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Chemistry

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l'hydrogène change spectrométrie de masse

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Abstract

Tous les processus cellulaires dépendent de la fonctionnalité des protéines. Bien que la fonctionnalité d'une protéine donnée est la conséquence directe de la séquence d'acides aminés unique, il ne se matérialise que par le repliement de la chaîne polypeptidique en une seule disposition tridimensionnelle définie ou plus couramment en un ensemble de conformations interconversion. Enquête sur le lien entre la conformation de la protéine et sa fonction est donc essentiel pour une compréhension complète de la façon dont les protéines sont en mesure de remplir leur grande variété de tâches. Une possibilité d'étudier des changements de conformation d'une protéine subit tout en progressant au travers de son cycle de fonctionnement est de l'hydrogène H-1/2 H-échange, en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HX-MS). HX-MS est une méthode souple et robuste qui ajoute une nouvelle dimension à l'information structurale obtenue par cristallographie par exemple. Il est utilisé pour étudier le repliement des protéines et le déploiement, la liaison de petit molecule ligands, les interactions protéine-protéine, des changements conformationnels liés à la catalyse enzymatique, et allostery. En outre, HX-MS est souvent utilisé lorsque la quantité de protéine est très limitée ou la cristallisation de la protéine n'est pas réalisable. Ici, nous fournissons un protocole général pour étudier la dynamique des protéines avec HX-MS et décrivons comme un exemple pour révéler l'interface d'interaction des deux protéines dans un complexe.

Introduction

Le nombre de structures cristallines des protéines et complexes de protéines a augmenté rapidement ces dernières années. Ils présentent des instantanés précieux de l'organisation structurelle de ces protéines et fournissent une base pour l'analyse structure-fonction. Cependant, la dynamique des protéines et les changements de conformation, qui sont essentielles pour leurs fonctions, sont rarement révélées par cristallographie aux rayons X. Cryo-microscopie électronique, d'autre part, est capable de capturer des complexes de protéines et des protéines dans des conformations différentes, mais en général ne peut pas résoudre les changements conformationnels jusqu'au niveau de la structure secondaire 1. Dynamique conformationnelle des protéines en solution à des détails atomiques ne peuvent être résolus par RMN, mais cette méthode reste limitée aux protéines de taille relativement petite (généralement ≤ 30 kDa) et les besoins des concentrations élevées de protéines (≥ 100 de pM), qui entrave expériences avec oligomérisation ou d'agrégation des protéines sujettes 2. Une méthode quiest capable de combler entre haute résolution cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique, et qui n'est pas limitée par la taille de la protéine ou de la concentration de l'hydrogène est l'amide-1 H / 2 H-échange (HX) en combinaison avec la spectrométrie de masse (MS). Ces dernières années, ce procédé a mis au point un outil d'analyse utile pour l'analyse de la dynamique des protéines, le repliement des protéines, la stabilité des protéines et des changements de conformation 3-5. La base moléculaire de cette méthode est la nature labile du squelette hydrogènes d'amide dans les protéines, qui vont échanger avec des atomes de deutérium lorsque la protéine est placé dans une solution de D 2 O. L'augmentation subséquente de la masse de la protéine au cours du temps est mesurée avec MS à haute résolution.

En bref peptides non structurés ne HX dépend de la température, la concentration en catalyseur (OH -, H 3 O + ie pH, voir la figure 3) et des chaînes latérales d'acides aminés des résidus adjacents dues à inductive, chateffets alytic et stériques. Ces effets sur la valeur intrinsèque du taux de change chimique k ch ont été élégamment quantifiée par Bai et al. 6 et un programme est disponible (avec la permission Z. Zhang), qui calcule k ch pour chaque acide aminé dans un polypeptide dépend du pH et de la température. A pH neutre, et des températures ambiantes ch k est de l'ordre de 10 1 à 10 3 s -1. Dans les protéines pliées HX peut être 2-9 ordres de grandeur plus lentes principalement due à la liaison hydrogène dans la structure secondaire et à un degré moindre en raison de l'accès restreint de hydratés ions OH - à l'intérieur d'une protéine étroitement replié. HX en protéines natives implique donc déroulement, l'échange chimique partielle ou globale et repliement à l'état natif selon l'équation (1) et les taux de change observés k obs dépendent du taux d'ouverture k op, les taux de clôture k cl et l'échange chimique intrinsèque rate ch k selon l'équation (2).

Équations 1-2
Dans des conditions natives de l'Etat k op est beaucoup plus petit que k ch et peut être négligée dans le dénominateur. Il existe deux régimes de change extrêmes appelés EX1 et EX2. Si la cl k est beaucoup plus petit que k ch (EX1) du taux observé est pratiquement égale à la vitesse d'ouverture et de HX permet l'observation immédiate du déploiement d'un élément de structure. Un tel régime de change, où tout protons amide échange à la fois lors de l'ouverture de l'élément structurel, est facilement observable dans MS par une distribution bimodale des pics isotopiques 7. Si k cl est beaucoup plus grand que k ch (EX2) du taux observé est proportionnel à k ch lequel la constante de proportionnalité est égal aux équilibres de pliage-dépliage constante K = k u op cl. Dans ces conditions, beaucoup d'ouverture et de clôture des événements sont nécessaires avant tout échange de protons amide pour deutons, conduisant à une augmentation graduelle de la masse moyenne, tandis que la distribution isotopique reste à peu près le même. Le régime de EX2 permet la détermination de l'énergie libre de dépliement Ag u et donc la stabilité d'un élément de structure. Sous la condition native de l'Etat du régime de EX2 est la plus courante. Augmentation du pH et l'ajout d'agents chaotropiques peut changer le mécanisme de change pour EX1. Par conséquent, HX-MS peut être utilisée pour explorer thermodynamique ainsi que des paramètres cinétiques de repliement des protéines et des changements conformationnels.

