Summary
Protein konformasjon og dynamikk er nøkkelen til å forstå forholdet mellom protein struktur og funksjon. Hydrogen utveksling kombinert med høy oppløsning massespektrometri er en anvendelig metode for å studere konformasjonsendringer dynamikken i proteiner, så vel som å karakterisere protein-ligand-og protein-protein interaksjoner, herunder kontaktgrensesnitt og allosteriske effekter.
Abstract
Alle cellulære prosesser avhenger av funksjonaliteten til proteiner. Selv om funksjonaliteten til et gitt protein er en direkte følge av den unike aminosyresekvens er det bare realiseres ved folding av polypeptidkjeden til en enkelt definert tredimensjonalt arrangement, eller mer vanlig i et ensemble av innbyrdes omdanning konformasjonen. Gransker sammenheng mellom protein konformasjon og dens funksjon er derfor avgjørende for en fullstendig forståelse av hvordan proteiner er i stand til å oppfylle sitt store utvalg av oppgaver. En mulighet for å studere konformasjonsendringer et protein gjennomgår mens videre gjennom dets funksjonelle syklus er hydrogen-1 H / 2 H-utveksling i kombinasjon med høyoppløsende massespektrometri (HX-MS). HX-MS er en allsidig og robust metode som gir en ny dimensjon til strukturell informasjon fås ved f.eks krystallografi. Den brukes til å studere protein folding og utfoldelse, binding av små molecule ligander, protein-protein interaksjoner, konformasjonsendringer knyttet til enzymkatalyse, og allostery. I tillegg er HX-MS ofte brukes når mengden av protein er meget begrenset eller krystallisering av proteinet er ikke gjennomførbart. Her gir vi en generell protokoll for å studere protein dynamikk med HX-MS og beskrive som et eksempel hvordan å avsløre samspillet grensesnittet av to proteiner i et kompleks.
Introduction
Antallet krystallstrukturer av proteiner og proteinkomplekser økt raskt de siste årene. De presenterer uvurderlige øyeblikksbilder av den strukturelle organisering av disse proteinene, og gir grunnlag for struktur-funksjonsanalyse. Imidlertid dynamikken i proteiner og de konformasjonsendringer, som er avgjørende for deres funksjoner, er sjelden åpenbart av røntgenkrystallografi. Cryo-elektron, på den annen side, er i stand til å fange protein og proteinkomplekser i forskjellige konformasjoner, men generelt kan ikke løse konformasjonsendringer ned til sekundær struktur nivå 1. Konformasjonsendring dynamikk proteiner i oppløsning ved atom detaljer kan bare løses ved NMR, men denne metoden er fortsatt begrenset til proteiner i forholdsvis små størrelser (generelt ≤ 30 kDa) og trenger høye konsentrasjoner av proteiner (≥ 100 mm), noe som vanskeliggjør forsøk med oligomerization eller aggregering utsatt proteiner to. En metode somer i stand til å bygge bro mellom høy oppløsning røntgenkrystallografi og cryo-elektron og som ikke er begrenset av protein størrelse eller konsentrasjonen er hydrogen amid-1 H / 2 H-utveksling (HX) i kombinasjon med massespektrometri (MS). Denne metoden har de siste årene utviklet seg til et verdifullt analytisk verktøy for analyse av protein dynamikk, proteinfolding, protein stabilitet og konformasjonsendringer 3-5. Den molekylære basis for denne metoden er den labile naturen til ryggraden amid-hydrogener i proteiner, som vil utveksler med deuterium-atomer når proteinet er plassert i en D-2-O-løsning. Den påfølgende økning i proteinmassen over tid måles med høy oppløsning MS.
I korte ustrukturerte peptider HX bare er avhengig av temperatur, katalysatorkonsentrasjon (OH -, H 3 O + dvs. pH, se figur 3) og aminosyre-sidekjeder av tilstøtende rester på grunn av induktiv, kattalytic og steriske effekter. Disse effekter på den iboende kjemiske kursen k ch er elegant kvantifisert ved Bai et al. 6. og et program er tilgjengelig (gjengitt med Z. Zhang), som beregner k ch for hver aminosyre i et polypeptid som er avhengig av pH og temperatur. Ved nøytral pH og temperaturer k ch er i størrelsesorden av 10 1 -10 3 sek -1. I foldede proteiner kan HX være 2-9 størrelsesordener langsommere hovedsakelig på grunn av hydrogenbinding i den sekundære struktur og til en mindre grad på grunn av begrenset tilgang av hydratiserte OH - ioner i det indre av en tett foldet protein. HX i native proteiner impliserer derfor delvis eller global utfoldelse, kjemisk utveksling og refolding til den opprinnelige tilstanden i henhold til ligning (1) og observerte valutakurser k obs avhenger åpning pris k op, sluttkursen k cl og den iboende kjemisk utveksling rate k ch i henhold til ligning (2).
