Summary
蛋白质构象和动力学的关键是理解蛋白质结构与功能之间的关系。氢交换耦合用高分辨率质谱法是研究蛋白质的构象动力学以及表征蛋白质 - 配体和蛋白质之间的相互作用，其中包括接触接口和变构效应的灵活的方法。
Abstract
所有的细胞过程依赖于蛋白质的功能。尽管给定的蛋白质的功能是其独特的氨基酸序列的直接后果，它仅由多肽链的折叠成一个单一的定义的三维结构或更常见为构象之间互相的合奏来实现。研究蛋白质构象与功能之间的联系是必不可少的，因此对于蛋白质如何能够履行其种类繁多的任务的完整理解。一种可能性，研究的构象变化，而 通过其官能周期进展的蛋白质经历是氢-1H / 2 H-交换与高分辨率质谱（HX-MS）的组合。 HX-MS是增加了一个新的层面，通过如结晶获得结构信息的灵活和可靠的方法。它是用来研究蛋白质折叠和展开，小摩尔结合ecule配体，蛋白质 - 蛋白质相互作用，挂酶催化的构象变化，和变构效应。此外，HX-MS通常被用于当蛋白质的量是非常有限的或蛋白质的结晶是不可行的。在这里，我们提供了一个通用协议，用于研究蛋白质动力学与HX-MS和描述，例如，如何显示两种蛋白质的相互作用界面在复杂的。
Introduction
蛋白和蛋白复合物的晶体结构的数量近年来迅速增加。他们提出这些蛋白质的结构组织的非常宝贵的快照，并为结构 - 功能分析的基础。然而，蛋白质和构象变化，这对于其功能必需的动力，也很少由X-射线结晶学揭示。冷冻电镜，另一方面，能够捕获蛋白和蛋白复合物在不同的构象，但一般不能解析的构象变化下降到二级结构的第1级。在原子细节的蛋白质在溶液中的构象动力学只能通过NMR来解决，但这种方法仍局限于相对较小的尺寸（通常≤30 kDa）的蛋白，并且需要高浓度的蛋白质（≥100微米），这阻碍了实验低聚或易聚集的蛋白质2。一种方法，该方法能够高分辨率X-射线晶体学和低温电镜和其之间的桥梁不是由蛋白质大小或浓度的限制是酰胺氢-1与质谱（MS）结合的H / 2 H-交换（HX）。近年来，这种方法已经发展到用于蛋白质动力学，蛋白质折叠，蛋白质稳定性和构象变化3-5的分析有价值的分析工具。该方法的分子基础是骨干酰胺氢中的蛋白质，这将与氘原子交换，当蛋白质被放置在D 2 O中的溶液中不稳定的性质。随着时间的推移随后增加蛋白质量的测量与高分辨率质谱。
总之非结构化肽HX只依赖于温度，催化剂浓度（OH - ，H 3 O +，即 pH值， 见图3）和相邻的残基，由于电感，猫氨基酸侧链alytic和空间位阻效应。在固有的化学交换率k CH这些影响已经由白等人 。6被量化的优雅和程序是可用的（礼貌Z.张），其中计算K 通道的多肽取决于pH值和温度范围内每个氨基酸。在中性pH值和温度，Ķch是在10 1 -10 3秒-1的顺序。在折叠的蛋白质HX可以是2-9个数量级慢，主要是由于在二级结构的氢键和一个较小的程度，由于水合OH的受限制的访问-离子以紧密折叠的蛋白质的内部。因此HX的天然蛋白质牵连局部或全局展开，化学交换，并根据公式折叠到天然态（1）和观察到的外汇报价K OBS依赖于开放率k 运算 ，收盘率k cl和内在化学交换RA特ķ 沟道根据等式（2）。
根据天然状态条件Ķ 运算比k 通道小得多，并且可以在分母被忽略。有所谓的EX1和EX2两个极端的汇率制度。如果第k CL比k 通道 （EX1）小得多所观察到的速率几乎等于开口率和HX允许直接观察的结构元件的展开的。这种汇率制度，所有的酰胺质子交换一次开盘时的结构元素，是很容易观察到在MS通过的同位素峰7双峰分布。如果k CL比k 通道大得多（EX2）所观察到的速率正比至K 通道 ，由此比例常数等于该折叠-展开平衡点常数K U = K 运 CL。在这些条件下，许多打开和关闭事件是必要的，在对于氘核所有的酰胺质子交换，导致平均质量逐渐提高，而同位素分布保持大致相同。该EX2制度容许展开ΔGu的自由能的决心和结构元素，因此稳定性。在自然状态条件下的EX2政权是最常见的。增加了pH值和增加离液剂的可以交流机制转移到EX1。因此，HX-MS可以用来探索热力学以及蛋白质折叠和构象变化的动力学参数。