Comme mentionné ci-dessus HX est intrinsèquement dépendante du pH et de la température et de l'échange de demi-vie d'un proton complètement exposé au solvant du groupe amide du squelette est comprise entre 5 à 400 msec à pH physiologique (pH 7,6) et 30 ° C, mais à 10 min> 15 h avec une moyenne de> 2 h à pH 2,9 et à 0 °C (sauf pour le proton de la première épine dorsale liaison amide d'un polypeptide, qui échange avec une demi-vie de ca. 1-2 min). Dans ces conditions, l'échange lent, il est possible de digérer l'échantillon en utilisant des protéases (par exemple la pepsine) qui sont actives dans ces conditions, avec les perdre toutes les informations contenues dans les deutons incorporés. Depuis l'introduction de la digestion gastro-duodénal dans des conditions échanger lents, non seulement la cinétique de HX ensemble de protéines de pleine longueur peuvent être analysés mais HX peuvent être localisés à des régions spécifiques 8,9. La résolution spatiale est limitée à la taille des fragments peptiques générés, ce qui est en général comprise entre 10-30 résidus. Cependant, les fragments chevauchants créés en raison de la nature non spécifique de clivage par la pepsine pourraient conduire à une augmentation de la résolution spatiale. En outre, plusieurs autres proteases se sont révélés être actifs dans des conditions de trempe, cependant, beaucoup moins efficaces que la pepsine 10. En outre augsoi de la résolution spatiale peut être atteint par la fragmentation de peptides en phase de gaz par des méthodes qui ont préservé le modèle de deutération comme la capture d'électrons dissociation (DPE), transfert d'électrons dissociation (ETD) et infrarouge dissociation multiphotonique (IRMPD) 11-13. Ces techniques empêchent la perte de résolution spatiale due à la migration intramoléculaire de proton ("brouillage"), qui est observée par dissociation induite par collision (CID) de la technique de fragmentation le plus couramment utilisé. Cependant, ces méthodes nécessitent l'optimisation pour chaque peptide individuel et est donc encore assez difficile.

HX-MS a été utilisé pour analyser les interactions protéine-ligand et la protéine-protéine, y compris l'assemblage de la capside virale 14-17. Protéines de repliage et dépliage ainsi que la température des changements conformationnels induits ont été étudiés 7,18,19. Phosphorylation et unique de conformation liée à la mutation d'acides aminés et modifie 16,20 nucleotchangements ide-induits ont été analysés 21,22. Par conséquent, cette méthode semble parfaitement adapté pour analyser l'assemblage et la dynamique des machines moléculaires. Un candidat intéressant, dont le mécanisme est d'un grand intérêt général, est le complexe chaperon Hsp90.

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Protocol

Une. Préparation de tampons et de protéines des échantillons

  1. Préparer H 2 O tampon. Utilisation Hsp90 tampon standard (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%) en tant que H 2 O tampon.
    Remarque: Si l'échantillon a été dialysée avant l'analyse, utiliser le tampon de dialyse H 2 O tampon. Il est essentiel que le tampon D O 2 se distingue de l'H 2 O dans le tampon seul isotope de l'hydrogène. Tampons volatils comme NH 4 CO 3 ou NH 4-acétate ou tampons composants ne sont pas adaptés!
  2. Préparer D 2 O tampon par lyophilisation de tampon standard Hsp90 aide d'un concentrateur sous vide. Après évaporation complète du H 2 O pur ajouter D 2 O pour le tube d'atteindre le volume total initial (par exemple, 1 ml de tampon avec 15% de glycerol nécessite l'addition de 850 ul de D 2 O). Répétez l'évaporation complète de la mémoire tampon et dissoudre le tampon / sel comcomposants dans D 2 O 2x.
  3. Préparer le tampon de trempe (0,4 M de KH 2 PO 4 / H 3 PO 4, pH 2,2).
    Remarque: Pour améliorer l'efficacité de la digestion peptique de protéines très stables 4 M de chlorhydrate de guanidine et 0,5 M de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE-HCl) peuvent être ajoutés.
  4. Préparer l'échantillon de contrôle à 100% (6 M de chlorhydrate de guanidine, D 2 O). Ajouter le chlorhydrate de guanidine à une aliquote Hsp90 pour atteindre une concentration finale de 6 M. complètement évaporer H 2 O à partir de l'échantillon et ajouter D 2 O pour le tube d'atteindre le volume total initial (par exemple, 100 ul d'échantillon avec 10% de glycerol nécessitent l'addition 90 ul de D 2 O). Répétez l'évaporation complète de la mémoire tampon et dissoudre les composants tampon / sel dans D 2 O.
    Remarque: 20-100 pmol de l'échantillon sont nécessaires pour chaque injection. Préparer échantillon assez d'avoir un contrôle à 100% pour chaque jour d'expériences HX-MS.
  5. Préparer 50 pmol Hsp90 dans 5 pl de tampon norme Hsp90.
    Note: Un montant de 20-100 pmol de l'échantillon est nécessaire pour chaque point de données brutes. Le volume de l'échantillon dans la réaction est de 1 à 5 pl idéalement. Ajuster la concentration pour s'adapter à ces exigences. Tout tampon peut être utilisé tant qu'il ne contient pas de détergents ou des composants volatils.

2. Préparation de la pepsine immobilisée sur aldéhyde Perles Activé

  1. Dissoudre 80 mg de pepsine frais dans mM de citrate de sodium à 2 ml 50 (pH 5).
  2. Dissolvez 20 mg de cyanoborohydrure de sodium, manipuler avec soin (très toxique!) Dans 1 ml de 2 M Na 2 SO 4 et ajouter à la solution de pepsine.
  3. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante tout en agitant doucement (shaker par exemple les frais généraux).
  4. Ajouter 600 mg de billes avec des groupes aldéhyde immobilisées au mélange et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante.
  5. Ajouter 2,2 ml de 2 M Na 2 SO4 (pH 5) en aliquotes de 100 pi toutes les 3 min plus d'une heure de sel lentement la pepsine. Mélanger délicatement l'échantillon entre les additions dans un agitateur vertical à température ambiante.
  6. Incuber les perles de pepsine à 4 ° C pendant 14-16 h / pendant une nuit dans un agitateur de tête.
  7. Arrêter la réaction en ajoutant 1 ml d'éthanolamine 1 M et une incubation à température ambiante pendant 2 h.
  8. Centrifuger les billes dans un tube Falcon de 50 ml à 500 tours par minute, jeter le surnageant et remettre en suspension les billes dans de l'acide formique à 0,1%. Répétez cette étape 2x. Après la dernière étape de centrifugation, éliminer le surnageant et le volume d'estimation de billes. Ajouter un volume équivalent d'acide formique à 0,1% et la stocker à 4 ° C.