Under innfødte state k op er mye mindre enn k lm og kan neglisjeres i nevneren. Det er to ekstreme valutaregimer kalt EX1 og EX2. Hvis k cl er mye mindre enn k lm (EX1) den observerte hastighet er praktisk talt lik åpningsfrekvensen og HX tillater umiddelbar observasjon av utfoldelsen av et strukturelt element. En slik utveksling regime, hvor alle amid-protoner veksling med en gang ved åpning av det strukturelle element, er lett observerbar ved MS av en bimodal fordeling av isotopen toppene 7. Hvis k cl er mye større enn k lm (EX2) den observerte hastighet er proporsjonal med k ch hvorved proporsjonalitetskonstanten er lik brette-utfolding likevekter konstant K u = k op cl. Under disse forholdene, mange åpning og lukking hendelser er nødvendig før all amid protoner bytte for deuterons, som fører til en gradvis økning i gjennomsnittlig masse mens isotoper fordelingen forblir omtrent det samme. Den EX2 regime tillater bestemmelse av den frie energi for utfolding ΔG u og dermed stabiliteten av et strukturelt element. Under naturlige tilstand tilstand EX2 regimet er mest vanlig. Økning av pH og tillegg av chaotropiske agenter kan skifte utveksling mekanisme for å EX1. Derfor kan HX-MS brukes til å utforske termodynamiske og kinetiske parametre for proteinfolding og konformasjonsendringer.
Som nevnt ovenfor HX er iboende pH-og temperaturavhengig, og vekslingshalveringstiden for et helt løsningsmiddel utsettes proton av ryggraden amidgruppe er mellom 5 til 400 msek ved fysiologisk pH (pH 7,6) og 30 ° C, men 10 min til> 15 timer med et gjennomsnitt på> 2 timer ved pH 2,9 og 0 °C (unntatt for protonet i det første ryggraden amidbinding av et polypeptid, som utveksling med en halveringstid på ca. 1-2 min). Under slike treg utveksle forhold det er mulig å fordøye prøven ved hjelp av proteaser (f.eks pepsin) som er aktive under disse forholdene, uten å miste all informasjon som finnes i de inkorporerte deuterons. Siden introduksjonen av peptisk fordøyelse under forhold med liten utveksling av betingelser, kan ikke bare de samlede HX kinetikken for full-lengde proteiner analyseres men HX kan være lokalisert til spesifikke regioner 8,9. Romlig oppløsning er for tiden begrenset til størrelsen på peptisk fragmenter genereres, noe som er generelt mellom 10 til 30 rester. Imidlertid kan overlappende fragmenter som er opprettet på grunn av den ikke-spesifikke karakter av spalting av pepsin føre til en økning i romlig oppløsning. I tillegg ble flere andre proteaser funnet å være aktiv etter dempingen forholdene, men mye mindre effektiv enn Pepsin 10. Videre øktese av romlig oppløsning kan nås med fragmentering av peptider i gassfase ved hjelp av metoder som bevarte den deutereringsgrad mønster som elektron-fangst dissosiasjon (ECD), elektron overføring dissosiasjon (ETD) og infrarød multiphoton dissosiasjon (IRMPD) 11-13. Disse teknikkene hindre tap av romlig oppløsning på grunn av intramolekylær proton migrasjon ("scrambling"), som er observert av kollisjons-indusert dissosiasjon (CID) er det mest brukte fragmentering teknikken. Men disse metoder krever optimalisering for hver enkelt peptid, og er således fremdeles ganske krevende.
HX-MS ble benyttet for å analysere protein-ligand-og protein-protein interaksjoner blant annet viralt kapsid enheten 14-17. Protein utfoldelse og refolding samt temperaturinduserte konformasjonsendringer ble undersøkt 7,18,19. Fosforylering og enkelt aminosyre mutasjon relaterte konformasjonsendringer 16,20 og nucleotide-induserte endringer ble analysert 21,22. Derfor synes denne metoden ideelt egnet til å analysere montering og dynamikken i molekylære maskiner. En attraktiv kandidat, hvis mekanismen er av stor allmenn interesse, er det Hsp90 anstand kompleks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forberedelse av buffere og proteinprøver
- Forbered H 2 O buffer. Bruk Hsp90 standard buffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) i H 2 O buffer.
Merk: Hvis prøven ble dialysert før analysen bruker dialyse buffer som H 2 O buffer. Det er viktig at D 2 O buffer er forskjellig fra H 2 O buffer bare i hydrogen isotop. Flyktige buffere som NH 4 CO 3 eller 4-NH-eller acetat-bufferkomponenter er ikke egnet! - Forbered D 2 O buffer ved lyofilisering av Hsp90 standard buffer ved bruk av en vakuum-konsentrator. Etter fullstendig fordampning av H2O legge ren D 2 O i røret for å nå den opprinnelige totale volum (for eksempel 1 ml buffer med 15% glycerol krever tilsetning av 850 pl D 2 O). Gjenta den fullstendige fordampning av buffer og gjenoppløse buffer / salt comkomponenter i D 2 O 2x.
- Forbered slukke buffer (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2).
Merk: For å forbedre effektiviteten av peptisk sammendrag av svært stabile proteiner 4 M guanidin hydroklorid og 0,5 M Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) kan legges. - Forbered 100% kontrollutvalget (6 M guanidin hydroklorid, D 2 O). Legg guanidin-hydroklorid til en Hsp90 alikvot for å nå en sluttkonsentrasjon på 6 M. fullstendig fordampe H 2 O fra prøven og tilsett D 2 O i røret for å nå den opprinnelige totale volum (f. eks 100 pl prøve med 10% glycerol krever tilsetning 90 pl D 2 O). Gjenta den fullstendige fordampning av buffer, og de gjenoppløse buffer / saltkomponentene i D 2 O.
Merk: 20-100 pmol av prøve som kreves for hver injeksjon. Forbered nok prøve å ha en 100% kontroll for hver dag av HX-MS eksperimenter. - Forbered 50 pmol Hsp90 i 5 mL Hsp90 standard buffer.
