Summary
Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.
Abstract
Alle cellulaire processen afhankelijk van de functionaliteit van eiwitten. Hoewel de functionaliteit van een bepaald eiwit is het rechtstreekse gevolg van de unieke aminozuursequentie wordt alleen gerealiseerd door het vouwen van de polypeptideketen tot een gedefinieerde driedimensionale opstelling of meer algemeen in een ensemble van interconverting conformaties. Onderzoek naar het verband tussen eiwit conformatie en functionaliteit is dus essentieel voor een volledig begrip van hoe eiwitten in staat zijn hun grote verscheidenheid aan taken vervullen. Een mogelijkheid om vormveranderingen een eiwit ondergaat tijdens het doorlopen van de functionele cyclus te bestuderen waterstof-1 H / 2 H-uitwisseling in combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie (HX-MS). HX-MS is een veelzijdige en robuuste methode die een nieuwe dimensie toevoegt aan structurele informatie verkregen door bijvoorbeeld kristallografie. Het wordt gebruikt om eiwitten te bestuderen en uitklappen binding van kleine molecule liganden, eiwit-eiwit interacties, conformationele veranderingen in verband met katalyse enzym en allosterie. Bovendien wordt HX-MS vaak gebruikt wanneer de hoeveelheid eiwit zeer beperkt of kristallisatie van het eiwit niet haalbaar. Hier bieden wij een algemeen protocol voor het bestuderen eiwitdynamica met HX-MS en beschrijven als een voorbeeld hoe de interactie grensvlak van twee eiwitten in een complex te onthullen.
Introduction
Het aantal kristalstructuren van eiwitten en eiwitcomplexen afgelopen jaren snel gestegen. Zij presenteren waardevolle momentopnamen van de structurele organisatie van deze eiwitten en vormen een basis voor de structuur-functie analyse. De dynamiek van eiwitten en conformationele veranderingen, die essentieel zijn voor hun functies, zelden onthuld door röntgenkristallografie. Cryo-elektronenmicroscopie, daarentegen, kan eiwitten en eiwitcomplexen vangen in verschillende conformaties, maar algemeen niet beneden oplossen conformationele veranderingen in secondaire structuur niveau 1. Conformationele dynamica van eiwitten in oplossing bij atomaire gegevens kunnen alleen worden opgelost door NMR, maar deze methode is gelimiteerd tot eiwitten relatief kleine grootte (gewoonlijk ≤ 30 kDa) en heeft hoge concentraties van eiwitten (≥ 100 uM), die experimenten belemmert met oligomerisatie of aggregatie gevoelig eiwitten 2. Een methode dieis in staat om een brug tussen hoge-resolutie X-ray kristallografie en cryo-elektronenmicroscopie en die wordt niet beperkt door proteïne grootte of concentratie amide waterstof-1 H / 2 H-uitwisseling (HX) in combinatie met massaspectrometrie (MS). De laatste jaren methode ontwikkeld om een waardevol analytisch instrument voor de analyse van eiwit dynamica, eiwitvouwing, eiwitstabiliteit en conformatieveranderingen 3-5. De moleculaire basis van deze methode is de labiele aard ruggengraat amide waterstof in eiwitten, die wisselen met deuterium atomen wanneer het eiwit in een D2O oplossing. De latere toename van eiwitmassa loop van de tijd wordt gemeten met een hoge-resolutie MS.
Kortom ongestructureerde peptiden HX alleen afhankelijk van de temperatuur, katalysatorconcentratie (OH -, H 3 O + dwz pH, zie figuur 3) en aminozuur-zijketens van aangrenzende residuen door inductieve, katkatalytische en sterische effecten. Deze effecten op de intrinsieke chemische wisselkoers k ch zijn elegant gekwantificeerd door Bai et al.. 6 en een programma beschikbaar is (met dank Z. Zhang), die k l berekent voor elk aminozuur in een polypeptide afhankelijk van pH en temperatuur. Bij neutrale pH en omgevingstemperaturen k l ligt in de orde van 10 1 -10 3 sec -1. In opgevouwen eiwitten HX kan 2-9 ordes van grootte trager vooral door waterstofbinding in de secundaire structuur en in mindere mate door beperkte toegang gehydrateerde OH - ionen om het interieur van een strak gevouwen eiwit. HX in natieve eiwitten impliceert dus gedeeltelijke of globale ontvouwen, chemische uitwisseling en opnieuw vouwen om de natuurlijke toestand volgens vergelijking (1) en de waargenomen wisselkoersen k obs afhangen van de opening tarief k op, de slotkoers k cl en de intrinsieke chemische uitwisseling rate k ch volgens vergelijking (2).
Onder natuurlijke toestand omstandigheden k op veel kleiner is dan k l en kan worden verwaarloosd in de noemer. Er zijn twee extreme uitwisseling regimes genoemd EX1 en EX2. Als de k cl is veel kleiner dan k l (EX1) is het waargenomen aantal is nagenoeg gelijk aan de opening tarief en HX staat directe observatie van het ontvouwen van een structureel element. Een dergelijke uitwisseling regime, waar alle amide protonen uitwisseling in een keer bij het openen van het structurele element, is gemakkelijk in MS door een bimodale verdeling van de isotoop pieken 7. Als k cl veel groter is dan k l (EX2) de waargenomen evenredig is met k ch waarbij de evenredigheidsconstante is gelijk aan het vouwen ontvouwen evenwichten k u = k op cl. Onder deze omstandigheden veel openen en sluiten gebeurtenissen nodig voordat alle amide protonen ruil voor deuteronen, leiden tot een geleidelijke stijging van de gemiddelde massa terwijl de isotopische verdeling blijft ongeveer gelijk. Het regime EX2 maakt de bepaling van de vrije energie van ontvouwing ΔG u en derhalve de stabiliteit van een constructiedeel. Onder natuurlijke toestand staat de EX2 regime is het meest gebruikelijk. Verhoging van de pH en de toevoeging van chaotrope middelen kan de uitwisseling mechanisme verschuiven naar EX1. Daarom kan HX-MS worden gebruikt thermodynamische staand en kinetische parameters van eiwitvouwing en conformatieveranderingen.
