初代細胞培養物は、多くの場合、筋肉細胞、および血液細胞を含んでいることに気づいた。 CytoDで一晩処理は、筋細胞と血液細胞の数を減少させ、促進するのに役立ち神経突起伸長は、S。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、これらのプロトコルの開発に貢献したゲルファントラボのメンバーに感謝。この刊行物で報告された研究は賞の数BFI-2011から295 UDCの下にVIGへの賞の数R01GM052111下の国立衛生研究所の総合医科学研究所がバスク政府教育省、大学や研究によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
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