Merk: En mengde av 20-100 pmol av prøve som kreves for hvert punkt av rådata. Volumet av prøven i reaksjonen er 1-5 mL ideell. Juster konsentrasjon for å passe disse kravene. Enhver buffer kan bli brukt så lenge som den ikke inneholder vaskemidler eller flyktige komponenter.
2. Utarbeidelse av immobilisert Pepsin på Aldehyde Aktivert Perler
- Oppløs 80 mg friskt pepsin i 2 ml 50 mM natriumcitrat (pH 5).
- Oppløs 20 mg natriumcyanborhydrid, behandles med forsiktighet (meget giftig!) I en ml 2 M Na 2 SO 4 og legge til pepsin løsning.
- Inkuber blandingen i 10 minutter ved romtemperatur mens forsiktig agitering (f.eks liggende shaker).
- Legg 600 mg perler med immobilisert aldehydgruppene til blandingen og inkuberes i 5-10 minutter ved romtemperatur.
- Til 2,2 ml av 2 M Na 2 SO4 (pH 5) i 100 mL alikvoter hver 3 minutter i løpet av en time til langsomt salt ut pepsin. Bland prøven mellom tilsetningene i en overhead-risteapparat ved romtemperatur.
- Inkuber pepsin perler ved 4 ° C i 14-16 t / over natten i et overliggende shaker.
- Stans reaksjonen ved tilsetning av 1 ml 1 M etanolamin og inkubasjon ved romtemperatur i 2 timer.
- Spinn ned perler i et 50 ml Falcon rør ved 500 rpm, kast supernatant og resuspender perlene i 0,1% maursyre. Gjenta dette trinnet 2x. Etter den siste sentrifugeringstrinnet, kast supernatant og anslaget volumet av kulene. Til et tilsvarende volum av 0,1% maursyre og lagre ved 4 ° C.
Tre. Utarbeidelse av kolonner for Amid Hydrogen-utveksling
- Bruk vakt kolonner med en indre diameter på 1 mm for overlapping kolonner og med 2 mm for pepsin kolonner.
- Skru den ene siden av beskyttelseskolonne og fjerne filteret. Tett skru pakking funnel i den åpne enden av kolonnen. Bruke en 1/16 tomme adapter og slangen for å feste en tom sprøyte (5 ml) til bunnutløpet av kolonnen. Sørg for å fikse det gasstett til vakten kolonnen.
- Påfør noen dråper av oppslemning perle materiale på toppen av trakten. Trekk stempelet av sprøyten for å suge av oppslemmingen gjennom trakten til vaktkolonne. Påfør mer slurry perle materiale på trakten og fortsette prosedyren til vakten kolonnen er helt fylt med perle materiale. Fjern trakten og plassere filteret og filterringen på den åpne ende. Cap kolonnen tett skru på vakt kolonnen og fjern sprøyten fra den andre siden. Lukk begge ender av vakt kolonner med plugger for å unngå uttørking av kolonnematerialet.
4. Sette opp System for Hydrogen Exchange-massespektrometri (HX-MS)
- Koble fellen kolonne med HPLC-system (fig. 1). Ekvilibrer kolonnen ved å innstille strømningsmengden avpumpe A til 0,4 ml / min med 0,1% maursyre som oppløsningsmiddel. Ikke koble pepsin kolonnen eller den analytiske kolonnen ennå.
- Kalibrer massespektrometer, og å forbinde utløpet av HPLC til kilden av massespektrometer.
5. Fastsettelse av Dynamic Range av Exchange
- Forbered ultraløsningsmiddel A (0,1% maursyre i vann) og løsningsmiddel B ultrarent (0,1% maursyre i acetonitril), klar blandet oppløsningsmidler er kommersielt tilgjengelige. Rens HPLC pumper. Sett opp-kromatografi og massespektrometri metoder i styreprogramvaren ved å velge et program med en trinn-gradient etter en kort avsalting trinn. For full-lengde Hsp90 bruke en 1-2 min avsalting trinn etterfulgt av å slå av 6-portventilen fra avsalte / LOAD for å eluere og en trinngradient fra 90% løsningsmiddel A/10% løsningsmiddel B til 5% løsningsmiddel A/95% løsningsmiddel B. Før injeksjon satt injeksjonsventilen til belastning og den 6-port ventil for å avsalte / LASTER posisjon.
Note: Ikke bruk en pepsin eller analytisk kolonne under dette eksperimentet. - Forbered 100-200 pmol av Hsp90 i 1-10 mL H 2 O buffer og inkuberes i 10 minutter ved 30 ° C. Legg temperaturen justeres D 2 O buffer for å bringe prøvevolum opp til 100 mL og inkuberes akkurat for en definert tidsperiode (f.eks 10 sek, 100 sek, 1000 sek). Tilsett 100 mL quench buffer og bland ved pipettering opp og ned. Injiser 200 pl prøven inn i injeksjonsåpningen for injeksjonsventil med en Hamilton sprøyte. Start kromatografi programmet og slå injeksjonsventilen inn INJECT posisjon. Etter 2 min slå om 6-port ventil fra avsalte / LASTER å eluere. Gjenta dette minst tre tidspunkter.
- Gjenta trinn 5.2, men tilsett 2-3x overskudd av Sti1 til Hsp90 prøven før inkubering i 10 min ved 30 ° C.
- Bestem full lengde protein massene ved deconvolution av spektra i massespektrometri programvare. Beregn antall innarbeidelseed deuterons ved å sammenlikne molekylvekten for full-lengde Hsp90 med den observerte massen etter hver kjøring (som 10 sek, 100 sek, 1000 sek).