Zoals hierboven vermeld HX intrinsiek pH en temperatuur afhankelijke en uitwisseling halfwaardetijd van een geheel aan oplosmiddel blootgestelde proton van de hoofdketen amidegroep tussen 5-400 msec bij fysiologische pH (pH 7,6) en 30 ° C, maar 10 minuten naar> 15 uur met een gemiddelde van> 2 uur bij pH 2,9 en 0 °C (behalve het proton van de eerste ruggengraat amidebinding van een polypeptide, die wisselt met een halfwaardetijd van ca.. 1-2 min). Onder dergelijke trage uitwisseling omstandigheden is het mogelijk om het monster te verteren met proteasen (bijv. pepsine) die actief zijn onder deze omstandigheden, met uit verlies van alle in de opgenomen deuteronen gegevens. Sinds de introductie van peptische digestie onder langzaam uitwisselen omstandigheden kan niet alleen de totale HX kinetiek van full-length eiwitten geanalyseerd maar HX kan worden gelokaliseerd op specifieke gebieden 8,9. Ruimtelijke resolutie is momenteel beperkt tot de omvang van de peptische fragmenten, die in het algemeen tussen 10-30 residuen. Kan echter overlappende fragmenten te wijten aan de niet-specifieke aard van splitsing in pepsine tot een toename van ruimtelijke resolutie. Bovendien werden verscheidene andere proteasen actief bevonden onder quench omstandigheden echter veel minder efficiënt dan pepsine 10. Verdere increase van ruimtelijke resolutie kan worden bereikt door versnippering van peptiden in de gasfase door methoden die de deutereringsgraad patroon zoals electron capture dissociatie (ECD), elektron overdracht dissociatie (ETD) en infrarood multiphoton dissociatie (IRMPD) 11-13 bewaard. Deze technieken Teneinde het verlies van ruimtelijke resolutie door intramoleculaire proton migratie ("scrambling"), die wordt waargenomen door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) de meest gebruikte techniek fragmentatie. Deze werkwijzen vereisen optimalisatie voor elke individuele peptide en is dus nog steeds zeer uitdagend.
HX-MS is gebruikt om eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties van virale capside assemblage 14-17 analyseren. Eiwit ontvouwen en opnieuw vouwen en de temperatuur geïnduceerde conformationele veranderingen werden onderzocht 7,18,19. Fosforylering en enkel aminozuur-mutatie-gerelateerde conformatie verandert 16,20 en nucleotide-geïnduceerde veranderingen werden geanalyseerd 21,22. Daarom lijkt deze methode bij uitstek geschikt voor montage en dynamica van moleculaire machines te analyseren. Een aantrekkelijke kandidaat, wiens mechanisme is van groot algemeen belang, is de Hsp90 chaperonne complex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Buffers en eiwitmonsters
- Bereid H2O buffer. Gebruik Hsp90 standaard buffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) en H2O buffer.
Opmerking: Als het monster werd gedialyseerd voor de analyse, gebruik maken van de dialysebuffer als H 2 O-buffer. Het is essentieel dat de D2O buffer verschilt van het H2O buffergeheugen in de waterstofisotopen. Vluchtige buffers zoals NH4 CO 3 of NH4-acetaat buffer of componenten zijn niet geschikt! - Bereid D 2 O buffer door vriesdrogen van Hsp90 standaard buffer met een stofzuiger concentrator. Na volledige verdamping van H2O commentaar zuiver D2O de buis naar de oorspronkelijke totale hoeveelheid (bijv. 1 ml buffer met 15% glycerol vereist de toevoeging van 850 pl D 2 O) te bereiken. Herhaal de volledige verdamping van de buffer en los de buffer / zout comcomponenten in D2O 2x.
- Bereid afschrik buffer (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2).
Opmerking: Om de efficiëntie van peptische digest van zeer stabiele eiwitten 4 M guanidinehydrochloride en 0,5 M Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP-HCl) kan worden toegevoegd verbeteren. - Bereid 100% controle monster (6 M guanidinehydrochloride, D 2 O). Voeg guanidine hydrochloride een Hsp90 monster tot een eindconcentratie van 6 M bereikt verdampen H2O uit het monster en voeg D2O de buis de aanvankelijke totale volume (bijvoorbeeld 100 gl monster bereikt met 10% glycerol vereisen de toevoeging 90 pl D2O). Herhaal de volledige verdamping van de buffer en los de buffer / zoutcomponenten in D 2 O.
Opmerking: 20-100 pmol monster voor elke injectie. Bereid genoeg monster met een controlegroep van 100% voor elke dag van de HX-MS experimenten. - Bereid 50 pmol Hsp90 in 5 pi Hsp90 standaard buffer.
Opmerking: Een hoeveelheid van 20-100 pmol monster voor elke bijzondere ruwe data. De hoeveelheid monster in de reactie 1-5 pl ideaal. Pas de concentratie aan deze eisen past. Elke buffer kan, zolang het geen oplosmiddelen of vluchtige bestanddelen bevatten worden gebruikt.
2. Preparaat van geïmmobiliseerde Pepsin op Aldehyd Activated Beads
- Los 80 mg verse pepsine in 2 ml 50 mM natriumcitraat (pH 5).
- Los 20 mg natriumcyanoboorhydride, voorzichtig behandelen (zeer giftig!) In 1 ml 2 M Na 2 SO 4 en voeg toe aan pepsine oplossing.
- Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder zachtjes roeren (bijv. overhead shaker).
- Voeg 600 mg parels geïmmobiliseerde aldehydegroepen aan het mengsel en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2,2 ml van 2 M Na 2 SO4 (pH 5) in 100 ul porties elke 3 min dan een uur langzaam zout uit de pepsine. Meng het monster voorzichtig tussen toevoegingen in een overhead-schudder bij kamertemperatuur.