3. Préparation des colonnes pour Amide hydrogène-échange

  1. Utilisez les colonnes de garde avec un diamètre intérieur de 1 mm pour le piégeage des colonnes et de 2 mm pour les colonnes de la pepsine.
  2. Dévissez un côté de la colonne de garde et retirer le filtre. Vissez emballage funnel sur l'extrémité ouverte de la colonne. Utiliser un adaptateur 1/16 de pouce et de tubes pour fixer une seringue vide (5 ml) à la sortie de fond de la colonne. Assurez-vous de fixer le gaz étanche à la colonne de garde.
  3. Appliquer quelques gouttes de matière de tringle de suspension au-dessus de l'entonnoir. Tirer le piston de la seringue pour aspirer la suspension à travers l'entonnoir dans la colonne de garde. Appliquer plus de matière de tringle de suspension sur l'entonnoir et poursuivre la procédure jusqu'à ce que la colonne de garde est complètement remplie de matériau de la moulure. Retirez l'entonnoir et placer le filtre et la bague de filtre sur l'extrémité ouverte. Vissez le bouchon de colonne sur la colonne de garde et retirer la seringue de l'autre côté. Fermez les deux extrémités des colonnes de garde avec des bouchons pour éviter le dessèchement du matériau de la colonne.

4. Configuration du système pour l'hydrogène change spectrométrie de masse (HX-MS)

  1. Raccorder la colonne de piégeage avec le système HPLC (figure 1). Équilibrer la colonne en réglant la vitesse d'écoulementUne pompe de 0,4 ml / min avec 0,1% d'acide formique comme solvant. Ne branchez pas la colonne de pepsine, ni la colonne d'analyse encore.
  2. Calibrer le spectromètre de masse et connecter la sortie de l'HPLC à la source du spectromètre de masse.

5. Détermination de la gamme dynamique de l'échange

  1. Préparer ultrapure solvant A (acide formique à 0,1% dans l'eau) et le solvant B ultrapure (acide formique à 0,1% dans de l'acétonitrile); solvants mixtes préparés sont disponibles dans le commerce. Purger les pompes HPLC. Mettre en place la chromatographie et les méthodes de spectrométrie de masse dans le logiciel de commande par le choix d'un programme avec un gradient par étape, après une courte étape de dessalage. Pour toute la longueur Hsp90 utiliser une étape de dessalage de 1-2 min, suivie par la commutation de la vanne 6 ports de dessaler / LOAD pour éluer et un gradient échelonné de 90% de solvant A/10% de solvant B à 5% de solvant A/95% de solvant B. Avant l'injection réglé la soupape d'injection de charge et la vanne 6 ports pour dessaler / position de chargement.
    Remarque: Ne pas utiliser un pepsine ou colonne d'analyse au cours de cette expérience.
  2. Préparer 100-200 pmol de Hsp90 dans 1-10 pi H 2 O tampon et incuber pendant 10 min à 30 ° C. Ajouter température ajustée D 2 O tampon pour amener le volume de l'échantillon jusqu'à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 10 s, 100 s, 1 000 s). Ajouter tampon de refroidissement de 100 pi et mélanger par pipetage de haut en bas. Injecter l'échantillon de 200 ul dans l'orifice d'injection de la soupape d'injection avec une seringue Hamilton. Démarrez le programme de chromatographie et de passer la soupape d'injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT à éluer. Répétez cette opération pour au moins trois points dans le temps.
  3. Répétez l'étape 5.2 mais ajouter 2-3x plus de DIT1 à l'échantillon Hsp90 avant l'incubation pendant 10 min à 30 ° C.
  4. Déterminer les masses de protéines de pleine longueur par la déconvolution des spectres dans le logiciel de spectrométrie de masse. Calculer le nombre de incorporanted deutérons en comparant le poids moléculaire de la protéine Hsp90 de longueur complète avec la masse observée après chaque passage (par exemple 10 s, 100 s, 1 000 s).
  5. Tracer les deutons incorporés pour Hsp90 en absence et en présence de DIT1 (en ordonnée) en fonction du temps (axe des x). Déterminer le point de temps dans la plage dynamique où la différence entre les deux courbes est maximale. Utilisez cette valeur pour le temps d'incubation dans D 2 O lors de l'identification d'interface et de la dynamique au niveau du peptide Hsp90-DIT1.

