Summary
Células Drosophila S2 e neurônios cultivados são grandes sistemas para a imagem latente de transporte organela motorizado in vivo. Aqui nós descrevemos protocolos detalhados para o cultivo de ambos os tipos de células, a sua imagem e análise de transporte.
Abstract
As células S2 de Drosophila semeadas em uma lamela, na presença de quaisquer processos longos não ramificados formam droga-despolimerização da actina cheios com microtúbulos uniformemente polarizadas. Organelos mover ao longo destes processos pelos motores de microtúbulos. Fácil manutenção, de alta sensibilidade à proteína do RNAi mediada por knock-down e procedimento eficiente para a criação de linhas celulares estáveis fazer células Drosophila S2 um sistema modelo ideal para estudar o transporte de carga por imagens ao vivo. Os resultados obtidos com as células S2 podem ainda ser aplicado a um sistema mais fisiologicamente relevante: o transporte axonal em neurónios primários cultivadas a partir de embriões de Drosophila dissociados. Neurônios cultivados crescer neurites longos cheios de microtúbulos empacotados, muito semelhantes aos processos S2. Como em células S2, organelas em neurônios cultivados pode ser visualizado por qualquer corantes fluorescentes específicos de organelas ou usando marcadores fluorescentes organelas codificadas pelo DNA injetado em embriões ou expressa em transgénicaic voa. Portanto, o transporte organela pode ser facilmente gravado em neurônios cultivados em lamínulas usando imagens vivas. Aqui nós descrevemos os procedimentos de cultura e visualizando o transporte de carga em células Drosophila S2 e neurônios primários. Acreditamos que estes protocolos fazer os dois sistemas acessíveis para os laboratórios que estudam o transporte de carga.
Introduction
Células Drosophila S2 ganharam popularidade crescente para estudar muitos processos celulares. Estas células foram originalmente obtidas a partir de embriões de fase tardia com tripsina de OregonR Drosophila melanogaster e manter as características de macrófagos como 1. Células S2 de Drosophila oferecem muitas vantagens em relação a outras linhas celulares. Elas são cultivadas a 25 ° C, sem CO 2, e podem ser visualizados por várias horas à temperatura ambiente, sem a necessidade de aquecimento ou de permuta de gás. Mais importante, as células de Drosophila S2 são muito sensíveis a um tratamento de alta eficiência, permitindo RNAi knockdown de proteínas de interesse. As células S2 são altamente transfectable e linhas celulares estáveis pode ser seleccionada em menos de quatro semanas para permitir que a expressão ectópica estável de proteínas de interesse. As células S2 normalmente crescem ou fracamente ligado, mas não se espalhou sobre uma garrafa ou em suspensão. Eles podem ser induzidas para se espalhar em lamelas previamente revestidas com uma lectina de planta concanavalin A (ConA). A periferia das células de propagação é especialmente fina e, portanto, é ideal para a microscopia de células vivas. Os protocolos detalhados para a cultura de células S2, tratamento de RNAi, imagiologia de luz vivo e imunocoloração pode ser encontrada na literatura 2,3. O nosso laboratório adoptou células S2 como um sistema modelo para o estudo de transporte de carga à base de microtúbulos. Células S2 de Drosophila tratadas com qualquer droga que despolimeriza ou rompe F-actina, tais como a citocalasina D (CytoD), crescem processos longos cheios de microtúbulos uniformemente polarizadas 4 -10, o que o torna um sistema ideal para estudar a movimentação de cargas ao longo de matrizes de microtúbulos. Diferentes parâmetros de transporte nesses processos (ou seja. Trajetórias comprimentos, velocidades, direcionalidade, etc) pode ser facilmente medido usando o software de rastreamento de partículas automatizada, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Estas propriedades fazem células S2 um sistema atraente para o estudo de transporte de carga ao longo dos microtúbulos em células de cultura de tecidos.