- Incubeer de pepsine kralen bij 4 ° C gedurende 14-16 uur / 's nachts in een overhead shaker.
- Blus de reactie door toevoeging van 1 ml 1 M ethanolamine en incubatie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Spin down de kralen in een 50 ml falcon buis bij 500 rpm, de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de kralen in 0,1% mierenzuur. Herhaal deze stap 2x. Na de laatste centrifugatiestap, gooi supernatant en raming volume van kralen. Voeg een gelijk volume van 0,1% mierenzuur en bewaar bij 4 ° C.
3. Voorbereiding van Kolommen voor amide Waterstof-uitwisseling
- Gebruik guard kolom met een binnendiameter van 1 mm voor het vangen kolommen en van 2 mm voor pepsine kolommen.
- Schroef de ene kant van de kolom bewaker en verwijder het filter. Schroef verpakking funnel op het open uiteinde van de kolom. Gebruik van een 1/16 inch adapter en slang een lege injectiespuit (5 ml) tegen de onderkant uitlaat van de kolom. Zorg ervoor om het gasdicht vast aan de kolom bewaker.
- Breng enkele druppels suspensie rupsmateriaal boven de trechter. Trek de zuiger van de spuit aan de slurry te zuigen door de trechter in de kolom bewaker. Solliciteer meer drijfmest kraal materiaal op de trechter en de procedure voortzetten totdat de kolom bewaker volledig is gevuld met kraal materiaal. Verwijder de trechter en plaats filter en filter ring op het open einde. Schroef de kolom dop op de kolom bewaker en verwijder de spuit van de andere kant. Sluit beide uiteinden van de wacht kolommen met pluggen om uitdroging van kolom materiaal te voorkomen.
4. Het opzetten van het systeem voor de Hydrogen Exchange massaspectrometrie (HX-MS)
- Sluit de kolom val met de HPLC (figuur 1). Equilibreer de kolom door de stroomsnelheid vanEen pomp met 0,4 ml / min met 0,1% mierenzuur als oplosmiddel. Laat de kolom pepsine noch de analytische kolom nog niet aan.
- Kalibreer de massaspectrometer en sluit de uitlaat van de HPLC naar de bron van de massaspectrometer.
5. Bepaling van het dynamisch bereik van Exchange
- Bereid ultrazuiver oplosmiddel A (0,1% mierenzuur in water) en ultrazuiver oplosmiddel B (0,1% mierenzuur in acetonitril), klaar gemengde oplosmiddelen zijn commercieel verkrijgbaar. Spoel de HPLC pompen. Stel de chromatografie en massaspectrometrie methoden in de besturingssoftware uitgesproken door een programma met een stapsgewijze gradiënt na een korte ontzoutingsstap. Voor full-length Hsp90 gebruik een 1-2 min. ontzoutingsstap gevolgd door het inschakelen van de 6-wegklep van ontzouten / LOAD elueren en een stap gradiënt van 90% oplosmiddel A/10% oplosmiddel B tot 5% oplosmiddel A/95% oplosmiddel B. Voordat injectieset de injectieklep te laden en de 6-wegklep naar / VULLEN positie ontzouten.
Noot: Gebruik een pepsine of analytische kolom tijdens dit experiment niet te gebruiken. - Bereid 100-200 pmol Hsp90 in 1-10 ui H2O buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij 30 ° C. Voeg temperatuur aangepast D 2 O-buffer aan het monster volume tot 100 ul brengen en incubeer precies voor een bepaalde periode (bijv. 10 sec, 100 sec, 1000 sec). Voeg 100 ul afschrik buffer en meng door en neer te pipetteren. Injecteer 200 ui monster in de injectiepoort van de injectie ventiel met een Hamilton spuit. Start het chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / VULLEN te elueren. Herhaal dit voor ten minste drie tijdstippen.
- Herhaal stap 5.2 maar voeg 2-3x overmaat Sti1 de Hsp90 monster voor incubatie gedurende 10 minuten bij 30 ° C.
- Bepaal het eiwit van volledige lengte massa door deconvolutie van spectra in de massaspectrometrie software. Bereken het aantal incorporated deuteronen door het vergelijken van het molecuulgewicht van volledige lengte Hsp90 met de waargenomen massa na elke run (bijv. 10 sec, 100 sec, 1000 sec).
- Teken de opgenomen deuteronen voor Hsp90 in afwezigheid en aanwezigheid van Sti1 (y-as) versus tijd (x-as). Bepaal het tijdpunt in het dynamische bereik waar het verschil tussen beide curven maximaal. Gebruik deze waarde voor de incubatietijd in D 2 O bij het identificeren van Hsp90-Sti1 interface en dynamiek op peptide-niveau.
6. Bepaling van Peptic Peptiden behulp van MS / MS-spectra
- Sluit de kolom pepsine en analytische kolom systeem.
- Stel de parameters voor de chromatografie en massaspectrometrie in de besturingssoftware door te kiezen gradiënt aard en gewicht methode spectrometrie. Kies een steile helling (bv. meer dan 90 min) om een goede chromatografische resolutie te garanderen. Enable MS / MS-spectra van de massaspectrometer.
Opmerking: Goede resolutietie op de HPLC en hoge nauwkeurigheid massa hebben hoogste prioriteit in deze stap. - Bereid 100-200 pmol Hsp90 in 100 pl H2O buffer. Voeg 100 ul afschrik buffer en meng door en neer te pipetteren. Injecteer 200 ui monster in de injectiepoort van de injectie ventiel met een Hamilton spuit. Start het chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren.
Opmerking: Als er meerdere eiwitten in HX-MS (bijvoorbeeld eiwit-eiwit interactie interfaces) te analyseren de peptiden voor elk eiwit individueel worden bepaald. - Identificeer peptische peptiden van Hsp90 door te zoeken op een databank (dwz Mascotte) voor de resulterende peptiden.