6. Détermination de gastroduodénal peptides utilisant MS / MS Spectra

  1. Raccorder la colonne de pepsine et de la colonne d'analyse au système.
  2. Configurer les paramètres de la chromatographie et de spectrométrie de masse dans le logiciel de commande, en choisissant le type et la méthode de gradient de spectrométrie de masse. Choisissez une longue pente (par exemple plus de 90 min) pour assurer une bonne résolution chromatographique. Activer spectres MS / MS sur le spectromètre de masse.
    Remarque: Bonne résolutiontion sur la HPLC et une grande précision de masse ont la plus haute priorité à cette étape.
  3. Préparer 100-200 pmol de Hsp90 dans 100 ul de H 2 O tampon. Ajouter tampon de refroidissement de 100 pi et mélanger par pipetage de haut en bas. Injecter l'échantillon de 200 ul dans l'orifice d'injection de la soupape d'injection avec une seringue Hamilton. Démarrez le programme de chromatographie et de passer la soupape d'injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste.
    Remarque: Si plus d'une protéine à analyser dans HX-MS (à savoir Les interfaces d'interaction protéine-protéine), les peptides de chaque protéine doivent être déterminés individuellement.
  4. Identifier des peptides peptiques de Hsp90 en recherchant une base de données (c.-à Mascot) pour les peptides résultants.
    Note: Il est possible d'utiliser une base de données personnalisée que l'objectif est de déterminer que de nombreux peptides peptiques que possible et l'analyse se fait avec la protéine purifiée. Pureté échantillon have être pris en compte.
  5. Répéter cette étape sans MS / MS et par le gradient qui sera utilisé pour l'expérience de HX réelle. Pour Hsp90 et DIT1 utilisent un gradient de 10 min de 90% A/10 solvant% de solvant B à 45% de solvant A/55% de solvant B.
    Remarque: Les dégradés sont normalement entre 5-15 min et hautement tributaire de la complexité de l'échantillon et les spécifications du système HX.
  6. Déterminer les temps de rétention des peptides peptiques identifiés à la section 6.4 du gradient utilisé dans 6.5 et de créer une liste comprenant 1.) Séquence peptidique 2.) L'état de charge de peptide et 3.) Temps de rétention. Ceci sera utilisé pour identifier chaque peptide après des expériences de HX.
    Note: Soyez conscient que les peptides avec petit m / z différences, l'état de charge identique et temps de rétention identique peuvent être une source d'ambiguïté.

7. Identification des interfaces d'interaction protéine-protéine

  1. Mettre en place le gradient et la méthode de spectrométrie de masse dans le softwar de contrôlee. Utilisez un gradient linéaire de 10 min de 90% A/10 solvant% de solvant B à 45% de solvant A/55% B. solvant Charger une méthode de spectrométrie de masse qui est optimisé pour la détection de masses entre 300-1,500 m / z, bien que la plupart des les peptides seront en dessous de 1000 m / z. Réglez la soupape d'injection en position de charge, la vanne 6 ports en CHARGEMENT / DESSALAGE position. Régler la vitesse de la pompe de chargement à 0,4 ml / min.
    Remarque: La longueur et le type de gradient sont échantillon dépendant et peut être optimisé. Gradients plus d'améliorer la résolution de la chromatographie mais diminuent l'incorporation de deutons en protéines dues à dos-échange. Les méthodes choisies doivent être les mêmes pour toutes les expériences à comparer.
  2. Pour la référence de préparer non échangée de 20 à 100 pmol de Hsp90 dans 100 ul de H 2 O tampon. Ajouter 100 pi de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois injecter l'échantillon dans la soupape d'injection de l'HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et swdémanger la soupape d'injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Faites cela pour Hsp90 et DIT1 individuellement et pour le mélange de protéines.
  3. Préparer 20 à 100 pmol de Hsp90 dans un volume de 1 à 5 pl. Ajouter température réglée D 2 O tampon pour porter le volume de l'échantillon jusqu'à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 30 secondes, pour dynamique conformationnelle voir la note). Ajouter 100 ul de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois rapidement injecter les 200 pi dans la soupape d'injection de l'HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et de passer la soupape d'injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Pour ce faire, pour chaque protéine individuellement, afin de déterminer l'incorporation de deutérium dans chaque peptide en l'absence de la protéine d'interaction.
    Remarque: Lors de l'étude de la dynamique de conformationmational changements, répéter l'expérience avec différents temps d'incubation de Hsp90 dans D 2 O tampon. Essayez de couvrir une large échelle de temps en choisissant des temps d'incubation de façon logarithmique (par exemple, 10 sec, 30 sec, 100 sec, 300 sec, sec 1000, etc.) O tampon D 2 de tampon et l'échantillon doit être exactement identiques, sauf pour l'isotope de l'hydrogène.
  4. Préparer une quantité égale de l'échantillon de contrôle à 100% (20 à 100 pmol) et ajouter D 2 O tampon pour amener le volume de l'échantillon jusqu'à 100 pi. Ajouter 100 ul de tampon de refroidissement refroidi à la glace, une pipette de haut en bas et deux fois rapidement injecter les 200 pi dans la soupape d'injection de l'HPLC. Démarrer immédiatement le programme de chromatographie et de passer la soupape d'injection en position INJECTION. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste.
  5. Pour déterminer la surface d'interaction mélanger Hsp90 avec un excès d'au moins 2 fois de DIT1 de déplacer l'équilibre à l'état consolidé (voir la note) et incuberà la température désirée jusqu'à ce que la formation du complexe est à l'équilibre. Ajouter température ajustée D 2 O tampon pour amener le volume de l'échantillon jusqu'à 100 pi et incuber exactement pour une période de temps définie (par exemple 30 secondes). Ajouter deux fois rapidement et injecter dans la soupape d'injection de la HPLC 100 ul de tampon de refroidissement par de la glace, une pipette de haut en bas. Après 2 min basculer la vanne 6 ports de dessaler / CHARGEMENT pour éluer poste. Répétez cette expérience avec 20-100 pmol de DIT1 et l'excès de Hsp90.
    Remarque: les concentrations absolues dépendent de la constante d'équilibre de dissociation de l'interaction. Idéalement, après dilution dans du D 2 O à la concentration de la protéine ajoutée en excès doit être d'au moins 10 fois le K D (soit> 85% de la protéine concentrée inférieur lié).
  6. Analyser les données acquises avec un logiciel adapté et en utilisant les temps de rétention déterminés dans l'étape 6.5 pour trouver chaque peptide dans l'analyse. Calculte du centroïde de la distribution de l'isotope pour la protéine non échangée (étape 7.2) et pour les expériences de HX (étape 7.3).
    Remarque: Bien que les modèles isotopiques de peptides échangés semblent différents de leurs homologues non échangées, à la fois les connaissances sur l'état du peptide de charge et la précision de la masse élevée du spectromètre de masse permet de déterminer facilement les centres de gravité.
  7. Comparer incorporation de deutons de protéine cible seul et avec plus de partenaire de liaison. Cela peut être fait automatiquement avec le logiciel commercial ou manuellement à l'aide d'un tableur. Les valeurs de l'échantillon de contrôle de 100% indiquent l'échange maximal pour chaque peptide et peuvent être utilisées pour déterminer la quantité de D 2 O étiquette perdue lors de l'expérience à cause de l'échange en arrière.