- Plott innlemmet deuterons for Hsp90 i fravær og nærvær av Sti1 (y-aksen) versus tid (x-aksen). Bestem tiden-punkt i det dynamiske området, hvor differansen mellom de to kurvene er maksimal. Bruk denne verdien for inkubasjonstid i D 2 O når identifisere Hsp90-Sti1 grensesnitt og dynamikk på peptid nivå.
6. Fastsettelse av peptic Peptider Bruke MS / MS Spectra
- Koble pepsin kolonne og analytiske kolonnen i systemet.
- Sett opp parametrene for kromatografi og massespektrometri i styreprogramvaren ved å velge gradient type og massespektrometri metode. Velg en lang gradient (for eksempel mer enn 90 min) for å sikre god kromatografisk oppløsning. Aktiver MS / MS spektra på massespektrometer.
Merk: God oppløsningsjon på HPLC og høy massenøyaktighet har høyest prioritet i dette trinnet. - Forbered 100-200 pmol av Hsp90 i 100 pl H to O buffer. Tilsett 100 mL quench buffer og bland ved pipettering opp og ned. Injiser 200 pl prøven inn i injeksjonsåpningen for injeksjonsventil med en Hamilton sprøyte. Start kromatografi programmet og slå injeksjonsventilen inn INJECT posisjon. Etter 2 min slå om 6-port ventil fra avsalte / LASTER å eluere posisjon.
Merk: Hvis mer enn ett protein som skal analyseres i HX-MS (dvs. protein-protein interaksjon grensesnitt) peptider for hvert protein må bestemmes individuelt. - Identifiser peptisk peptidene Hsp90 ved å søke i en database (dvs. Mascot) for de resulterende peptider.
Merk: Det er mulig å bruke en tilpasset database som målet er å finne så mange peptic peptider som mulig og analyse er gjort med renset protein. Sample renhet vil have å bli tatt i betraktning. - Gjenta dette trinn uten MS / MS og med stigning som vil bli benyttet for den faktiske HX eksperimentet. For Hsp90 og Sti1 bruke en 10 min gradient fra 90% løsningsmiddel A/10% løsningsmiddel B til 45% løsningsmiddel A/55% løsningsmiddel B.
Merk: Stigninger er normalt mellom 5-15 min og svært avhengig av prøven kompleksitet og HX systemspesifikasjoner. - Bestem oppholdstidene i de peptisk peptider identifisert i 6.4 i gradienten benyttet i 6.5 og opprette en liste som omfatter 1). Peptidsekvens 2). Peptid ladetilstand og 3). Retensjonstid. Dette vil bli brukt til å identifisere hvert peptid etter HX eksperimenter.
Merk: Vær oppmerksom på at peptider med liten m / z forskjeller, identisk ladestatus og identisk oppholdstid kan være en kilde til tvetydighet.
7. Identifisering av Protein-protein interaksjons Grensesnitt
- Sett opp gradient og massespektrometri metode i kontroll software. Bruk en 10 min lineær gradient fra 90% løsningsmiddel A/10% løsningsmiddel B til 45% løsningsmiddel A/55% løsningsmiddel B. Legg en massespektrometri metode som er optimalisert for deteksjon av massene mellom 300-1,500 m / z, selv om de fleste peptidene vil være under 1,000 m / z. Sett injeksjonsventilen inn LOAD posisjon, den 6-port ventil i lasting / avsalting posisjon. Sett strømningshastigheten av lastepumpen til 0,4 ml / min.
Merk: Lengde og type gradient er utvalget avhengig og må kanskje være optimalisert. Lengre stigninger forbedre oppløsningen av kromatografi, men redusere inkorporering av deuterons til proteiner på grunn av back-utveksling. De valgte metoder må være den samme for alle eksperimenter som skal sammenlignes. - For unexchanged referanse forberede 20-100 pmol for Hsp90 i 100 pl H to O buffer. Tilsett 100 ul iskald quench buffer, pipette opp og ned to ganger og injiser prøven inn i injeksjonsventilen av HPLC. Umiddelbart starte kromatografi program og swklø injeksjonsventilen inn INJECT stilling. Etter 2 min slå om 6-port ventil fra avsalte / LASTER å eluere posisjon. Gjør dette for Hsp90 og Sti1 individuelt og for blandingen av proteiner.
- Forbered 20-100 pmol for Hsp90 i et volum på 1-5 pl. Legg temperaturen justeres D 2 O buffer for å bringe prøvevolum opp til 100 mL og inkuberes akkurat for en definert tidsperiode (f.eks 30 sek, for konformasjonsforandringer dynamikk se merknad). Tilsett 100 ul iskald quench buffer, pipette opp og ned to ganger og raskt injisere 200 ul i injeksjonsventilen på HPLC. Umiddelbart starte kromatografi programmet og slå injeksjonsventilen inn INJECT posisjon. Etter 2 min slå om 6-port ventil fra avsalte / LASTER å eluere posisjon. Gjøre dette for hver protein individuelt, for å bestemme deuteron inkorporering i hvert peptid i fravær av samspill protein.