Experiências-piloto em células S2 pode ser estendido para um modelo fisiologicamente importante de estudos de transporte de carga em Drosophila neurônios primários. Semelhante para células S2, neurónios cultivados a partir de embriões dissociadas são permeáveis a moléculas pequenas, tais como corantes e inibidores, e alta resolução de imagem ao vivo de transporte organela pode ser realizada em neurónios à temperatura ambiente. Usando Drosophila com diferentes origens genéticas, podemos examinar a função do gene em neurônios primários por nocaute (genéticos mutações de perda de função), knockdown (injeção dsRNA ou expressão) ou expressão ectópica (moscas transgênicas). Especificamente, a fragmentação dos filamentos de actina utilizando tratamento CytoD não impede crescimento de neuritos, em vez disso eles crescem mais rápido e, assim, podemos estudar microtúbulos-dependtransporte organela nt em neurônios tratados com CytoD sem a influência de filamentos de actina 11. Portanto, culturas neuronais primárias combinam as vantagens das células de cultura de tecidos e genética voar, o que o torna um grande sistema para estudar o transporte de carga em um sistema relevante fisiológica 10,12. Uma vez que várias doenças neurodegenerativas familiares poderiam ser causadas por ou associadas com os defeitos de transporte de carga (por exemplo, doença de Parkinson 13, doença de Huntington 14, a doença de Alzheimer 15,16, Esclerose Lateral Amiotrófica / ALS 17, HMN7B e Perry síndrome 18,19, e tipo de ataxia espinocerebelar 5/SCA5 20), as culturas neuronais primárias podem ser úteis na análise dos efeitos das mutações específicas que causam estas doenças em transporte dependente de microtúbulos.
Finalmente, as propriedades importantes de transporte dependente de microtúbulos são bem conservada entre os mamíferos e as moscas, mas
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Protocol
1. Células S2 de Drosophila
Preparação de lamelas revestidas com ConA
- Coloque lamelas em um rack de cerâmica e lavá-los por imersão ácido crômico para 1 hora. [CUIDADO: o ácido crômico é corrosivo e pode causar irritação dos olhos, nariz, garganta e pele].
- Enxaguar abundantemente com lamelas funcionando constantemente dH 2 O por 30 minutos até que o ácido é completamente lavada.
- Deixe o ar seco lamelas e revesti-los com ConA (solução de 0,5 mg / ml em dH 2 O) durante 30 min.
- Lavar lamínulas com dH 2 O por 15 minutos e deixe-as secar naturalmente. ConA lamelas revestidas podem ser armazenadas até 1 mês.
Plaqueamento das células
- Permitir que as células S2 a crescer exponencialmente em T25 ou T75 cm 2 frascos, dependendo do número de células necessário para o experimento.
- Contagem da densidade de células utilizando um hemocitómetro. Adicionar 1 mL de crescimento médio (por exemplo Insecto-Xpress) de 35 mm no tecido do prato de cultura com ConA lamela revestida, e suavemente transferir ~ 1 x 10 5 células para o prato. Esta densidade de células é o ideal para imagens porque os processos a partir de células diferentes não se sobrepõem.
- A fim de induzir a formação de processos, imediatamente após o plaqueamento adicionar meio de 1ml com 5 uM CytoD para o prato (a uma concentração final de 2,5 uM CytoD). Permitir o desenvolvimento completo dos processos por incubação das células, pelo menos durante 2 horas a 25 º C antes de imagem.
2. Drosophila primária Cultura Neuron
Preparação para a cultura neurônio
- Prepare Drosophila meio de crescimento neuronal (meio de Schneider suplementado com: 20% de soro fetal de bovino, inactivado por calor a 55 º C durante 30 min, 5 ug / ml de insulina, 100 ng / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 10 ng / ml de tetraciclina) . Este supmeio de mentou Schneider pode ser armazenado a 4 º C por 6 meses.
- Prepare frascos de ágar suco de maçã para a coleta de embriões de Drosophila (22,5 g de ágar, 12,0 g de sacarose e 750 ml de H 2 O em uma garrafa de 2 litros; autoclave para 20-25 min, adicione 250 ml de suco de maçã e despeje ~ 10 ml em cada Drosophila frasco, após a solidificação, ligue frascos com bolas de algodão, e embrulhe com filme frascos comida de plástico para evitar o excesso de secagem dos alimentos). O suco de maçã em frascos de ágar podem ser armazenados a 4 º C no bem-sacos plásticos fechados para 4 semanas.
- Lavado com ácido Brasão 25 milímetros lamínulas círculo com ConA (ver detalhes no protocolo para células Drosophila S2) e esterilizá-los sob a luz UV por 10-15 min. Estas lamelas podem ser armazenadas por um mês.
Drosophila cultura neurônio embrionário
- Mantenha jovem adulto voa em frascos de ágar suco de maçã suplementadas com levedura seca por 1-2 dias antes de coletar embriões fou preparação neurônio.
- No dia em que a coleta, a fim de sincronizar os embriões colhidos, transferência adulto voa para uma maçã fresca suco frasco agar para uma pré-colheita de hr em luz e descartar esses embriões.
- Transferência voa para um novo frasco de ágar suco de maçã, coletar embriões para 1 hora e transferir as moscas para outro frasco por mais uma hora, tanto no escuro para aumentar a produção de embriões.