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Representative Results

Hsp90 est un chaperon moléculaire dans la levure et de la famille de Hsp90 chaperone. En passant par un cycle du complexe ATPase il assiste fin des étapes de pliage d'un grand nombre de protéines clients. Pliage efficace nécessite un transfert de clients de Hsp70 et de l'interaction de la Sti1/Hop co-chaperon. STI1 se lie directement à Hsp90 et facilite la liaison par inhibition de l'activité d'ATPase de la protéine Hsp90 client. Interaction de Hsp90 avec DIT1 a récemment été étudiée en utilisant HX-MS 23. Ici, nous présentons des résultats représentatifs des expériences sous-jacents en suivant le protocole ci-dessus.

L'interaction protéine-protéine directe a été testée par marquage de la protéine complexe en équilibre avec D 2 O et en comparant les spectres peptide STI1 en absence et en présence de Hsp90.The tracé de différence résultant peut le voir sur la figure 5A (à partir de données 23). Les peptides sont orientées de haut en bas à partir de l'extrémité N-terminale. La plupart des peptidesTPR2a et TPR2b montrent une forte protection à la présence de la protéine Hsp90 (valeurs négatives pour D + Hsp90 - D-Hsp90), ce qui indique que ces régions interagissent avec la protéine Hsp90. La protection en TPR2a peut facilement être rationalisée à partir de la structure cristalline de DIT1-TPR2a-TPR2b en complexe avec un peptide représentant le MEEVD-motif C-terminal de la protéine Hsp90 (figure 5B). Une telle protection claire dans les interactions protéine-protéine n'est pas toujours observée. La protection de Hsp90 en présence d'STI1 n'est pas aussi prononcé et non en tant que localisé dans STI1 (figures 5C et 5D). Tous les peptides montrent légèrement augmenté la protection de deutérium incorporation, en présence de DIT1. DIT1 stabilise évidemment Hsp90 mondialement comme aucune région de la protéine montre une plus grande souplesse dans la présence de DIT1. Nous pouvons cependant pas distinguer, si cette incorporation de deutérium réduit provient de l'interaction directe avec DIT1 ou par des effets allostériques sur la conformationde Hsp90. Les informations obtenues réduit le site d'interaction putative de quelques peptides (par exemple peptide 43-62 de NBD). Des expériences supplémentaires tels que la réticulation sont couramment utilisés pour confirmer les sites de liaison après HX-MS 23. Il faut noter que la couverture de la séquence de la protéine Hsp90 est diminuée lors de la mesure du complexe Hsp90-STI1. Depuis DIT1 a été ajouté à 3,5 fois plus élevées que le montant global théorique de peptides dans l'analyse était quatre fois plus élevé que certains de Hsp90 seul. Cela augmente le risque de peptides DIT1 éclipsant ou qui se chevauchent peptides Hsp90 lors de l'analyse. Pour optimiser pour une meilleure couverture de la séquence de séparation chromatographique mieux semble être l'approche la plus prometteuse.

Une possibilité d'étudier la dynamique des différentes régions de la protéine est l'utilisation de l'étiquetage continue HX-MS. Elle implique l'incubation de l'échantillon de protéine équilibrée dans D 2 O pour les différentes périodes de temps et permet donc des prédictions sur la stabilité de. segments protéiques individuelles La figure 6 illustre les spectres de peptide 43-62 de la NBD de Hsp90 en présence et en absence d'un excès de 3,5 fois d'STI1. Les temps d'incubation ont été choisies sur une échelle logarithmique (10 s, 100 s, et 1,000 sec) pour obtenir une bonne couverture sur une fenêtre temporelle de largeur. Les spectres de peptides montrent une incorporation en fonction du temps de deutérium dans la protéine qui augmente de plus longues durées d'incubation. Pour peptide 43-62 échange suit le mécanisme de EX2 où k int << k cl. Le degré de protection change tout au long de la période d'incubation, montrant la différence majeure à la réduction du temps d'incubation et le taux de change à peu près semblable au point de temps plus longue. Ceci suggère une stabilisation de degré inférieur ou une région d'interactions dynamiques avec dissociation fréquente et réassociation. Soit la protection observée est due à un taux global d'échange réduit de protons amide dans le peptide ou l'effet peut être attribué à une ou deuxprotons amide spécifiques qui échangent plus lentement en présence de DIT1. Dans ce cas, cette dernière est beaucoup plus probable que la structure cristalline a révélé Hsp90 cette région comme une boucle exposée plutôt qu'une structure secondaire régulière comme α-hélices ou β-feuilles.

Il est important de mentionner que l'échange de retour n'a pas été soustraites des données présentées ce qui implique que les effets observés seront plus prononcée une fois normalisé pour le contrôle à 100%.