Merk: Ved å studere dynamikken i conformational endringer, gjenta eksperimentet med ulike inkubasjonstidene av Hsp90 i D 2 O buffer. Prøv å dekke et bredt tidsskala ved å velge inkubasjonstidene logaritmisk (f.eks 10 sek, 30 sek, 100 sek, 300 sek, 1000 sek, etc.). D 2 O buffer og prøvebuffer må være nøyaktig identiske med unntak av hydrogen isotop. - Forbered en lik mengde av 100% kontrollutvalget (20-100 pmol) og legge til D 2 O buffer for å bringe prøvevolum opp til 100 mL. Tilsett 100 ul iskald quench buffer, pipette opp og ned to ganger og raskt injisere 200 ul i injeksjonsventilen på HPLC. Umiddelbart starte kromatografi programmet og slå injeksjonsventilen inn INJECT posisjon. Etter 2 min slå om 6-port ventil fra avsalte / LASTER å eluere posisjon.
- For å bestemme samspillet overflaten blande Hsp90 med en minst to ganger over Sti1 å forskyve likevekten til den bundet tilstand (se merknad) og inkuberesved den ønskede temperatur før kompleksdannelse er ved likevekt. Legg temperaturen justeres D 2 O buffer for å bringe prøvevolum opp til 100 mL og inkuberes akkurat for en definert tidsperiode (f.eks 30 sek). Tilsett 100 ul iskald quench buffer, pipette opp og ned to ganger og raskt injiseres inn i injeksjonsventilen av HPLC. Etter 2 min slå om 6-port ventil fra avsalte / LASTER å eluere posisjon. Gjenta dette eksperimentet med 20-100 pmol av Sti1 og overskudd av Hsp90.
Merk: De absolutte konsentrasjoner avhenger av dissosiasjon likevektskonstanten til interaksjon. Ideelt sett, etter fortynning til D 2 O konsentrasjonen av proteinet tilsettes i overskudd bør være minst 10 ganger høyere K D (tilsvarende> 85% av den nedre konsentrerte proteinbundet). - Analysere de innsamlede data med egnet programvare og bruke oppholdstidene bestemmes i trinn 6.5 til å finne hvert peptid i analysen. Beregningente centroid av isotopen fordelingen for unexchanged protein (trinn 7.2) og for de HX eksperimenter (trinn 7.3).
Merk: Selv om isotopen mønstre av utvekslet peptider ser annerledes ut fra sine unexchanged kolleger, både kunnskapen om ladestatus peptid og høymesse nøyaktigheten av massespektrometer gir enkel bestemmelse av centroids. - Sammenlign inkorporering av deuterons av målprotein alene og sammen med overskudd av bindingspartner. Dette kan gjøres automatisk med kommersiell programvare eller manuelt med et regnearkprogram. De 100% kontroll eksempelverdier betegne den maksimale veksling for hvert peptid, og kan brukes til å bestemme mengden av D 2 O etikett tapt under forsøket på grunn av rygg utveksling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hsp90 er en molekylær anstand i gjær og medlem av Hsp90 anstand familien. Ved å gå gjennom en kompleks ATPase syklus det hjelper sene folding trinn av mange protein klienter. Effektiv folding krever overføring av kunder fra Hsp70 og samhandling av co-anstand Sti1/Hop. Sti1 bindes direkte til Hsp90 og letter klient binding ved hemming av Hsp90 sin ATPase-aktivitet. Interaksjon av Hsp90 med Sti1 ble nylig studert ved hjelp av HX-MS 23. Her presenterer representative resultater fra de underliggende eksperimenter etter den ovennevnte protokoll.
Den direkte protein-protein interaksjon ble testet ved merking av protein-komplekset i likevekt med D 2 O og sammenligne Sti1 peptid spektra i fravær og nærvær av Hsp90.The resulterende forskjell plott kan sees i figur 5A (data fra 23). Peptidene er orientert fra topp til bunn som starter ved N-terminus. For det meste peptider iTPR2a og TPR2b viser en sterk beskyttelse i nærvær av Hsp90 (negative verdier for D + Hsp90 - D-Hsp90), noe som indikerer at disse regionene samhandle med Hsp90. Beskyttelsen i TPR2a kan enkelt rasjonalisert fra krystallstrukturen av Sti1-TPR2a-TPR2b i kompleks med et peptid som tilsvarer det C-terminale MEEVD-motivet av Hsp90 (figur 5B). En slik klar beskyttelse i protein-protein interaksjoner er ikke alltid observert. Beskyttelsen i Hsp90 i nærvær av Sti1 er ikke så uttalt og ikke som lokaliserte som i Sti1 (Figur 5C og 5D). Alle peptider viser noe økt beskyttelse mot deuteron innlemmelse i nærvær av Sti1. Sti1 åpenbart stabiliserer Hsp90 globalt som ingen region av proteinet viser mer fleksibilitet i nærvær av Sti1. Vi kan imidlertid ikke skille, hvis dette reduserte deuteron inkorporering stammer fra direkte interaksjon med Sti1 eller gjennom allosteriske effekter på konformasjonfor Hsp90. Den informasjonen vi får reduserer den antatte interaksjon nettstedet til noen peptider (f.eks peptid 43-62 av NBD). Andre eksperimenter som kryssbinding blir ofte brukt til å bekrefte de bindingssteder etter HX-MS 23. Av notatet, er sekvensen dekning av Hsp90 redusert ved måling av Hsp90-Sti1 kompleks. Siden Sti1 ble lagt i 3,5-fold overflødig den teoretiske totale mengden av peptider i analysen var noen firedelte høyere enn med Hsp90 alene. Dette øker risikoen for Sti1 peptider overskygger eller overlappende Hsp90 peptider under analysen. For å optimalisere for høyere sekvens dekning bedre kromatografisk separasjon synes å være den mest lovende tilnærming.