Opmerking: Het is mogelijk om een aangepaste database als het doel is om zoveel ulcus peptiden bepalen mogelijk en analyse uitgevoerd met gezuiverd eiwit. Zuiverheid van het monster zal have rekening worden gehouden. - Herhaal deze stap zonder MS / MS en het verloop dat wordt gebruikt voor de eigenlijke HX experiment. Voor Hsp90 en Sti1 gebruik een 10 min. gradiënt van 90% oplosmiddel A/10% oplosmiddel B tot 45% oplosmiddel A/55% oplosmiddel B.
Opmerking: Hellingen zijn doorgaans tussen 5-15 min en zijn sterk afhankelijk van de complexiteit monster en HX systeemspecificaties. - Bepaal de retentietijden van de ulcus peptiden geïdentificeerd in 6.4 in het verloop gebruikt in 6.5 en maak een lijst toe met 1.) Peptide sequentie 2.) Peptide laadtoestand en 3.) Retentietijd. Dit wordt gebruikt om elke peptide identificeren na HX experimenten.
Opmerking: Wees ervan bewust dat peptiden met kleine m / z verschillen, identiek laadtoestand en identieke retentietijd een bron van onduidelijkheid kan zijn.
7. Identificatie van eiwit-eiwit interactie Interfaces
- Stel de gradiënt en massa spectrometrie methode in de controle software. Gebruik een 10 min lineaire gradiënt van 90% oplosmiddel A/10% oplosmiddel B tot 45% oplosmiddel A/55% oplosmiddel B. Plaats een massaspectrometrie methode die is geoptimaliseerd voor de detectie van massa tussen 300-1.500 m / z, hoewel de meeste de peptiden zal onder 1000 m / z. Stel de injectie klep in LOAD positie, de 6-wegklep in LADEN / ontzouten Position. Stel het debiet van de laadpomp tot 0,4 ml / min.
Opmerking: De duur en aard van de gradiënt zijn monster afhankelijk en kan geoptimaliseerd moeten worden. Langere gradiënten verbeteren van de resolutie van de chromatografie, maar de integratie van deuteronen afnemen in eiwitten als gevolg van back-uitwisseling. De gekozen methode moet hetzelfde zijn voor alle experimenten worden vergeleken. - Voor de unexchanged referentie bereiden 20-100 pmol Hsp90 in 100 pl H2O buffer. Voeg 100 ul ijskoude afschrik buffer, pipet op en neer twee keer en injecteren monster in de injectieklep van de HPLC. Onmiddellijk beginnen de chromatografie programma en swjeuken de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren. Doe dit voor Hsp90 en Sti1 individueel en voor het mengsel van eiwitten.
- Bereid 20-100 pmol van Hsp90 in een volume van 1-5 pl. Voeg temperatuur aangepast D 2 O-buffer aan het monster volume tot 100 ul brengen en incubeer precies voor een bepaalde periode (bijvoorbeeld 30 seconden, want conformationele dynamica zie opmerking). Voeg 100 ul ijskoude buffer doof, pipet op en neer tweemaal snel en injecteer 200 ul in de inspuitklep van HPLC. Onmiddellijk beginnen de chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren. Doe dit voor elk eiwit afzonderlijk, aan het deuteron opname in elk peptide in afwezigheid van de interactie eiwit te bepalen.
Opmerking: Bij het bestuderen van de dynamiek van de conformational veranderingen, herhaal het experiment met verschillende incubatie tijd van Hsp90 in D 2 O buffer. Probeer een breed tijdsbestek te dekken door incubatie tijden kiezen logaritmisch (bijv. 10 sec, 30 sec, 100 sec, 300 sec, 1.000 sec, enz.). D 2 O-buffer en sample buffer moet precies gelijk zijn, behalve voor de waterstof-isotoop. - Bereid een gelijke hoeveelheid 100% controlemonster (20-100 pmol) en voeg D2O buffer om het monstervolume tot 100 ui te brengen. Voeg 100 ul ijskoude buffer doof, pipet op en neer tweemaal snel en injecteer 200 ul in de inspuitklep van HPLC. Onmiddellijk beginnen de chromatografie programma en schakel de injectie klep in INJECTEER positie. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren.
- Om de interactie oppervlak bepalen mengen Hsp90 met een minstens 2-voudige overmaat van Sti1 om het evenwicht op de gebonden toestand verschuiven (zie opmerking) en incubeerbij de gewenste temperatuur tot complexvorming in evenwicht. Voeg temperatuur aangepast D 2 O-buffer aan het monster volume tot 100 ul brengen en incubeer precies voor een bepaalde periode (bijvoorbeeld 30 seconden). Voeg 100 ul ijskoude buffer doof, pipet op en neer tweemaal en snel injecteren in de inspuitklep van HPLC. Na 2 min. schakelt de 6-wegklep van ontzouten / LADEN om de positie te elueren. Herhaal dit experiment met 20-100 pmol Sti1 en overmaat van Hsp90.
Opmerking: De absolute concentraties afhankelijk van de dissociatie evenwichtsconstante van de interactie. Idealiter na verdunning in D2O de concentratie van het eiwit in overmaat toegevoegd moet minstens 10x de KD (overeenkomend met> 85% van de onderste geconcentreerde eiwit gebonden). - Analyseer de verkregen gegevens met geschikte software en gebruik de retentietijden bepaald in stap 6.5 op elk peptide te vinden in de analyse. Berekeningte het zwaartepunt van de isotoop distributie voor de unexchanged proteïne (stap 7.2) en voor de HX experimenten (stap 7.3).