Figure 1
Figure 1. configuration de HPLC pour HX-MS. a) la configuration typique d'un HX-MS a mis en place. Les différentes zones colorées représentent des sections maintenues à des températures différentes. L'échantillon est injecté dans la boucle de la soupape d'injection (dans le mode de chargement, cyan) et de l'échantillon après la commutation de la vanne en mode "injecter" (noir) pompé à traversla colonne de pepsine dans la vanne 6-port. La colonne est maintenue à peu près la pepsine à 10 ° C pour améliorer l'activité enzymatique de la pepsine. La vanne 6 ports dispose de deux modes, "Mode de chargement / de dessalage" et "Mode élution" (voir b). Après dessalage de l'échantillon les peptides sont séparés par Chromatographie avec un gradient d'acétonitrile sur une colonne en phase inverse analytique. Les peptides sont ensuite pulvérisées dans le spectromètre de masse avec une source ESI. B) Modes de la vanne 6-port. Directement après HX la vanne 6-port est en "position de chargement / de dessalage» pour piéger les peptides peptiques sur la colonne de piège. Ceci se poursuit pendant trois minutes afin d'éliminer les sels ou les composés des tampons de réaction qui pourraient interférer avec la spectrométrie de masse. Après cela, les commutateurs de la vanne 6-port en mode "élution" mettre la colonne de piège chargé dans le trajet d'écoulement entre la pompe et le gradient de la colonne d'analyse. Les peptides peptiques piégés élues depuis la colu piègemn et se séparent dans un gradient de 0,1% d'acide formique acid/0.1% d'acide formique dans de l'acétonitrile.

Figure 2
Figure 2. Débit régime d'une expérience de HX. 1) la protéine cible est purifié et livré en tampons standard sans détergent. 2) La protéine est digérée par voie enzymatique avec la pepsine et les peptides gastro-duodénaux sont identifiés et caractérisés par spectrométrie de masse en tandem (MS / MS). Seulement après l'obtention de la séquence, le temps de charge de l'Etat et le maintien du plus grand nombre possible des peptides HX-MS peut être réalisée avec succès. 3) Les conditions expérimentales sont mis en place tel que l'incubation de la protéine dans des conditions spécifiques (composé d'addition de ligand / chimique ou changement de la température ou du pH. 4) HX est réalisée en diluant l'échantillon 01 heures 10 ou plus dans D 2 O tampon . Le tampon D 2 O doit être identique à la mémoire tampon d'échantillons pour avoeffets tampons id. Ensuite, l'échantillon est incubé pendant exactement une période de temps définie. 5) Après l'incubation, la réaction est arrêtée et injecté dans le système HPLC-MS. L'échantillon est clivé enzymatiquement et les peptides gastro-duodénaux en résultent sont séparés dans un gradient de solvant organique et injecté dans le spectromètre de masse. 6) L'analyse des spectres de peptide obtenu. Les centres de gravité des spectres de peptide sont comparés dans des conditions différentes de réaction. Cela peut se faire manuellement avec un logiciel approprié, soit automatiquement par un programme d'analyse de HX.

Figure 3
Figure 3. mécanisme d'échange d'hydrogène. la réaction d'échange d'un atome d'hydrogène peut être catalysée par des bases ou acides et qui est par conséquent dépendante du pH avec un taux de change minimal entre pH 2,5 et 3 selon les chaînes latérales des résidus adjacents de la liaison amide 6. Dudessalement de l'anneau et la séparation chromatographique de peptides, qui est réalisée en H 2 O contenant des solvants, des deutons incorporés sont échangés avant de protons selon le même mécanisme («échange de retour"). Par conséquent, l'optimisation du système et les solvants utilisés est essentielle pour réduire la perte de deutérons incorporés.

Figure 4
Figure 4. Principe de HX-MS. La liaison d'un ligand à la protéine entraîne la protection de la colonne vertébrale hydrogènes d'amide au niveau du site de liaison à partir du solvant environnant. Cela diminue les taux de protons concernés de change et diminue l'incorporation de deutons. En raison de la différence de poids entre les protons et deutérons est une Da, des peptides dérivés de cette région de la protéine montreront une plus faible de m / z en spectrométrie de masse. En comparant les spectres des peptides des expériencesen absence et en présence du partenaire de liaison se révéler un décalage du centre de gravité du spectre pour abaisser valeurs m / z d'événement (de protection). Les régions qui présentent une protection de premier plan après plus de partenaire de liaison sont des sites de liaison potentiels. En fonction de la couverture de la séquence et de la disponibilité des sites de liaison des peptides se chevauchant peut être réduit à quelques acides aminés.

Figure 5
Figure 5. Interaction de Hsp90 et DIT1. un, terrain de différence de deutérium incorporation dans DIT1 en présence du partenaire de liaison Hsp90 moins deutéron incorporation dans DIT1 en l'absence de la protéine Hsp90 (données du 23). b, la représentation de bande dessinée d'un fragment de DIT1 comprenant TPR2a et TPR2b (code PDB 3UQ3) dans un complexe avec un peptide, qui représente la MEEVD-motif C-terminal de la protéine Hsp90. La bande dessinée est coloré conformémentding au nombre de protons amide protégées de deutérium incorporation comme indiqué. c, terrain de différence de Hsp90 en présence d'une liaison partenaire DIT1. Deutéron incorporation observée dans Hsp90 après 10 minutes pré-incubation avec 3.5x excès DIT1 à 30 ° C et 30 sec; HX à la même température. L'expérience a été réalisée en triple exemplaire et l'erreur type de la moyenne est indiquée pour chaque peptide. Valeurs négatives indiquent mondiaux incorporation réduite de deutons et la stabilité globale donc plus élevé de Hsp90 en présence de DIT1. Retour échange n'a pas été considéré dans cette expérience. D, la représentation de bande dessinée de levure Hsp90 (code PDB 2CG9) de couleur en fonction du nombre de protons amide protégées de deutérium incorporation comme indiqué en b. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6. Évolution dans le temps de deutérium incorporation dans la levure Hsp90 en l'absence et la présence de DIT1. un Non traité peptide spectres de peptide de 43 à 62 à partir du domaine de liaison nucléotidique de Hsp90 après échange marquage continu d'hydrogène. 20 uM de Hsp90 ont été incubées avec 70 uM STI1 pendant 10 min à 30 ° C pour atteindre l'équilibre et D 2 O marquage a été effectué à 30 ° C pendant 10 s, 100 s, et 1 000 sec. Marqueurs de points rouges indiquent les centres de gravité calculés pour chaque peptide. B, de la cinétique d'échange de peptide 43-62 en présence et en l'absence de 3.5x excès DIT1. Retour échange n'a pas été considéré dans cette expérience.