En mulighet for å studere dynamikken i forskjellige protein regioner er bruken av kontinuerlig merking HX-MS. Det innebærer inkubasjon av prøven ekvilibrert protein i D 2 O i forskjellige tidsperioder, og derfor tillater forutsigelser om stabilitetenindividuelle proteinsegmenter. Figur 6 illustrerer spektra av peptidet 43-62 fra NBD av Hsp90 i nærvær og fravær av en 3,5-gangers overskudd av Sti1. De inkubasjonstider ble valgt på en logaritmisk skala (10 sek, 100 sek og 1000 sek) for å få god dekning over et bredt tidsvindu. De peptid-spektra viser en tidsavhengig inkorporering av deuterium i proteinet som øker i lengre inkubasjonstider. For peptid 43-62 utveksling følger EX2 mekanisme der k int << k cl. Graden av beskyttelse forandrer hele inkubasjonstid, som viser den store forskjellen på kortere inkubasjonstid og nesten lik kursen på det lengste punkt. Dette tyder på en lavere grad stabilisering eller en region av dynamiske interaksjoner med hyppige dissosiasjon og assosiering. Enten den observerte beskyttelse skyldes en generell redusert kursen av amid-protoner i peptidet eller effekten kan bli tildelt til en eller tospesifikke amid protoner som utveksler saktere i nærvær av Sti1. I dette tilfellet den sistnevnte er mye mer sannsynlig som Hsp90 krystallstruktur viste denne region kan være en eksponert sløyfe i stedet for en vanlig sekundær struktur som α-helikser eller β-ark.
Det er viktig å nevne at ryggen veksling ikke er blitt trukket ut fra data vist antyder at de observerte virkninger blir mer markert når normalisert til kontroll 100%.
Figur 1. HPLC oppsett for HX-MS. a) typisk konfigurasjon av et HX-MS oppstilling. De forskjellige fargede områder representerer seksjoner holdt ved forskjellige temperaturer. Prøven injiseres inn i prøvesløyfen for injeksjonsventilen (i lastmodus, cyan), og etter å ha slått ventilen inn i "injisere mode" (sort) pumpes viapepsin kolonne inn i den seks-port-ventilen. Den pepsin kolonnen holdes omtrent ved 10 ° C for å forbedre enzymatiske aktivitet av pepsin. Den 6-port ventil har to moduser, "Lasting / avsalting Mode" og "Elution Mode" (se b). Etter avsalting av prøven peptidene er kromatografisk adskilt med en acetonitril-gradient på en analytisk reversfase-kolonnen. Peptidene blir deretter sprøytet inn i massespektrometer med en ESI-kilde. B) Modes of 6-portventilen. Rett etter HX den 6-port ventilen er i "Loading / avsalting Position" å felle de peptic peptider på fellen kolonnen. Dette fortsettes i opp til tre minutter for å fjerne alle salter eller forbindelser med reaksjonsbuffere som kan forstyrre massespektrometri. Etter dette 6-portventil brytere i "Eluering Mode" sette lastet felle kolonnen inn i strømningsbanen mellom pumpen og gradient analytisk kolonne. De fanget peptic peptider nå elueres fra fellen column og blir separert i en gradient av 0,1% maursyre acid/0.1% maursyre i acetonitril.
Figur 2. Flow ordningen med en HX eksperiment. 1) Target protein er renset og leveres i standardbuffere uten vaskemiddel. 2) Proteinet blir enzymatisk spaltet med pepsin og peptisk peptider er identifisert og karakterisert ved tandem massespektrometri (MS / MS). Først etter å skaffe sekvens, belaste staten og oppholdstid på så mange peptider som mulig HX-MS kan bli vellykket utført. 3) Forsøksbetingelsene er satt opp som for eksempel inkubering av proteinet under visse betingelser (addisjon av ligand / kjemisk forbindelse eller forskyvning i temperatur eller pH-verdi 4). HX utføres ved å fortynne prøven 1:10 eller høyere i D 2 O buffer . D 2 O buffer må være identisk med prøvebuffer for å AVOid buffereffekter. Da prøven inkuberes nøyaktig for en definert tidsperiode. 5) Etter inkubasjon reaksjonen bråkjølt og injisert i HPLC-MS system. Prøven er enzymatisk spaltet og de resulterende peptisk peptider separeres i et organisk oppløsningsmiddel-gradient, og sprøytet inn i massespektrometeret. 6) Analyse av det oppnådde peptid spektra. De centroids av peptid spektra sammenlignes under forskjellige reaksjonsbetingelser. Dette kan gjøres manuelt med egnet programvare, eller automatisk av en HX analyseprogram.
Figur 3. Hydrogen utvekslingsmekanisme. Reaksjonen av hydrogen utveksling kan katalyseres med base-eller syre, og derfor er pH-avhengig med en minimal kursen mellom pH 2,5 og 3 avhengig av sidekjedene i restene flankerer amidbinding 6.. During avsalting og kromatografisk separasjon av peptider, som er utført i H 2 O-inneholdende løsningsmidler, er inkorporert deuterons utvekslet tilbake for protoner i henhold til den samme mekanisme ("back exchange"). Derfor er optimalisering av systemet, og som benyttes oppløsningsmidler avgjørende for å redusere tapet av inkorporerte deuterons.