Opmerking: Hoewel de isotoop patronen van de uitgewisselde peptiden er anders uit dan hun unexchanged tegenhangers, zowel de kennis over de laadtoestand van de peptide en de hoge nauwkeurigheid van massa's van de massaspectrometer zorgt voor eenvoudige bepaling van de centroïden. - Vergelijk opname van deuteronen doelwiteiwit alleen en met overmaat bindingspartner. Dit kan automatisch gebeuren met commerciële software of handmatig met een spreadsheetprogramma. De 100% controlemonster waarden geven de maximale ruil voor elk peptide en kan worden gebruikt om de hoeveelheid D2O etiket verloren tijdens het experiment door terug wisselen bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hsp90 is een moleculaire chaperonne in gist en lid van de Hsp90 chaperonne familie. Door te gaan door middel van een complex ATPase cyclus het helpt laat inklapbare trap van veel eiwit klanten. Efficiënte vouwen vereist overdracht van cliënten van Hsp70 en interactie van de co-chaperonne Sti1/Hop. Sti1 direct bindt aan Hsp90 en faciliteert client binding door remming van Hsp90 de ATPase activiteit. Interactie van Hsp90 met Sti1 werd onlangs bestudeerd met behulp van HX-MS 23. Hier presenteren we representatieve resultaten van de onderliggende experimenten volgen van de bovenstaande protocol.
De directe interactie eiwit-eiwit werd onderzocht door het merken van het eiwit complex in evenwicht met D2O en vergelijken van de Sti1 peptide spectra in afwezigheid en aanwezigheid van Hsp90.The resulterende verschil perceel kan worden gezien in figuur 5A (gegevens 23). De peptiden worden gericht van boven naar beneden vanaf de N-terminus. Meestal peptiden inTPR2a en TPR2b tonen een sterke bescherming in aanwezigheid van Hsp90 (negatieve waarden voor D + Hsp90 - D-Hsp90), wat aangeeft dat deze regio's interactie met Hsp90. De bescherming TPR2a gemakkelijk worden gerationaliseerd de kristalstructuur van Sti1-TPR2a-TPR2b in complex met een peptide die de C-eindstandige MEEVD-motief van Hsp90 (figuur 5B). Een dergelijke duidelijke bescherming eiwit-eiwit interacties niet altijd waargenomen. De bescherming Hsp90 in aanwezigheid van Sti1 is minder uitgesproken en niet als gelokaliseerd als in Sti1 (figuren 5C en 5D). Alle peptiden tonen licht gestegen bescherming tegen deuteron incorporatie in aanwezigheid van Sti1. Sti1 uiteraard stabiliseert Hsp90 wereldwijd als geen gebied van het eiwit geeft meer flexibiliteit bij aanwezigheid van Sti1. We kunnen echter niet onderscheiden indien deze verminderde deuterium opneming afkomstig van directe interactie met Sti1 of via allosterische effecten op de conformatievan Hsp90. De verkregen informatie beperkt de mogelijke interactie site enkele peptiden (bijv. peptide 43-62 van NBD). Aanvullende experimenten zoals verknoping worden vaak gebruikt om de bindingsplaatsen na HX-MS 23 te bevestigen. Van de nota, wordt de volgorde dekking van Hsp90 afgenomen bij het meten van de Hsp90-Sti1 complex. Sinds Sti1 in 3,5-voudige overmaat werd toegevoegd het theoretische totale bedrag van peptiden in de analyse was een viervoudige hoger dan bij Hsp90 alleen. Dit verhoogt het risico van Sti1 peptiden overschaduwen of overlappende Hsp90 peptiden tijdens de analyse. Te optimaliseren voor hogere reeks dekking beter chromatografische scheiding lijkt de meest veelbelovende aanpak zijn.
Een mogelijkheid om de dynamiek van verschillende eiwitgebieden onderzoeken is het gebruik van continue labeling HX-MS. Het gaat om de incubatie van geëquilibreerd eiwit monster in D2O voor verschillende perioden en daarom maakt voorspellingen over de stabiliteit vanindividuele eiwit segmenten. Figuur 6 toont de spectra van peptide 43-62 van de NBD van Hsp90 in aanwezigheid en afwezigheid van een 3,5-voudige overmaat Sti1. De incubatietijd werden gekozen op een logaritmische schaal (10 sec, 100 sec en 1,000 sec) om een goede dekking te krijgen over een breed tijdvenster. De peptide spectra een tijdsafhankelijke opname van deuterium in het eiwit die toeneemt langere incubatietijden. Voor peptide 43-62 uitwisseling volgt de EX2 mechanisme waar de k int << k cl. De mate van bescherming verandert gedurende de incubatietijd, die het grote verschil op kortere incubatietijd en bijna gelijk wisselkoers op de langste tijd punt. Dit duidt op een lagere graad stabilisatie of een regio van dynamische interacties met frequente dissociatie en reassociatie. Of de waargenomen bescherming vanwege een algemene daling koers van amide protonen in de peptide of het effect kan worden toegewezen aan een of tweespecifieke amide protonen die langzamer wisselen in aanwezigheid van Sti1. In dit geval is de laatste veel waarschijnlijker als Hsp90 kristalstructuur geopenbaard regio blootgestelde lus in plaats van een gewone secundaire structuur zoals α-helices en β-platen zijn.
Het is belangrijk te vermelden dat de achterkant telefooncentrale niet afgetrokken van de getoonde impliceert dat de waargenomen effecten meer uitgesproken zal zijn wanneer genormaliseerd op 100% controlegegevens.
Figuur 1. HPLC opstelling voor HX-MS. a) Typische configuratie van een HX-MS opstelling. De verschillende gekleurde gebieden vertegenwoordigen secties waarin een verschillende temperatuur. Het monster wordt geïnjecteerd in de monsterlus van het injectieventiel (in LOAD modus cyaan) en na het schakelen van de klep in 'injecteren mode "(zwarte) gepomptde kolom pepsine in de 6-wegklep. De kolom pepsine wordt gehandhaafd op ongeveer 10 ° C tot enzymatische activiteit van pepsine verbeteren. De 6-weg klep heeft twee modi, "Laden / Ontzouten Mode" en "Elueren Mode" (zie b). Na ontzouten van het monster de peptiden chromatografisch gescheiden met een acetonitril gradiënt op een analytische omgekeerde fase kolom. De peptiden worden vervolgens gesproeid in de massaspectrometer met een ESI-bron. B) Wijzen van de 6-wegklep. Direct na HX de 6-wegklep is in "laden / Ontzouten Position" om de vangst van de ulcus peptiden op de kolom te houden. Dit wordt gedurende maximaal drie minuten zouten of verbindingen van de reactie buffers die kunnen interfereren met massaspectrometrie verwijderen. Hierna wordt de klep schakelaars 6-poort in "elutiemethode" steeds de geladen val kolom in de stroomweg tussen gradiëntpomp en analytische kolom. De gevangen ulcus peptiden nu elueren uit de val column en wordt gescheiden in een gradiënt van 0,1% mierenzuur acid/0.1% mierenzuur in acetonitril.