如上面提到的HX是本质的pH和温度依赖的和骨干酰胺基的溶剂完全暴露质子交换半衰期为5-400毫秒，在生理pH值（pH值7.6）和30℃，但10分钟之间，以> 15小时用在pH值2.9，平均> 2小时，0°C（除了一种多肽，它具有交换的半衰期大约为1-2分钟的第一个骨干酰胺键的质子）。在这样慢交换条件，能够使用的蛋白酶（ 如胃蛋白酶），这些活性在这些条件下，与出丢失所有包含在掺入氘核的信息来消化样品。自消化道的消化缓慢交换条件下引入，全长蛋白质不仅整体HX动力学进行分析，但HX可以将其定位于特定的区域8,9。空间分辨率目前仅限于所产生的可消化性的片段，这是在一般的10-30残基之间的尺寸。然而，通过胃蛋白酶产生由于裂解的非特异性性质重叠的碎片可能会导致增加的空间分辨率。此外，其它一些蛋白酶被发现淬火条件下有活性，但是，比胃蛋白酶10少得多的效率。进一步increa空间分辨率的本身可以通过肽在气相中的分片到达由保藏的氘化图案如电子捕获解离（ECD），电子转移解离（ETD）和红外多光子解离（IRMPD）11-13的方法。这些技术避免空间分辨率的损失是由于分子内质子迁移（“加扰”），这是由碰撞诱导解离（CID）所观察到的最常用的破碎技术。然而，这些方法需要优化每个个体肽，因而仍然非常具有挑战性。
HX-MS已经被用于分析蛋白质-配体和蛋白质之间的相互作用，包括病毒衣壳组装14-17。蛋白质变性和复性，以及温度诱导的构象变化进行了调查7,18,19。磷酸化和单个氨基酸突变相关的构象变化16,20和nucleotIDE引起的变化进行了分析21,22。因此，这种方法似乎非常适合于分析组件和分子机器的动力学。一个有吸引力的候选人，其机理是非常普遍的兴趣，是Hsp90的分子伴侣复合体。
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Protocol
1。缓冲液的制备和蛋白样品
- 准备H 2 O缓冲区。用Hsp90的标准缓冲液（40mM的HEPES / KOH，pH值为7.5，50mM的氯化钾，5毫摩尔MgCl 2，10％甘油），为H 2 O的缓冲液中。
注意 ：如果样品分析前透析，用透析缓冲液以H 2 O缓冲区。至关重要的是，在D 2 O缓冲器不同于H 2 O的缓冲仅在氢同位素。易失性缓冲区像NH 4 CO 3或NH 4 -乙酸酯或缓冲液组分是不适合！ - 用真空浓缩器的热休克蛋白90的标准缓冲液冻干准备D 2 O缓冲区。对H 2 O完全蒸发后，加入纯D 2 O到管达到初始总容积（ 如 1毫升15％甘油缓冲需要添加850微升D 2 O）。重复该缓冲器的完全蒸发，并再溶解在缓冲/盐的COMponents在D 2 O中2倍。
- 制备骤冷缓冲液（0.4M的KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH值2.2）。
注意 ：为了提高胃酶消化的非常稳定的蛋白质的4M盐酸胍和0.5M的Tris（2 -羧乙基）膦（TCEP-HCl中）可以被添加的效率。 - 准备100％控制样品（6M盐酸胍，D 2 O）。添加盐酸胍到热休克蛋白90等分达到6米的最终浓度从样品完全蒸发H 2 O和加入D 2 O到管达到初始总容量（ 如 100微升的样品用10％的甘油需要添加90微升D 2 O）。重复该缓冲器的完全蒸发，并再溶解于D 2 O的缓冲/盐组分
注 ：20-100皮摩尔样品都需要每次注射。准备足够的样本有100％控制的HX-MS实验的每一天。 - 准备50皮摩尔热休克蛋白90在5微升Hsp90的标准缓冲液。
注 ：需要为每个点的原始数据的20-100皮摩尔样本的数量。样品在反应体积为1-5微升理想。调节浓度，以适应这些要求。任何缓冲可以，只要它不含有去垢剂或挥发成分使用。
2。激活珠子固定胃蛋白酶对醛制备
- 溶解80毫克新鲜胃蛋白酶在2毫升50 mM的柠檬酸钠（pH值为5）。
- 溶解20毫克氰基硼氢化钠，小心（ 极毒 ！）1毫升的2M的Na 2 SO 4处理，并加入到胃蛋白酶溶液。
- 孵育混合物10分钟，同时在室温下轻轻搅拌（ 例如顶置搅拌器）。
- 加600毫克小珠与固定化的醛基到混合物中，并孵育在室温下5-10分钟。