Figur 4. Prinsippet om HX-MS. Binding av en ligand til proteinet resulterer i beskyttelse av amidet ryggrad hydrogenatomer på bindingsstedet fra det omgivende oppløsningsmiddel. Dette reduserer valutakursene til berørte protoner og reduserer inkorporering av deuterons. Fordi vektforskjellen mellom proton og deuteron er 1. Da vil peptider avledet fra denne regionen av proteinet viser en nedre m / z in massespektrometri. Sammenligning av peptid-spektra av forsøkenei fravær og nærvær av bindingspartner vil avdekke en forskyvning av tyngdepunktet til en spektra til å senke m / z-verdier (beskyttelsesarrangement). Regioner som viser fremtredende beskyttelse etter tilsetning av bindingspartner er potensielle bindingsseter. Avhengig av den sekvens dekning og tilgjengeligheten av overlappende peptider bindingsseter kan begrenses til noen få aminosyrer.
Figur 5. Samspill Hsp90 og Sti1. en, Difference tomt på deuteron innlemmelse i Sti1 i nærvær av bindende partner Hsp90 minus deuteron innlemmelse i Sti1 i fravær av Hsp90 (Data fra 23). b, Cartoon representasjon av et fragment av Sti1 bestående TPR2a og TPR2b (PDB kode 3UQ3) i kompleks med et peptid som tilsvarer det C-terminale MEEVD-motivet av Hsp90. Tegneserien er farget hending til antall amid-protoner beskyttet mot deuteron inkorporering som angitt. c, Difference plott av Hsp90 i nærvær av bindingspartner Sti1. Observert deuteron inkorporering i Hsp90 etter 10 minutters preinkubering med 3,5 x overskudd Sti1 ved 30 ° C og 30 sek; HX ved den samme temperatur. Forsøket ble utført i triplikat, og standard feil av gjennomsnittet er vist for hvert peptid. Globale negative verdier betegne redusert inkorporering av deuterons og derfor høyere generelle stabiliteten av Hsp90 i nærvær av Sti1. Tilbake utveksling ble ikke vurdert i dette eksperimentet. D, Cartoon representasjon av gjær Hsp90 (PDB kode 2CG9) farget i henhold til antall amid protoner beskyttet mot deuteron inkorporering som angitt i b.. Klikk her for å se større figur .
Figur 7. Eksempler på peptid spektra med bimodal distribution. en, deuteron innlemmelse i E. coli Hsp90 i fravær og nærvær av ATP (data hentet fra 22 suppl. Figur 3). Spectra of peptide rester 192 til 206 er vist før inkubasjon i D 2 O (0% D), etter 30 sekunder, 5 min, 10 min og 30 min inkubasjon i D 2 O, og kontrollen 100% (100% D) . I fravær av ATP (-ATP) en typisk EX2 utveksling oppførsel observeres. I nærvær av ATP (+ ATP) en sterk beskyttelse er observert ved 30 sek og ved 5 min og 10 min bimodale fordelinger av isotop-toppene, noe som viser to populasjoner av proteiner, en populasjon som ligner på den ATP-bundet tilstand, og en andre tilsvarende nucleotide-fri tilstand. Ved 30 min ingen forskjell mellom fravær og nærvær av ATP er observert. Den bimodal fordeling er mest sannsynlig forårsaket av ATP hydrolyse og overgang gjennom nucleotide-fri tilstand med høyere fleksibilitet i dette proteinet segmentet. Disse spektrene ligne en klassisk EX1 utvekslings regimeg. b, Bimodal fordeling av isotop-topper i puls-merking HX eksperimenter. E. coli Hsp90 ble inkubert i fravær av ATP eller i nærvær av ATP i 10-300 sekunder, og deretter puls-merket i 10 sekunder i D 2 O som indikert (data tatt fra 22 figur 4A). Den bimodale fordelinger viser igjen to sameksisterende populasjoner av molekyler, en utveksling raskere amid-protoner for deuterons enn den andre. ATP induserer en langsom overgang fra den hurtigere utveksling inn i den langsommere utveksling konformasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Binding av en interaksjon partner til et protein som forårsaker uunngåelig forandringer i løsningsmiddel tilgang på bindingsstedet. I tillegg er mange proteiner gjennomgår dynamisk konformasjonsendringer ved binding, noe som påvirker andre deler enn de faktiske bindingsgrensesnittet. HX-MS er en robust metode for å overvåke disse endringene og er selv i stand til å avsløre konformasjonsendringer i proteiner på tidsskalaer som andre metoder ikke kan dekke.
For å kunne utføre HX-MS tre punktene er avgjørende: 1) en optimal systemoppsettet, 2) presis gjennomføring av utvalgets behandling og 3) forsiktig dataanalyse når de tildeler peptid spektra og tolke resultatene.
Systemoppsettet
Siden massespektrometri benyttes for detektering av deuteron inkorporering i peptidene, de samme forholdsregler for prøvepreparering søke HX-MS. Vaskemidler, salter og andre stoffer som forstyrrer massespektrometri should unngås eller fjernes før analyse. Mens HX-MS gjør det mulig for analyse av store proteinkomplekser, krever den høyere kompleksitet økt kvalitet på peptid-separering og massespektrometri. Optimalisering av kromatografiske betingelser er nøkkelen til å oppnå god kvalitet data. Dette innebærer valg av høy kvalitet, organiske løsningsmidler, reversert-fase-materiale så vel som optimalisering av gradienter og løsningsmidler. Vasking av søyler med organiske løsningsmidler som kan gjøres mellom eksperimenter og over natten for å redusere bakgrunnssignalet. Massespektrometri metoder skal være optimalisert for påvisning av peptic peptider (mellom 300-1,200 m / z). Høyoppløselige massespektrometre stor grad forenkle dataanalyse fordi de delvis overlapp isotop-peak klynger som stammer fra forskjellige peptider kan skilles.