Figure 7
Figure 7. Exemples de spectres de peptide avec distri bimodaleion. un, Deuteron incorporation dans E. coli Hsp90 en l'absence et la présence d'ATP (données tirées de 22 suppl. Figure 3). Les spectres des résidus peptidiques 192-206 sont présentées avant incubation dans D 2 O (0% D), après 30 secondes, 5 min, 10 min et 30 min d'incubation dans D 2 O, et le contrôle à 100% (100% de D) . En l'absence d'ATP (ATP) d'un comportement typique d'échange d'EX2 est observée. En présence d'ATP (+ ATP) une protection forte est observée à 30 sec et à 5 min et 10 min distributions bimodales des pics isotopiques, indiquant deux populations de protéines, une population similaire à l'état ATP lié et une seconde semblable à l'état libre nucléotides. A 30 min pas de différence entre absence et présence d'ATP est observée. La distribution bimodale est probablement causé par hydrolyse de l'ATP et de transition grâce à l'état libre nucléotides avec une plus grande flexibilité dans ce segment de protéine. Ces spectres ressemblent un classique régiment de change EX1moi. b, de la distribution bimodale des pics isotopiques dans les expériences de HX impulsion d'étiquetage. E. coli Hsp90 a été incubé en l'absence d'ATP ou en présence d'ATP pour 10 à 300 secondes et ensuite marquées par impulsions pendant 10 s dans D 2 O, comme indiqué (données extraites de 22 la figure 4A). Les distributions bimodales indiquent à nouveau deux populations de molécules co-existants, un échange de protons amide plus rapidement pour des deutérons que l'autre. ATP induit une transition lente de la plus rapide en échange de la conformation échange lent.

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Discussion

Liaison d'un partenaire d'interaction d'une protéine entraîne inévitablement des changements dans l'accessibilité au solvant sur le site de liaison. En outre, de nombreuses protéines subissent des changements conformationnels dynamiques lors de la liaison, qui touchent d'autres régions que l'interface de liaison réelle. HX-MS est une méthode robuste pour surveiller ces changements et est même capable de révéler des changements conformationnels de protéines sur des échelles de temps que d'autres méthodes ne peuvent pas couvrir.

Pour réaliser avec succès HX-MS trois points sont essentiels: 1) une configuration optimale du système, 2) l'exécution précise de traitement des échantillons et 3) une analyse minutieuse des données lors de l'attribution des spectres de peptide et l'interprétation des résultats.

La configuration du système

Etant donné que la spectrométrie de masse est utilisé pour détecter l'incorporation de deutérium dans les peptides, les mêmes précautions en ce qui concerne la préparation des échantillons sont valables pour HX-MS. Des détergents, des sels et d'autres composés qui interfèrent avec la spectrométrie de masse shoULD être évités ou supprimés avant l'analyse. Alors que HX-MS permet l'analyse de grands complexes de protéines, la plus grande complexité exige une meilleure qualité de séparation des peptides et la spectrométrie de masse. L'optimisation des conditions chromatographiques est la clé pour obtenir des données de bonne qualité. Ceci implique le choix des solvants organiques de haute qualité, la matière en phase inverse ainsi que l'optimisation des gradients et des solvants. Lavage des colonnes avec des solvants organiques peut être fait entre les expériences et la nuit pour réduire le signal de fond. Méthodes de spectrométrie de masse doivent être optimisés pour la détection des peptides gastro-duodénaux (entre 300-1,200 m / z). Les spectromètres de masse à haute résolution facilitent grandement l'analyse des données se chevauchant partiellement parce que les clusters de pics isotopiques provenant de différents peptides peuvent être distinguées.

Le traitement des échantillons est cruciale pour HX-MS. Généralement, nos tampons et les échantillons sont centrifugés pendant 10 min à 13 000 rpm (centrifuger) pour éliminer les agrégats et particles. En outre, plusieurs filtres incorporés peuvent être installés dans le système de HPLC pour éviter le colmatage des colonnes. Une petite différence de D 2 O temps d'incubation peuvent avoir des effets importants. Pour les régions de protéines très flexibles une différence de seulement quelques secondes peut faire la différence entre l'absence de l'incorporation de deutérium à tous et plein deutération. Depuis la dynamique des protéines ainsi que le taux de change intrinsèque sont fonction de la température, l'incubation de l'échantillon et les tampons sont étroitement contrôlée de la température. Il est avantageux de toujours répéter la séquence exacte des étapes pour chaque expérience. Si exécuté correctement, l'erreur entre deux expériences sera relativement faible. Aujourd'hui, les systèmes automatisés pour HX-MS sont disponibles dans le commerce et de réduire les problèmes de traitement des échantillons.

Analyse des données

L'étape la plus critique dans HX-MS est l'analyse des données, en particulier l'attribution des spectres de peptide et la détermination des niveaux de deutération. The de sortie de HX-MS est un profil d'élution du gradient de chromatographie contenant un grand nombre de spectres des peptides. La tâche des opérateurs consiste à attribuer ces spectres pour les peptides identifiés par MS / MS à l'étape 6) du protocole. Cela peut être un peu difficile car les spectres peut changer de façon significative vers m plus haut / z après HX. De plus, le recouvrement partiel des spectres peut compliquer l'affectation des peptides. Dans ce cas, l'utilisation de spectromètres de masse à haute résolution avec une grande précision la masse est payante car ils peuvent souvent résoudre des peptides qui se chevauchent. Les différences dans deutéron incorporation sont calculés sur la base des centres de gravité des spectres de peptide. Les centroïdes peuvent être déterminées: 1) par la main de marquage chaque pic isotopique d'un spectre de peptide et transférant ses valeurs d'intensité et de m / z dans un programme de feuille de calcul (par exemple, Excel, Microsoft) et en calculant le centroïde ou 2) avec un logiciel conçu pour attribuer les pics isotopiques appartenant à un peptide identifié et pour calculer l'centroïdes automatiquement (par exemple HDExaminer, Sierra Analytics ou HeXicon 24,25).