- 加2.2毫升的2M的Na 2 SO4（pH值为5）中加入100μl等份，每3分钟在一小时内缓慢盐析的胃蛋白酶。轻轻混匀加入之间的样品中的塔顶搅拌器在室温下。
- 孵育珠胃蛋白酶在4℃下14-16小时/通宵在开销摇床。
- 由1毫升1M乙醇胺和在室温下孵育2小时，加入淬灭反应。
- 降速的50ml falcon管中的珠子以500rpm，弃去上清，重悬珠子中的0.1％甲酸。重复此步骤2倍。最后一步离心后，弃上清，珠估计量。添加0.1％的甲酸的等效量，并存储在4℃下
3。栏目的酰胺氢交换的制备
- 使用保护柱为1毫米用于捕集柱的内径为2 mm为胃蛋白酶列。
- 拧下保护柱的一侧，取出过滤器。紧紧螺丝包装FUNN埃尔到柱上的开口端。使用1/16英寸的适配器和管连接到附加空注射器（5ml）中，以在塔的底部出口。请确保气密固定在保护柱。
- 申请几滴浆料珠料在漏斗的顶部。拉动注射器的柱塞通过漏斗吸进浆保护柱。申请更多的浆珠材料到漏斗，并继续该过程，直到保护柱完全充满珠材料。取下漏斗，并放置过滤器和过滤器环上的开口端。拧紧螺钉，柱帽将保护柱，并从对方取出注射器。关闭保护柱的两端带插头，以避免干燥柱而出材料。
4。设置系统的氢交换质谱（HX-MS）
- 连接捕集柱与HPLC系统（ 图1）。通过设定的流速平衡色谱柱A泵至0.4毫升/分钟用0.1％甲酸作为溶剂。不要连接胃蛋白酶列和分析柱呢。
- 校准质谱仪和液相色谱的出口连接到质谱仪的源。
5。交易所动态范围的确定
- 制备超纯溶剂A（0.1％甲酸的水）和超纯溶剂B（0.1％甲酸的乙腈溶液）;准备的混合溶剂是市售的。清除HPLC泵。通过短的脱盐步骤之后用一个步骤梯度选择节目设置和层析和在控制软件质谱方法。对于全长Hsp90的使用1-2分脱盐工序依次切换从脱盐/负载的6通阀，以洗脱并在步梯度从90％溶剂A/10％溶剂B至5％溶剂A/95％溶剂B.注射前设置喷射阀负载和6通阀脱盐/装载位置。
注：请不要使用此实验过程中胃蛋白酶或分析柱。 - 准备100-200皮摩尔热休克蛋白90在1-10微升H 2 O缓冲区和孵育10分钟，在30°C。加温度调节D 2 O缓冲区以使样品体积高达100μl的孵育恰好为一个限定的时间段（ 例如 10秒，100秒，1,000秒）。加入100μl缓冲液淬火和上下吹打混匀。将200μl的样品注入到注入阀用Hamilton注射器的注射口。启动色谱程序和切换进样阀到INJECT位置。 2分钟后切换6通阀从脱盐/ LOADING洗脱。重复此动作至少有三个时间点。
- 重复步骤5.2，但增加2-3倍过量STI1到Hsp90的样品在30℃温育10分钟之前
- 由光谱去卷积的质谱分析软件确定的全长蛋白质量。计算incorporat数通过每次运行（ 例如 10秒，100秒，1,000秒）后，与观察到的质量全长HSP90的分子量比较编氘核。
- 情节缺乏和STI1（y轴）与时间（x轴）的存在为热休克蛋白90的氘核结合。确定时间点的动态范围，其中两条曲线之间的差别是最大的。确定热休克蛋白90-STI1接口和肽水平动态时使用此值在D 2 O中的孵育时间。
6。消化性溃疡肽使用MS / MS质谱测定
- 胃蛋白酶柱和分析柱连接到系统。
- 设置的参数色谱和质谱中的控制软件通过选择梯度型和质谱法。选择长梯度（ 如超过90分钟），以保证良好的色谱分辨率。使MS / MS谱图上的质谱仪。
注：分辨率好化的HPLC和高的质量准确度具有最高优先级的在该步骤中。 - 准备100-200皮摩尔热休克蛋白90在100微升H 2 O缓冲区。加入100μl缓冲液淬火和上下吹打混匀。将200μl的样品注入到注入阀用Hamilton注射器的注射口。启动色谱程序和切换进样阀到INJECT位置。 2分钟后切换6通阀从脱盐/加载洗脱位置。
注意 ：如果一个以上的蛋白是在HX-MS（ 即蛋白质-蛋白质相互作用的界面）待分析的肽的每个蛋白质必须单独确定。 - 通过对所得到的肽搜索数据库（ 即吉祥物）的Hsp90识别消化性溃疡肽。