Figuur 2. Flow schema van een HX experiment. 1) Target eiwit zonder schoonmaakmiddel gezuiverd en in standaard buffers geleverd. 2) Het eiwit enzymatisch gedigereerd met pepsine en peptische peptiden worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door tandem massaspectrometrie (MS / MS). Pas na het verkrijgen van sequentie laadtoestand en retentietijd van zoveel peptiden mogelijk HX-MS succesvol kan worden uitgevoerd. 3) De experimentele omstandigheden zijn opgezet zoals incubatie van het eiwit onder specifieke omstandigheden (toevoeging van ligand / chemische verbinding of verandering in temperatuur of pH. 4) HX wordt uitgevoerd door het monster te verdunnen 1:10 of hoger in D2O buffer . De D 2 O-buffer moet identiek zijn aan het monster buffer zijn om avoid buffer effecten. Vervolgens wordt het monster precies gedurende een bepaalde periode. 5) Na incubatie wordt de reactie afgebroken en geïnjecteerd in het HPLC-MS systeem. Het monster enzymatisch gesplitst en de resulterende peptische peptiden gescheiden op een gradiënt organisch oplosmiddel en geïnjecteerd in de massaspectrometer. 6) Analyse van het verkregen peptide spectra. De hartlijnen van de peptide spectra vergeleken onder verschillende reactieomstandigheden. Dit kan handmatig worden gedaan met geschikte software of automatisch door een HX analyseprogramma.
Figuur 3. Waterstof uitwisselingsmechanisme. De reactie van waterstof uitwisseling kan gekatalyseerd worden door base-of zuur en daarom is pH-afhankelijk met een minimale koers tussen pH 2,5 en 3 afhankelijk van de zijketens van de residuen aan weerszijden van de amidebinding 6. During ontzouten en chromatografische scheiding van peptiden, die wordt uitgevoerd in H2O-bevattende oplosmiddelen, opgenomen deuteronen uitgewisseld terug voor protonen volgens hetzelfde mechanisme ("back uitwisseling"). Derhalve optimalisering van het systeem gebruikte oplosmiddelen is cruciaal voor het verlies van opgenomen deuteronen verminderen.
Figuur 4. Principe van HX-MS. Binding van een ligand aan het eiwit resulteert in bescherming van het amide ruggengraat waterstofatomen op de bindingsplaats van de omringende oplosmiddel. Dit vermindert de wisselkoersen van de getroffen protonen en vermindert de opname van deuteronen. Omdat het gewichtsverschil tussen proton en deuteron 1 Da, zullen peptiden afgeleid van deze regio van het eiwit lagere m / z in massaspectrometrie tonen. Vergelijking van de peptide spectra van de experimentenin afwezigheid en aanwezigheid van bindende partner zal een verschuiving van het zwaartepunt van de spectra tot m / z-waarden (bescherming evenement) verlagen onthullen. Regio's die prominent bescherming vertonen na toevoeging van een bindmiddel partner zijn potentiële bindingsplaatsen. Afhankelijk van de sequentie dekking en de beschikbaarheid van overlappende peptiden bindingsplaatsen kan worden teruggebracht tot enkele aminozuren.
Figuur 5. Interactie van Hsp90 en Sti1. een, verschil perceel van deuteron opname in Sti1 in aanwezigheid van bindende partner Hsp90 minus deuteron incorporatie in Sti1 in de afwezigheid van Hsp90 (gegevens van 23). b, Cartoon afbeelding van een fragment van Sti1 bestaande TPR2a en TPR2b (VOB code 3UQ3) in complex met een peptide dat de C-eindstandige MEEVD-motief van Hsp90 vertegenwoordigt. De cartoon is gekleurd volgensding tot het aantal protonen amide beschermd tegen deuterium incorporatie zoals aangegeven. c Verschil plot van Hsp90 in aanwezigheid van bindingspartner Sti1. Waargenomen deuterium bijmenging in Hsp90 na 10 minuten pre-incubatie met 3.5x overmaat Sti1 bij 30 ° C en 30 seconden; HX bij dezelfde temperatuur. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd en de standaardafwijking van het gemiddelde wordt weergegeven voor elk peptide. Global negatieve waarden geven een verminderde opname van deuteronen en dus hoger algehele stabiliteit van Hsp90 in aanwezigheid van Sti1. Terug uitwisseling is niet meegenomen in dit experiment. D, Cartoon voorstelling van gist Hsp90 (VOB code 2CG9) gekleurd volgens het aantal protonen amide beschermd tegen deuteron oprichting als vermeld in b. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 7. Voorbeelden voor peptide spectra met bimodale distribution. een, Deuteron opname in E. coli Hsp90 in de afwezigheid en aanwezigheid van ATP (gegevens uit 22 suppl. Figuur 3). Spectra peptide residuen 192-206 zijn zichtbaar voordat incubatie in D2O (0% D), na 30 seconden, 5 min, 10 min en 30 min incubatie in D2O, en de 100% controle (100% D) . Aangezien ATP (ATP) een typisch gedrag EX2 uitwisseling wordt waargenomen. In aanwezigheid van ATP (+ ATP) is een sterke bescherming waargenomen bij 30 s en 5 min en 10 min bimodale verdelingen van de isotopische pieken, wijst twee populaties van eiwitten, een populatie vergelijkbaar met de ATP gebonden toestand en een tweede soortgelijke de-nucleotide vrije staat. Op 30 min geen verschil tussen afwezigheid en aanwezigheid van ATP waargenomen. De bimodale verdeling wordt waarschijnlijk veroorzaakt door ATP hydrolyse en overgang door de nucleotide-vrije staat met een hogere flexibiliteit in dit eiwit segment. Deze spectra lijken op een klassieke EX1 uitwisseling regime. b, bimodale verdeling van isotopen pieken in pulse-labeling HX experimenten. E. coli Hsp90 werd geïncubeerd in de afwezigheid van ATP of in aanwezigheid van ATP 10-300 seconden en daarna puls-gemerkt gedurende 10 seconden in D2O aangegeven (gegevens uit 22 figuur 4A). De bimodale verdelingen dan weer twee naast elkaar bestaande populaties van moleculen, een uitwisseling sneller amide protonen voor deuteronen dan de andere. ATP veroorzaakt een langzame overgang van de snellere uitwisseling in de tragere uitwisseling conformatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Binding van een interactie partner aan een eiwit onvermijdelijk veroorzaakt veranderingen in solvent toegankelijkheid op de bindingsplaats. Bovendien zijn veel eiwitten ondergaan dynamische conformatieveranderingen na binding die andere regio beïnvloeden dan de werkelijke bindende interface. HX-MS is een robuuste methode om deze veranderingen te monitoren en is zelfs in staat om het openbaren van conformationele veranderingen in eiwitten op tijdschalen die andere methoden niet kunnen dekken.