Optimisation de HX-MS

Si le nombre de peptides évaluables est trop faible, il existe plusieurs autres possibilités pour optimiser l'expérience: 1) l'optimisation de la chromatographie (solvants, longueur / forme de gradient, l'utilisation de différents matériaux en phase inverse) ou 2) l'évolution du clivage enzymatique de la protéine (protease variante, plus longue / courte durée d'incubation avec la pepsine, l'addition d'agents dénaturants à la mémoire tampon de trempe). Les deux paramètres modifient le comportement d'élution de peptides comme ils modifient soit la piscine de peptide lui-même ou de la séparation HPLC. Les deux approches d'optimisation sont au prix de la nécessité de requalifier peptides. D'autres proteases vont produire des peptides différents qui doivent être identifiés par MS / MS et caractérisé comme décrit dans l'étape 6.6). La modification des conditions de chromatographie ne modifiera pas le pool de peptide, mais la rétention de times des peptides individuels. Les temps de rétention doivent alors être fixée de nouveau comme dans l'étape 6.5). Il convient de mentionner que les temps de rétention plus élevés seront toujours diminuer la quantité de marqueur détectable comme arrière change augmente à plus de temps de rétention. Normalisation des données dans le contrôle à 100% est la meilleure façon de traiter avec échange de dos. Change Haut conduit à une perte de deutons intégrés et donc le signal. Il est fortement recommandé de réduire le montant de l'échange de revenir à un minimum. Il convient de noter que différentes configurations HX-MS auront des taux de change divergentes en arrière, en fonction du matériel, la composition des tampons et des solvants utilisés et du type de gradients qui sont utilisés 26.

D'interprétation des données

Lors de l'analyse des données, la répartition de l'intensité des pics isotopiques doit être évaluée avec soin, car il peut donner des indications sur le mécanisme d'échange. Pour les peptides ayant une masse inférieurede 2.000 Da les intensités des pics isotopiques de l'échantillon non échangée est généralement asymétrique avec des intensités plus élevées pour la monoisotope ou supérieur au premier pic isotopique. Pour le régime d'échange de EX2 cette distribution d'intensité asymétrique est de type gaussien avec le temps, de plus en plus dans D 2 O et en augmentant décalage supérieur à m / z, et la largeur de l'augmentation de la grappe isotopique d'environ 50% (figure 7). Comme mentionné dans l'introduction EX2 est plus fréquemment observé dans HX-MS dans des conditions natives et le taux de conversion observé est proportionnel à la constante d'équilibre K u dépliage et donc de la stabilité thermodynamique de la protéine. En revanche, pour le régime de change EX1 la distribution de largeur des amas isotopique augmente de façon significative et les distributions d'intensité bimodale ou multimodale sont observées (voir figure 7) 25,27. Distributions isotopiques bimodale indiquent toujours deux ou plusieurs espèces de molécules différentesdans l'analyse, qui sont potentiellement intéressante. Cependant, il existe deux types de pièges. Tout d'abord, le groupe des isotopes peut être composée de pics provenant de deux peptides différents. Il est donc impératif de vérifier les spectres de l'échantillon de non échangée pour des peptides avec la même m / z et charge identique. De tels peptides diffèrent habituellement légèrement dans le temps de rétention et la distribution d'intensité des pics isotopiques varie avec le temps d'élution. En spectromètres de masse à haute résolution, les pics isotopiques qui n'appartiennent pas à la même peptide peuvent également être distingués par les décimales des valeurs m / z. Deuxièmement, le report d'une précédente course HPLC-MS est observée 28. Ce report apparaît comme nonexchanged espèces et peut être éliminée par blank gradient HPLC pistes entre runs analyse. Il ya plusieurs raisons pour apparent régime de change EX1. 1) Dans les expériences de HX en présence de dénaturants EX1 est fréquemment observé 29. 2) loc spontanée ou induite, réversible ou irréversibleal ou mondiale actuelle de protéines provoque EX1 comportement 7,30,31. 3) les transitions de conformation qui sont lents par rapport à HX causée par le chiffre d'affaires par exemple de substrat, hydrolyse de l'ATP provoque distributions isotopiques bimodale ressemblant régime de change EX1 (figure 7a) 22. 4) les transitions conformationnelles induites par le ligand de lentes dans des expériences d'impulsion-étiquetage présentent également une signature d'EX1-like (figure 7b) 22.

L'interprétation des données obtenues est finalement ce qui fait HX-MS une telle technique de difficile, mais aussi très puissante. Une connaissance approfondie de la dynamique des protéines est nécessaire pour obtenir tout le chemin à partir des motifs de protection / déprotection observées à un modèle mécaniste de la dynamique des protéines. Néanmoins, produisant des données HX-MS haute qualité peuvent être effectuées dans les temps relativement court et est hautement reproductible. L'interprétation des données bénéficie clairement de toute information supplémentaire sur la structure de la protéine investirigated. D'un autre côté, HX-MS peut indiquer quelles sont les parties d'une protéine sont flexibles, ce qui peut être retiré pour faciliter la cristallisation pour la détermination de structure.

HX-MS est une méthode qui profite grandement par les innovations en spectrométrie de masse et chromatographie. Un progrès récent dans HX-MS est l'utilisation de NANODISQUES lipidiques pour l'analyse de protéines membranaires qui élargit en outre l'utilisation de cette technique 32. Aussi l'utilisation de transfert d'électrons dissociation (ETD) et capture électronique dissociation (DPE) montrent un fort potentiel pour HX-MS car elle augmente la résolution de deutérium incorporé au niveau des acides aminés simples 11,12 33.

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Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgments

Nous remercions M. Boysen des commentaires sur le manuscrit. Ce projet a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 et MA 1278/4-1 à MPM, et Cluster d'excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM est enquêteur du Pôle d'excellence: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

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