注意 ：可以使用自定义数据库作为目的是确定尽可能多的可消化性肽尽可能和分析用纯化的蛋白质进行。样品纯度会ħ等皆被考虑在内。 - 未经MS / MS和具有将被用于实际HX实验梯度重复此步骤。对热休克蛋白90和STI1用10分钟梯度从90％溶剂A/10％溶剂B至45％溶剂A/55％溶剂B。
注 ：渐变通常在5-15分钟，并高度依赖于样品的复杂性和HX系统规范。 - 确定在6.5中使用的梯度6.4中确定的可消化性肽的保留时间和创建包含1的列表。）肽序列2）肽的充电状态和3。）保留时间。这将用于HX实验后，以确定各肽。
注 ：请注意，肽与小M / Z的差异，相同的充电状态和相同的保留时间可以是模糊的源泉。
7。蛋白质 - 蛋白质相互作用界面的识别
- 设置在控制softwar的梯度和质谱法Ë。使用10分钟线性梯度由90％溶剂A/10％溶剂B至45％溶剂A/55％溶剂B装入已为300-1,500米/ Z之间的检测质量的最优化的质量分析方法，虽然大部分的肽将低于1,000 M / Z。将进样阀到装载位置，在加载/脱盐位置的6通阀。设置装载泵至0.4毫升/分钟的流速。
注 ：长度和坡度的类型是样本相关，可能必须进行优化。较长的梯度改善色谱的分辨率，但降低氘核纳入由于背部交换蛋白。所选择的方法，需要为所有的实验进行比较是相同的。 - 对于未转换的参考准备20-100皮摩尔热休克蛋白90在100微升H 2 O缓冲区。加入100μl冰冷的淬灭缓冲液，吸管上下两次，样品注入到高效液相色谱的进样阀。立即启动色谱程序和SW痒进样阀到INJECT位置。 2分钟后切换6通阀从脱盐/加载洗脱位置。做到这一点的热休克蛋白90和STI1个别及蛋白质的混合物。
- 准备20-100皮摩尔热休克蛋白90在1-5微升的体积。加入温度调节D 2 O缓冲带来的样品体积可达100微升和孵化正是为了在规定的时间内（ 如 30秒;为构象动力学见注 ）。加入100μl冰冷的淬灭缓冲液，吸管上下两次，并迅速注入200微升到高效液相色谱的进样阀。立即启动色谱程序和切换进样阀到INJECT位置。 2分钟后切换6通阀从脱盐/加载洗脱位置。这样做对于每个单独的蛋白质，以确定氘掺入在不存在相互作用蛋白的每种肽。
注 ：在研究构象的动态mational变化，重复实验与热休克蛋白90的不同孵育时间在D 2 O缓冲区。试图通过对数选择的孵育时间（ 如 10秒，30秒，100秒，300秒1000秒， 等等 ），覆盖广泛的时间尺度。 D 2 O缓冲区和上样缓冲液必须完全一样，除了氢同位素。 - 准备100％控制样品（20〜100皮摩尔）等量，加入D 2 O缓冲带来的样品体积可达100微升。加入100μl冰冷的淬灭缓冲液，吸管上下两次，并迅速注入200微升到高效液相色谱的进样阀。立即启动色谱程序和切换进样阀到INJECT位置。 2分钟后切换6通阀从脱盐/加载洗脱位置。
- 为了确定相互作用表面的至少2倍过量STI1的转向均衡到绑定状态（见注 ）和混合培养的Hsp90在所需的温度，直到复合物的形成是在平衡状态下。加温度调节D 2 O缓冲区以使样品体积高达100μl的孵育正是为了在规定的时间（ 例如 30秒）期间。加入100微升冰冷的缓冲液骤冷，移液管上下两次，并迅速注入HPLC的喷射阀。 2分钟后切换6通阀从脱盐/加载洗脱位置。重复这个实验，20〜100皮摩尔STI1的和多余的热休克蛋白90的。
注意 ：绝对浓度依赖于相互作用的解离平衡常数。理想情况下，稀释成D 2 O中后，加入过量的蛋白质的浓度至少应为10倍对K D（对应于约束下浓缩的蛋白质的> 85％）。 - 分析与合适的软件所获取的数据，并使用在步骤6.5中确定的滞留时间，以找到每个肽在分析中。计算使用TE为未交换蛋白（步骤7.2）和用于对HX实验（步骤7.3）的同位素分布的质心。
注意 ：虽然交换肽的同位素模式看起来与他们的未转换的同行不同，两者对肽的充电状态的知识和质谱仪的高质量精度可以很容易地确定质心的。 - 比较靶蛋白的单独并用过量的结合伙伴氘核的结合。这可以自动与电子表格程序的商业软件或手动完成。 100％的对照样品的值表示的每个肽的最大交换，并且可以被用来确定D 2的实验过程中，由于回交换的o标签丢失量。
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Representative Results