- Retire as moscas adultas do agar frasco de suco de maçã e deixar os embriões se desenvolvem mais 4 horas para estágios 9-11 à temperatura ambiente (4-6 embriões hr de idade estão entre fase 9-11).
- Retire os embriões por esguichando água em frascos e soltando os embriões do ágar suco de maçã com um pincel pequeno (pelo menos 10 embriões são necessários para uma boa preparação neurônio).
- Transferir os embriões para a 100 mm de malha de nylon filtro de células com uma pipeta de transferência para drenar a água (prerinse a pipeta de transferência em tampão de lavagem embrião Drosophila, 0,4% de NaCl, 0,03% TritonX-100).
- Coletar os embriões do filtro usando um pequeno pincel, e transferi-los para um microtubo de 1,5 ml preenchida com 1 ml Drosophila lavagem embrião (Nota: limpar as fibras de algodão ou de ágar usando o pincel ou pontas de pipeta). Neste protocolo, a 1,5 ml microtubo vem com um pilão pellet descartável correspondente.
- Lave embriões em lavagem embrião Drosophila 3x.
- Dechorionate os embriões em uma nova solução 1:1 de água sanitária comercial e de etanol de 95% para 10 min [CUIDADO: água sanitária pode causar irritação nos olhos, nariz, garganta e pele].
- Mover-se para a capa de cultura de tecidos, e lavar 2x embriões em meio de Schneider suplementado.
- Deixar 200-300 ul meio no tubo com os embriões, e suavemente dissociar mecanicamente embriões dechorionated usando Kimble perseguição pilões pelota descartáveis que foram esterilizadas por etanol a 70% (moer 10-15x).
- Centrifugar a mistura homogeneizada a 20 x g durante 2 min, e transfer o sobrenadante para um tubo fresco. [Este passo é opcional, que ajuda a remover os restos do embrião]
- Centrifuga-se o sobrenadante a 550 g durante 2 min para sedimentar as células.
- Ressuspender o sedimento em 500 ul de células suplementadas médio e de rotação de Schneider-se novamente a 550 x g durante 2 minutos, repetir o ciclo de re-suspensão de fiação uma vez.
- Finalmente ressuspender o sedimento em ~ 100 ul suplementado meio de Schneider e prato das células numa lamela de 25 milímetros de ConA-revestido num estéril 35 milímetros placa de Petri. Incubar durante 10 min para permitir a fixação das células.
- Adicionar 2 ml de meio de Schneider, suplementado com 5 uM CytoD para submergir a lamela com células ligadas.
- Incubar o prato em um umidificado 25 ° C incubadora durante a noite antes de imagem.
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Representative Results
Células Drosophila S2 ligados na lamela propagação ConA revestido em uma rodada plana "panqueca" forma (Figuras 1A e 1C). No entanto, quando as células S2 semeadas em lamelas na presença de CytoD e deixada espalhar-se para 2-3 horas, formam processos longos e finos carregados em microtúbulos paralelas (Figuras 1B e 1D). Estes microtúbulos têm polaridade uniforme com plus-termina a 7. Time-lapse imagens de fluorescência de Drosophila S2 expressando estavelmente mCherry-tubulina mostra que os processos são muito dinâmicas, especialmente durante os primeiros 60 minutos após a ligação (Figura 2). Após 1 hora de incubação, o crescimento desacelera e 2-3 horas de incubação garante que a maioria das células têm processos totalmente crescido. Aqui nós mostramos dois exemplos representativos de transporte organela ao longo dos microtúbulos em células S2, lisossomos (rotuladas com Lyso Tracker, 200 nm; Figuras 3A-B 7 (transfecção estável com Pac-GFP-SKL; Figuras 3D-E). Imagens de lapso de tempo das células foram levados cada 1 s por 61 quadros usando um microscópio invertido Nikon TU-2000 equipado com um sistema perfeito Focus (Nikon) e câmera CCD CoolSnap (Roper Scientific) conduzido por software Metamorph. A fonte de luz halógena de 100 W foi usado para excitação de fluorescência para minimizar a fotodegradação e fototoxicidade. Cada um dos 61 quadros em seqüência foi codificado por cores de acordo com a barra à direita e as imagens foram sobrepostas para gerar faixas codificadas por cores superior. Assim, as partículas que se deslocam gerado faixas arco, enquanto que as partículas estacionárias apareceu branco 10. ImageJ plug-in temporal Código de cor ( http://fiji.sc/Temporal-Color_Code ) foi utilizado para esta transformação. Para a análise quantitativa do movimento organela usamos software DiaTrack (Semasopht Inc.), só selecionarorganelas que estão localizadas nos processos porque eles podem ser facilmente rastreados e a polaridade de faixas de microtúbulos é conhecido. Figuras 3C e 3F mostram distribuições típicas de velocidades retrógrada e anterógradas obtidos por lisossomas e peroxissomas acompanhamento, respectivamente.