Om succesvol uit te voeren HX-MS drie punten zijn cruciaal: 1) een optimaal systeem setup, 2) nauwkeurige uitvoering van monster verwerking en 3) een zorgvuldige analyse van gegevens bij het toekennen peptide spectra en het interpreteren van resultaten.
De systeeminstellingen
Aangezien massaspectrometrie wordt gebruikt voor het detecteren van de deuteron opname in de peptiden, dezelfde voorzorgsmaatregelen met betrekking tot monstervoorbereiding gelden voor HX-MS. Wasmiddelen, zouten en andere verbindingen die interfereren met massaspectrometrie should worden vermeden of verwijderd voordat de analyse. Terwijl HX-MS analyse mogelijk maakt van grote eiwitcomplexen, de hogere complexiteit vraagt verhoogde kwaliteit peptide scheiding en massaspectrometrie. Optimalisatie van de chromatografische omstandigheden is de sleutel tot het verkrijgen van gegevens van goede kwaliteit. Het betreft de keuze van de hoge kwaliteit organische oplosmiddelen, omgekeerde fase materiaal en optimalisering van hellingen en oplosmiddelen. Wassen van kolommen met organische oplosmiddelen kan worden gedaan tussen experimenten en 's nachts naar de achtergrond signaal te verminderen. Massaspectrometrie methoden moeten worden geoptimaliseerd voor de detectie van peptische peptiden (tussen 300-1,200 m / z). Hoge-resolutie massaspectrometers gegevensanalyse aanzienlijk vergemakkelijken doordat gedeeltelijk overlappende isotopische piek clusters uit verschillende peptiden kunnen worden onderscheiden.
De verwerking van de monsters is cruciaal voor HX-MS. Meestal onze buffers en monsters worden gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 13.000 rpm (microfugebuis) aan aggregaten en parti verwijderenkelen. Bovendien kunnen verschillende inline filters in het HPLC-systeem geïnstalleerd om verstopping kolommen voorkomen. Geringe afwijkingen in D 2 O incubatietijd kan grote gevolgen hebben. Voor zeer flexibel eiwit regio's een verschil van slechts een paar seconden kan het verschil maken tussen geen deuteron incorporatie bij allen en vol deuterering maken. Aangezien eiwitdynamica alsmede de intrinsieke koers zijn afhankelijk van temperatuur, incubatie van het monster en buffers zijn goed geïsoleerde. Het is voordelig om altijd herhaal de exacte volgorde van de stappen voor elk experiment. Indien correct uitgevoerd de fout tussen twee experimenten zal relatief klein zijn. Vandaag, automatische systemen voor HX-MS zijn commercieel verkrijgbaar en vermindering van de uitdagingen van het monster verwerking.
Analyse van gegevens
De meest cruciale stap in HX-MS analyse van de gegevens, met name de overdracht van peptide spectra en bepaling van deuterering niveaus. The uitgang van HX-MS is een elutieprofiel van de chromatografische gradiënt met een groot aantal peptide spectra. De operators taak deze spectra toewijzen aan de peptiden die door MS / MS in stap 6) van het protocol. Dit kan enigszins moeilijk zijn omdat de spectra aanzienlijk kan verschuiven naar hogere m / z wanneer HX. Ook de gedeeltelijke overlapping van spectra kan de overdracht van peptiden bemoeilijken. In dit geval is het gebruik van hoge-resolutie massaspectrometers met een hoge nauwkeurigheid van massa loont, omdat ze kunnen vaak overlappende peptiden lossen. Verschillen in deuteron incorporatie worden berekend op basis van de centroïden van peptide spectra. De centroïden kan worden bepaald: 1) handmatig door op iedere isotopische piek van een peptide spectrum en de overdracht van de waarden voor de intensiteit en m / z in een spreadsheet-programma (bijvoorbeeld Excel, Microsoft) en het berekenen van het zwaartepunt of 2) met software die is ontworpen om toe te wijzen de isotopische pieken die tot een geïdentificeerde peptide en berekenencentroïden automatisch (bijv. HDExaminer, Sierra Analytics of HeXicon 24,25).