热休克蛋白90是在酵母和热休克蛋白90分子伴侣家族成员分子伴侣。通过经历一个复杂的ATP酶周期它有助于后期折叠步骤很多蛋白质的客户。高效的折叠需要从Hsp70的传输客户端和共伴侣Sti1/Hop的相互作用。 STI1直接结合的Hsp90，便于客户通过抑制热休克蛋白90的ATP酶活性的结合。热休克蛋白90与STI1的相互作用采用HX-MS 23最近的研究。在这里，我们提出了相关的实验按照上述协议代表性的结果。
直接蛋白相互作用是由与D 2 O标记的蛋白复合物处于平衡状态，在没有Hsp90.The造成差异的情节和存在比较STI1肽谱可以在图5A（数据来自23）可以看出测试。肽被定向从上到下开始在N-末端。大多肽TPR2a和TPR2b显示出强大的保护，热休克蛋白90（用于D +热休克蛋白90的负值- D-Hsp90的 ）的存在，表明这些地区与Hsp90的相互作用。在TPR2a保护可以很容易地从STI1-TPR2a-TPR2b在与表示热休克蛋白90的C-末端MEEVD-基序（ 图5B）的肽复合物的晶体结构合理化。在蛋白质 - 蛋白质相互作用，例如清晰的保护不总是遵守。在热休克蛋白90在STI1的存在下，保护不作为明显的，而不是作为本地化如STI1（ 图5C和5D）。所有的肽显示来自氘核纳入STI1存在小幅增加的保护。 STI1明显稳定全球热休克蛋白90作为蛋白质的区域没有显示在STI1存在更大的灵活性。但是，我们可以不区分，如果这降低了氘核结合的直接互动起源于STI1或通过构象变构效应的热休克蛋白90。获得的信息降低假定的作用位点的几个肽（NBD的如肽43-62）。另外的实验，如交联通常被用来确认HX-MS 23后的结合位点。值得注意的是，热休克蛋白90的序列覆盖测量热休克蛋白90-STI1复杂时降低。自STI1溶液中加入3.5倍过量的肽在分析的理论总金额为一些四倍比用单独的Hsp90更高。这增加STI1肽在分析过程中遮蔽或重叠的Hsp90的肽的风险。为了优化更高的序列覆盖率更好的色谱分离似乎是最有前途的方法。
一种可能性，研究不同蛋白区域的动态是采用连续标签HX-MS法。它涉及在D 2 O中的不同时期平衡蛋白样品的潜伏期，因此允许对稳定性预测个别蛋白质片段。 图6示出的肽43-62从热休克蛋白90的存在和不存在一个3.5倍过量STI1的NBD的光谱。在温育时间被选择以对数刻度（10秒，100秒，和1,000秒），以获得良好的覆盖在很宽的时间窗口。肽谱显示氘的时间依赖的掺入，增加更长的温育时间的蛋白质。对于肽43-62交换遵循EX2机制，其中k个整数 << K表CL。防护等级在整个培养时间的变化，显示出在在最长的时间点潜伏期短的时间，几乎类似汇率的主要区别。这表明较低程度的稳定化或频繁的离解和重新结合的动态相互作用的区域。无论是所观察到的保护是由于在肽或效果酰胺质子的整体降低汇率可以被分配到一个或两个具体的酰胺质子，在STI1存在交换更慢。在这种情况下，后者是更可能的Hsp90的晶体结构揭示该区域是暴露的循环，而不是象α-螺旋或β-折叠一个常规的二级结构。
重要的是要提的是，后面的交流并没有减去所示暗示的观察效果会更显着，一旦归到100％控制的数据是非常重要的。
图1。高效液相色谱法设置为HX-MS分析。一个HX-MS 的）的典型配置设置。不同颜色的区域表示保持在不同温度下的部分。的样品被注入到注入阀（在负荷模式，青色）的样品环和开关阀进入后“注入模式”（黑色）泵送通过胃蛋白酶柱进入六通阀。胃蛋白酶柱被保持大致在10℃下，以提高胃蛋白酶的酶促活性。 6通阀有两种模式，“正在加载/脱盐模式”和“洗脱模式”（见B）。样品的脱盐后的肽色谱分离用在分析反相柱中的乙腈梯度。的肽，然后喷入质谱仪以电喷雾源。6端口阀的二）模式。直接HX后的6通阀处于“正在加载/脱盐位置”陷阱陷阱列消化性溃疡肽。这是持续长达三分钟以除去反应缓冲液的任何盐或化合物可能干扰质谱。在此之后，6通阀切换到“洗脱模式”把装载捕集柱成梯度泵和分析柱之间的流动路径。被困消化性溃疡肽现在从陷阱colu洗脱Mn和成为在0.1％甲酸acid/0.1％甲酸的乙腈梯度洗脱分离。