Técnicas semelhantes são usadas em nosso laboratório para análise de transporte organela em neurônios cultivados primários. Os neurônios são um tipo de célula predominante em culturas mistas obtidas de embriões fase 9-11. Após a cultura durante a noite eles são fáceis de reconhecer pela forma da célula característica com neurites que são mais de 50 mm de comprimento (Figura 4A). Estas células são também positivas para o marcador de pan-neuronal, Elav 21 (Figuras 4B e 4B '). Processos em que os neurônios estão cheios de microtúbulos (Figuras 4B e 4B "). Podemos rastrear o transporte de organelas ao longo das neurites usando o techniques acima descrito para as células S2. As mitocôndrias pode ser marcado com GFP mitocondrial (Mito-GFP) sob o controlo de um promotor específico de neurónios D42 motor 22 (Figuras 5A e 5A '), e os peroxissomas podem ser marcadas por injecção do ADN que codifica para um alvo-peroxissoma mCherry 7, em sincicial embriões em estágio blastoderma (Figuras 5B e 5b ').
Formação Figura 1. Drosophila S2 processo induzido por CytoD. Células (A, C) Drosophila S2 anexar e espalhar em formas redondas e achatam quando banhado em lamelas de ConA-pré-revestidas. Células (B, D) S2 plaqueadas na presença de 2,5 mM CytoD formar processos longos cheios com microtúbulos após 3 horas de incubação. <strong> AB e CD são transmitidos luz e imagens de tubulina fluorescentes marcadas-mCherry, respectivamente. Barra de escala, 10 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Lapso de tempo dos processos de crescimento em células de Drosophila S2. Fluorescência de lapso de tempo de uma célula S2 de Drosophila expressando mCherry-tubulina na presença de 2,5 uM CytoD. Os números indicam o tempo após a célula anexar à lamela. Barra de escala, 5 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Movimento transporte organela nas células Drosophila S2. (AC) Lysosome em células de Drosophila S2. Um representante de 1 min lisossoma transporte (marcado com 200 nM de Lyso Tracker) em uma célula (A, imagem DIC) representado pela Temporal-Código artificial (criado por Fiji) (B). Velocidades obtidas a partir da análise de movimento lisossoma rastreados nos processos (DiaTrack; partículas em 23 663 células) (C). Movimento (DF) de peroxissoma em células S2 de Drosophila. Um representante de 1 min peroxisome transporte (identificado com PMT-GFP-SKL) em uma célula (D, imagem DIC) representado pelo Temporal-Code artificial (criado por FIJI) (E). Velocidades obtidas a partir da análise de movimento de peroxissoma rastreados nos processos (DiaTrack; partículas 228 em 20 células) (F). Note-se que os lisossomas mover com trajetórias mais longas e mais rápidas do que os peroxissomos. Barra de escala, 5 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Neurônios primária de Drosophila de cultura durante a noite. (A) Uma cultura neurônio Drosophila durante a noite tem morfologia neuronal característica com neurites longas. (B) O neurônio expressa um marcador pan-neuronal, Elav (vermelho e branco em B em B ', DSHB, 7E8A10, 1:100) e com neurites longos cheios de microtúbulos (verde em B e branco em B'', DM1α , 1:1000). Barra de escala, 5 um. nk "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 5. Transporte Organelle em neurônios em cultura de Drosophila. (A) As mitocôndrias em um neurônio Drosophila culta marcado por Mito-GFP sob o controle de um motor de neurônio-específica promotor, D42. (A ') 5 movimento min mitocondrial em (A) está representada pelo código de cores artificiais-temporal (criado por Fiji). (B) Peroxisomes em um neurônio Drosophila cultura marcada por Pac-SKL-mCherry, injetado em embriões em estágio iniciais blastoderme sincicial. (B ') 2 movimento min peroxissoma em (B) está representada pelo código de cores artificiais-temporal (criado por Fiji). Barra de escala, 5 mm.ig5highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
| Organelle | Descrição |
| Peroxisomes | Sinal de direcionamento Peroxissômicos um tripeptídeo (SKL) marcado com um FP 25 |
| As mitocôndrias | Seqüência de direcionamento mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade VIII marcado com um FP 26 |
| As mitocôndrias | Mitotracker (Dye que se acumula na mitocôndria ativa) 27 |
| Os lisossomos | Lysotracker (Dye, que se acumula no celularcompartimentos com baixo pH interno) 28 |
Tabela 1. Estratégias de rotulagem organela mais comuns.