Optimalisatie van HX-MS
Als het aantal evalueerbare peptiden te laag is, zijn er verschillende andere mogelijkheden om het experiment te optimaliseren: 1) het optimaliseren van de chromatografie (oplosmiddelen, lengte / vorm van de gradiënt, gebruik van verschillende omgekeerde fase materiaal) of 2) het veranderen van de enzymatische splitsing van het eiwit (alternatief protease, langer / korter incubatietijd met pepsine, toevoeging van denatureringsmiddelen om de demping buffer). Beide parameters het gedrag elutie van peptiden als ze ofwel weg peptideverzameling zelf of HPLC scheiding. Beide optimalisatie benaderingen komen op de prijs van de noodzaak om peptiden recharacterize. Andere proteasen zullen verschillende peptiden die moeten worden geïdentificeerd door MS / MS en gekarakteriseerd zoals beschreven in stap 6.6) te produceren. De chromatografie voorwaarden wijzigt, wordt het peptide zwembad, maar het behoud ti niet wijzigenmes van de afzonderlijke peptiden. De retentietijden moeten dan opnieuw bepaald als in stap 6.5). Opgemerkt moet worden dat hogere retentietijden altijd de hoeveelheid detecteerbaar label opnieuw af uitwisseling toe bij langere verblijfsduur. Normalisering van de gegevens aan de 100% controle is de beste manier om met terug uitwisseling. Hogerug uitwisseling leidt tot verlies van opgenomen deuteronen en dus het signaal. Het wordt sterk aanbevolen om de hoeveelheid terug-uitwisseling tot een minimum. Opgemerkt moet worden dat verschillende HX-MS opstellingen uiteenlopende percentages weer uitwisseling zal, afhankelijk van de hardware, de samenstelling gebruikte buffers en oplosmiddelen en het soort gradiënten die worden gebruikt 26.
Het interpreteren van de gegevens
Bij het analyseren van gegevens, de intensiteitsverdeling van de isotopische pieken moet zorgvuldig worden geëvalueerd omdat het aanwijzingen geven aan de uitwisselingsmechanisme. Voor peptiden met een massa van minderdan 2000 Da de intensiteiten van de pieken van de isotopische unexchanged monster algemeen asymmetrisch met hogere intensiteiten voor monoisotope of de eerste isotoop hogere piek. Voor de wissel-EX2 deze asymmetrische intensiteitsverdeling wordt Gauss-achtige met toenemende tijd D2O en toenemende verschuiving naar hogere m / z en de breedte van de isotopische cluster met ongeveer 50% (figuur 7). Zoals vermeld in de inleiding EX2 wordt meestal waargenomen bij HX-MS onder natuurlijke omstandigheden en het waargenomen aantal uitwisseling is evenredig met het evenwicht ontvouwen constante K u en derhalve de thermodynamische stabiliteit van het eiwit. Daarentegen, de EX1 wissel-breedte verdeling van de isotopische cluster aanzienlijk verhoogt en bimodale of multimodale intensiteitsverdelingen ontstaan (zie figuur 7) 25,27. Bimodale isotoop distributies geven altijd twee of meer verschillende molecuulin de analyse, die potentieel interessant. Er zijn twee soorten valkuilen. Ten eerste kan de isotoop cluster bestaat uit pieken afkomstig van twee verschillende peptiden. Het is daarom verplicht om de spectra van de unexchanged steekproef te controleren op peptiden met gelijkaardige m / z en identieke lading. Dergelijke peptiden verschillen meestal iets in retentietijd en de intensiteitsverdeling van de isotopische pieken varieert met de elutietijd. In hoge-resolutie massaspectrometers, kan isotopische pieken die niet behoren tot hetzelfde peptide ook worden onderscheiden door de decimalen van de m / z-waarden. Ten tweede, is overdracht van een vorige HPLC-MS run waargenomen 28. Een dergelijke overdracht verschijnt als nonexchanged soort en kan worden geëlimineerd door blanco HPLC-gradiënt loopt tussen analyse runs. Er zijn vele redenen voor schijnbare regime EX1 uitwisseling. 1) In HX experimenten in aanwezigheid van denatureringsmiddelen EX1 wordt vaak waargenomen 29. 2) Spontane of geïnduceerde, omkeerbare of onomkeerbare local of globale ontvouwen van eiwitten veroorzaakt EX1 gedrag 7,30,31. 3) Conformationele overgangen die langzaam in vergelijking met HX veroorzaakt door bijvoorbeeld substraat omzet zijn, ATP hydrolyse veroorzaken bimodale isotoop distributies lijkt EX1 uitwisseling regime (figuur 7a) 22. 4) ligand-geïnduceerde langzame conformationele overgangen in pulse-labeling experimenten ook een EX1-achtige handtekening (figuur 7b) 22 vertonen.
De interpretatie van de verkregen gegevens is uiteindelijk wat maakt HX-MS zo'n uitdagend maar ook krachtige techniek. Een brede kennis van eiwitdynamica is nodig om de hele weg te krijgen van de waargenomen bescherming / verwijdering van de bescherming patronen om een mechanistisch model van eiwitdynamica. Toch kan het produceren van hoge kwaliteit HX-MS-gegevens worden gedaan binnen relatief korte tijd en is zeer reproduceerbaar. De interpretatie van de gegevens duidelijk profiteert van eventuele aanvullende informatie over de structuur van het eiwit te investerenigated. Anderzijds kunnen HX-MS aangeven welke delen van een eiwit zijn flexibel en kan moeten worden verwijderd om kristallisatie te structuurbepaling vergemakkelijken.
HX-MS is een methode die sterk profiteert van innovaties in massaspectrometrie en chromatografie. Een recente vooruitgang in HX-MS is het gebruik van lipide nanodiscs voor de analyse van membraaneiwitten die verder verbreedt het gebruik van deze techniek 32. Ook het gebruik van elektron transfer dissociatie (ETD) en electron capture dissociatie (ECD) tonen een sterke potentieel voor HX-MS als het verhoogt de resolutie van opgenomen deuteron tot het niveau van enkele aminozuren 11,12 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken M. Boysen voor commentaar op het manuscript. Dit project werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 en MA 1278/4-1 te MPM en Cluster of Excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM is onderzoeker van de Cluster of Excellence: CellNetworks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| maXis QTOF | Bruker | ||
| nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
| Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
| 6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
| Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
| Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
| Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
| Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
| Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
| Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
| Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
| Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
| Tubing (various diameters) | IDEX | ||
| Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
- Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
- Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
- Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
- Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
- Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
- Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
- Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
- Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
- Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
- Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
- Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
- Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
- Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
- Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
- Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
- Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
- Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
- Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
- Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
- Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
- Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
- Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).