图2。流的HX的实验方案 。 1）目标蛋白的纯化和标准缓冲液提供的不用洗衣粉。 2）该蛋白质酶解用胃蛋白酶和可消化性肽被鉴定和表征通过串联质谱（MS / MS）。只有获得序列后，充电多达肽的状态和保留时间尽可能HX-MS能够成功进行。 3）本实验条件成立，如蛋白质的特定条件下（除了配体/化学化合物或转变温度或pH下孵育。4）HX是由稀释样品进行在D 2 O中的缓冲区1点10分或更高。在D 2 O缓冲区必须是相同的上样缓冲液，以AVOID缓冲效果。然后将样品精确地培养所界定的时间周期。 5）培养后，将反应淬灭，并注入HPLC-MS系统。样品是酶促裂解，将所得消化的肽被分离在有机溶剂的梯度，并注入到质谱仪。 6）分析所获得的肽谱。肽谱的质心不同的反应条件下进行比较。这可以手动地由HX分析程序适当的软件或自动完成。
图3。氢交换机制。氢交换反应可通过碱或酸来催化，因此是依赖于pH的pH值为2.5和3之间取决于侧翼酰胺键6的残基的侧链的一个最小的汇率。杜环脱盐和肽的层析分离，这是在H 2进行O型含有溶剂，引入氘交换回质子按照同样的机制（“回交换”）。因此，系统和使用的溶剂的优化是至关重要的，以减少掺入氘核的损失。
图4。 HX-MS的原理 。配体结合的蛋白质的结果在保护的酰胺主链的氢原子在从周围溶剂的结合位点。这减少了受影响的质子交换率，降低氘核的结合。因为质子和氘核之间的重量差为1沓，从蛋白质的该区域的肽将显示一个较低的m / z质谱。比较实验的肽谱在不存在和结合配偶体的存在，就会发现光谱的质心，以降低m / z值（保护事件）的移位。那另外的合作伙伴结合后表现出显着的保护区是潜在结合位点。取决于序列的覆盖范围和重叠肽的结合位点的可用性可以被缩小到几个氨基酸。
图5。热休克蛋白90和STI1的相互作用。 STI1的包括TPR2a和TPR2b（PDB代码3UQ3）片段的 ，差异氘核结合的积成STI1的结合伴侣Hsp90的负氘纳入STI1在没有热休克蛋白90（数据来自23）的存在，B，卡通代表性在与肽，它代表了C-末端MEEVD-基序的Hsp90的复杂。卡通色雅高丁从氘核结合保护所示酰胺质子数C，热休克蛋白90的结合伙伴STI1存在差异图。观察到的氘核掺入的Hsp90后10分钟预温育与3.5倍过量STI1，在30℃和30秒; HX在相同的温度。该实验进行了一式三份，并示出平均值的标准误差为每个肽。全球负值表示氘核的结合减少和HSP90在STI1的存在，因此更高的整体稳定性。返回交换在这个实验中不予考虑。D，酵母热休克蛋白90（PDB代码2CG9）据来自氘核结合保护，在b所示酰胺质子数彩色的卡通代表。 点击这里查看大图 。
图7。与双峰的distribut肽谱的例子离子。一，氘核结合到大肠杆菌大肠杆菌热休克蛋白90在没有和ATP的存在（从22增刊获取的数据， 图3）。肽残基192-206的光谱显示在孵化D 2 O中（0％D）之前，30秒，5分钟，10分钟和30分钟孵化D 2 O，和100％的控制（100％D）后。在不存在的ATP（-ATP）的典型EX2交换行为观察。在ATP的存在（+ ATP）的一个强有力的保护，在30秒和5分钟和10分钟的同位素峰的双峰分布，表明蛋白质的两个群体观察到的，一个群体相似的ATP结合的状态和第二类似于核苷酸自由状态。在30分钟没有和ATP之间并不存在差异是观察。双峰分布很可能是由ATP水解，并通过核苷酸的无状态过渡，在这种蛋白质片段更高的灵活性造成的。这些光谱类似于经典EX1交流的regi我，B，同位素峰脉冲标记HX实验双峰分布。E.杆菌 Hsp90的孵育在没有ATP或在ATP的存在下进行10-300秒，随后在D 2 O中所指示的脉冲标记为10秒（从22 图4A取的数据）。双峰分布再次表明分子的两种共存种群，一个用于氘核交换更迅速的酰胺质子比其他。 ATP诱导的快慢速交换过渡到慢交换的构象。
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Discussion