Esta tabela resume os mais comuns estratégias de rotulagem organela nas células de cultura de tecidos, incluindo a rotulagem de peroxissomos, mitocôndrias e lisossomos.
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Discussion
Aqui apresentamos protocolos detalhados para estudar o transporte de carga dependente de microtúbulos em células Drosophila S2 e cultura neurônio primário. Ambos os processos e neurites S2 são estruturas preenchidas por pacotes de microtúbulos matrizes que servem como pistas para o transporte de organelas.
Duas estratégias são normalmente utilizados para organelas rótulo: transfecção de vetores que codificam uma proteína fluorescente com uma seqüência de metas organela ou coloração com corantes fluorescentes adicionados diretamente a culturas. Os exemplos comuns de marcas de carga estão listadas na Tabela 1. Transfecção transiente ou tratamentos de RNAi de células S2 de Drosophila, se necessário, é realizada em suspensão 4,6,7,9,10 antes de células foram semeadas em lamelas de imagiologia.
A fim de obter resultados confiáveis em experimentos com células S2, é importante manter os seguintes pontos em mente:
- Células em placas a densidade ideal para a imagem latente. Alta densidade resultará na superposição de processos de células diferentes, enquanto para as células de baixa densidade ter viabilidade pobre e são incapazes de formar processos.
- Permitir que as células S2 de desenvolver completamente processos. Rotineiramente incubar células para 2 horas após o plaqueamento, mas a incubação até 24 horas pode ser realizada, se necessário.
- Células S2 devem ser tratados com CytoD antes que atribuem ao lamelas ConA revestidos. Adição da droga após as células estão ligados não induzem a formação de processos.
- Ao utilizar corantes, amostras de alteração para imagiologia cada 20-25 min; incubação a longo prazo das células quer com Mitotracker ou Lyso Tracker é tóxico para as células.
- Costumamos acompanhar o transporte de carga em células S2 por imagem por 1 min a 1 frame / sec. Sob esta condição as células não são danificados pela foto.
- Apenas analisar o movimento organelo em processos celulares. Densidade organelo celular no corpo é demasiado elevada para o seguimento fiável e polaridade do movimento não podia ser facilmente determinada.
Neste protocolo, você pode precisar pagar atenções para vários passos-chave listados abaixo:
- Embriões em estágio corretamente. Os embriões coletados precisam ser sincronizadas e encenado para estágios 9-11, quando neuroblasto delaminação do ectoderma ocorre. Encenação embriões demasiado cedo ou demasiado tarde pode resultar em menos neuroblastos em cada embrião e, portanto, a falha dos neurônios de colheita de embriões dissociados.
- Embriões Dechorionate na medida certa (todos os embriões mudar de cor de completamente branco a mais transparente). Sub-dechorionation pode levar a dificuldade de dissociação embrião, enquanto o excesso de dechorionation pode danificar os embriões. Dezembroembriões horionated se tornar muito pegajosa e macia, assim, tentar evitar pipetagem ou tocar os embriões com pontas de pipeta durante as etapas de lavagem antes de dissociação.
- Preste atenção especial aos embriões dissociação. Nós achamos que pilões pelota descartáveis de plástico e microtubos correspondentes dar uma melhor dissociação de um homogeneizador dounce vidro, especialmente para empresas de pequeno número de embriões. Sub-dissociação vai deixar grandes grupos de células, enquanto que o excesso de dissociação levará a células avaria e imenso acúmulo de restos celulares. Ajuste o nível de dissociação de acordo com os números de embriões.
- Galvanização neurônio na lamela de vidro a uma densidade razoável. Lotado neurônios geralmente se desenvolvem neurites muito curtos, enquanto os neurônios esparsas muitas vezes não conseguem sobreviver.
Além disso, percebemos que as culturas de células primárias, muitas vezes contêm células musculares e as células sanguíneas. Tratamento durante a noite com CytoD ajuda a reduzir o número de células de músculo e de células do sangue, e promoveré crescimento de neuritos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório Gelfand que contribuíram para o desenvolvimento destes protocolos. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número prêmio R01GM052111 para VIG e pelo Departamento de Governo Basco da Educação, Universidades e Pesquisa sob o número prêmio BFI-2011-295 a UdC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 | |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Penicillin | Research Products International | P93000 | |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 | |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 | |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 | |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 | |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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