一个互动的合作伙伴，一个蛋白质的结合不可避免地导致对结合位点的改变溶剂可及性。此外，许多蛋白进行结合后的动态构象变化，从而影响其他区域比实际的结合界面。 HX-MS是一种可靠的方法来监测这些变化，甚至能够在时间尺度是其他方法不能覆盖揭示蛋白质构象变化的。
为了成功执行HX-MS三点是关键：1）一个最佳的系统设置; 2）指定肽谱和解释结果时，精确的执行来样加工及3）仔细的数据分析。
系统设置
因为质谱法用于检测氘核掺入肽，对于样品的制备同样的预防措施申请HX-MS分析。洗涤剂，盐和其他化合物与质谱抄干扰ULD被避免或删除分析之前。而HX-MS允许大蛋白复合物的分析，较高的复杂性要求肽的分离和质谱的质量提高。色谱条件优化的关键是获得高质量的数据。这涉及到高品质的有机溶剂的选择，反相材料以及梯度和溶剂的优化。与有机溶剂的列可以洗涤实验和隔夜之间进行，以减少背景信号。质谱方法应该检测消化性溃疡肽（300-1,200米/ Z之间）进行优化。高分辨率质谱仪大大方便数据分析，因为部分重叠的同位素峰簇从不同肽原可以被区分开来。
样品的处理是用于HX-MS至关重要。通常我们的缓冲器，并将样品离心沉降10分钟，在13,000 rpm（离心）除去凝集和分区CLES。此外，一些在线过滤器可以安装在HPLC系统，以防止柱的堵塞。 D小调偏差2 O孵育时间可以有很大的影响。对于非常灵活的蛋白质地区只有几秒钟的差异可以使没有氘核结合在一切，全氘化之间的差异。因为蛋白动力学以及本征汇率是温度的函数，样品和缓冲液的培养是紧紧温度控制。有利的是始终重复的步骤的确切顺序为每一个实验。如果正确执行两个实验之间的误差会比较小。今天，是自动化系统HX-MS市售，减少样品处理的挑战。
数据的分析
在HX-MS最关键的一步是分析数据，肽谱，特别是分配和决心氘水平。钍HX-MS电子输出是含肽谱了大量的色谱梯度的洗脱曲线。运营商的任务是将这些频谱分配给协议的第6步中确定MS / MS肽）。这可能有点困难，因为光谱可以向更高的M / Z HX后显著转变。还光谱部分重叠可能复杂化肽的分配。在这种情况下，使用高分辨率质谱仪具有较高的质量准确度不负有心人，因为他们往往能解决重叠肽。在氘掺入的差异是基于肽谱的质心来计算。质心可确定：1）手动标记肽谱的每一个同位素峰和转让其值的强度和m / z到电子表格程序（ 例如 Excel，微软）和计算质心或2）软件设计来分配的同位素峰属于所识别的肽，并计算质心自动（ 如 HDExaminer，塞拉利昂Analytics（分析）或HeXicon 24,25）。
HX-MS的优化
如果评估的肽的数量太低，还有其他几种可能性来优化实验：1）优化色谱法（梯度的溶剂，长度/形状，使用不同的反相材料）或2）改变的酶裂解蛋白质（可选择的蛋白酶，长/短潜伏期的时间与胃蛋白酶，除变性剂对淬火缓冲区）。这两个参数改变肽的溶出行为，因为他们要么改变肽池本身或HPLC分离。这两种优化方法来在有必要重新定性肽的价格。其它蛋白酶会产生必须由MS / MS鉴定和如在步骤6.6中所述特征的不同肽）。改变色谱条件不会改变肽游泳池，但保留TI各个肽的MES。然后保留时间必须被重新确定为在步骤6.5）。它应该提到的是更高的保留时间总是会降低检测的标记的量作为背面交换增加更长的保留时间。数据到100％控制的正常化处理回交流的最佳方式。高靠背交换导致的损失纳入氘核，因此信号。强烈建议，以减少背部交换量降到最低。应当指出，不同的HX-MS的设置将有回交换的发散率，这取决于硬件，使用的缓冲液和溶剂的组合物，以及用于26梯度的类型。
解读数据
在分析数据时，需要的同位素峰的强度分布进行仔细评估，因为它可以给指征的交流机制。肽质量为少比的未交换样品的同位素峰2000沓的强度一般是不对称的单同位素或第一高级同位素峰的强度更高。对于EX2交换制度这种不对称的强度分布变得高斯状随时间在D 2 O中，增加移位到更高的M / Z和的同位素簇的增加了约50％（ 图7）的宽度。如在引言中提到EX2是最常用的HX-MS观察到的天然条件下和交换所观察到的速率正比于平衡展开的常数K u和因此对蛋白质的热力学稳定性。与此相反，对于EX1交换机制的同位素簇的增加显著和双峰或多峰的强度分布的宽度分布被观察到（参见图7）25,27。双峰同位素分布总是指示两个或更多的不同分子种类在分析中，它们是潜在的有趣。然而，有两种类型的缺陷。首先，同位素簇可以由峰从两个不同肽原的。因此，它是强制性检查未交换样品的光谱肽具有类似M / Z和相同的电荷。这些肽通常在保留时间略有不同，并且同位素峰的强度分布与洗脱时间而变化。在高分辨率质谱仪，不属于相同的肽同位素峰也可以通过在m / z值的小数区分。第二，从先前HPLC-MS运行夹带观察28。比如结转显示为nonexchanged种，可通过空白HPLC梯度运行分析运行之间被淘汰。有很多原因，显然EX1的汇率制度。 1）在变性剂EX1的存在HX实验经常观察29。 2）自发或诱发，可逆或不可逆禄人或全球展开的蛋白质会导致EX1行为7,30,31。 3）构象转变是缓慢的，因为相比于引起如基底周转HX，ATP水解导致双峰同位素分布类似于EX1交换机制（ 图7a）22。 4）在脉冲标记实验配体诱导的缓慢的构象转变也表现出EX1状签名（ 图7b）22。
获得的数据的解释是，最终是什么让HX-MS这样的挑战，但也是强大的技术。蛋白质动力学的广博的知识是需要得到所有的方式，从观察到的保护/去保护模式，以蛋白质动力学的机理模型。尽管如此，生产高品质的HX-MS数据可以相对短的时间内完成，并且是高度可重复的。数据的解释显然得益于对蛋白质投资结构的任何其他信息igated。在另一侧，HX-MS可以指示哪个蛋白质的部分是灵活的，它可能必须被移除，以方便结晶结构测定。
HX-MS是一种方法，该方法大大利润创新质谱法和色谱法。最近的进展HX-MS是利用脂质奈米圆盘的膜蛋白的分析进一步拓宽了使用这种技术32。还利用电子转移解离（ETD）和电子捕获解离（ECD）显示出强劲的潜力HX-MS，因为它增加注册成立氘核的分辨率的单个氨基酸11,12 33的水平。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢M.百胜对稿件的意见。该项目是由德意志研究联合会（SFB638和MA 1278/4-1到MPM，与集群卓越：CellNetworks EXC一分之八十一）。 MPM是卓越的集群调查：CellNetworks。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| maXis QTOF | Bruker | ||
| nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
| Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
| 6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
| Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
| Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
| Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
| Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
| Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
| Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
| Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
| Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
| Tubing (various diameters) | IDEX | ||
| Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
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