Behandlingen av prøvene er avgjørende for HX-MS. Vanligvis våre buffere og prøvene blir spunnet ned i 10 min ved 13 000 rpm (microfuge) for å fjerne aggregater og særcles. I tillegg kan flere inline filter være installert i HPLC-systemet for å forhindre tilstopping av kolonnene. Mindre avvik i D 2 O inkubasjonstidene kan ha store effekter. For svært fleksible protein regioner en forskjell på bare noen få sekunder kan utgjøre forskjellen mellom ingen deuteron innlemmelse i det hele tatt og full deutereringsgrad. Siden protein dynamikk samt egenkursen er en funksjon av temperatur, inkubering av prøven og buffere er tett temperaturregulering. Det er fordelaktig å alltid gjentar den nøyaktige sekvens av trinn for hvert eksperiment. Hvis utført riktig feilen mellom to eksperimenter vil være relativt liten. Dag, automatiserte systemer for HX-MS er kommersielt tilgjengelige og redusere utfordringene i prøvebehandling.
Analyse av dataene
Den mest kritiske trinn i HX-MS analyse av data, særlig tilordningen av peptid-spektra og bestemmelse av Deutereringsgraden nivåer. The produksjon av HX-MS er en elueringsprofil for det kromatografiske gradient inneholdende et stort antall peptid spektra. Den torer oppgave er å tilordne disse spektrene til de peptider som er identifisert ved MS / MS i trinn 6) i protokollen. Dette kan være noe vanskelig som spektrene kan betydelig skifte mot høyere m / z etter HX. Også den delvis overlapp av spektre kan komplisere tildelingen av peptider. I dette tilfellet bruk av høyoppløselige massespektrometre med høy masse nøyaktighet lønner seg fordi de ofte kan løse overlappende peptider. Forskjeller i deuteron innlemmelse er beregnet basert på centroids av peptid spektra. De centroids kan bestemmes: 1) manuelt ved å merke hver isotop toppen av et peptid spektrum og overføre sine verdier for intensitet og m / z inn i et regnearkprogram (f.eks Excel, Microsoft) og beregning av Tyngdepunktet eller to) med programvare utviklet for å tildele de isotop-topper som tilhører en identifisert peptid og å beregnecentroids automatisk (f.eks HDExaminer, Sierra Analytics eller HeXicon 24,25).
Optimalisering av HX-MS
Hvis antallet av evaluerbare peptider er for lav, er det flere andre muligheter for å optimalisere forsøket: 1) optimaliseres kromatografi (løsningsmidler, lengde / formen gradient, bruk av forskjellige reversert-fase-materiale) eller 2) endring av den enzymatiske spaltning av protein (alternativt protease, lengre / kortere inkubasjonstid med pepsin, tilsetning av denatureringsmiddel til quench-buffer). Begge parametrene endre elusjonen oppførsel av peptider som de enten endre peptid bassenget selv eller HPLC separasjon. Begge optimalisering tilnærminger kommer til prisen av behovet for å recharacterize peptider. Andre proteaser vil gi forskjellige peptider som har til å bli identifisert ved MS / MS og karakterisert som beskrevet i trinn 6.6). Endre kromatografi forhold vil ikke endre peptid bassenget, men oppbevaring times av de individuelle peptider. Retensjonstidene må da være tatt opp på nytt som i trinn 6.5). Det skal nevnes at høyere oppholdstider alltid vil redusere mengden av detekterbart merke som tilbake utveksling øker med lengre oppholdstider. Normalisering av data til kontrollen 100% er den beste måten å håndtere tilbake utveksling. Høy rygg utveksling fører til et tap av innlemmet deuterons og dermed signalet. Det anbefales å redusere mengden av tilbake utveksling til et minimum. Det bør bemerkes at ulike HX-MS oppsett vil ha divergerende forekomst av bak utveksling, avhengig av maskinvaren, sammensetningen av brukte buffere og oppløsningsmidler, og den type gradienter som brukes 26.
Tolke data
Ved analysering av data, må intensiteten av de isotop-toppene som skal evalueres forsiktig, siden det kan gi indikasjoner på utvekslingsmekanisme. For peptider med en masse på mindreenn 2000 Da intensiteter av isotop-toppene i unexchanged prøven er generelt asymmetrisk med høyere intensiteter for monoisotope eller den første høyere isotop topp. For EX2 utveksling regime dette asymmetriske intensitetsfordeling blir Gaussian-aktig med økende tid i D 2 O og økende forskyvning til høyere m / z, og bredden på den isotopiske cluster øke med omtrent 50% (figur 7). Som nevnt i innledningen EX2 er oftest observert i HX-MS henhold opprinnelige tilstander, og den observerte hastighet på utveksling er proporsjonal med likevekten utfolding konstant K u og dermed til den termodynamiske stabilitet av proteinet. I kontrast, for EX1 utveksling regimet bredden fordelingen av isotop klase øker betydelig og bimodal eller multimodale intensitet distribusjoner er observert (se figur 7) 25,27. Bimodale isotop distribusjoner alltid tyder på to eller flere ulike molekyl arteri analysen, noe som er potensielt interessant. Men det er to typer av fallgruver. For det første kan isotopen klynge være sammensatt av topper som kommer fra to forskjellige peptider. Det er derfor nødvendig å kontrollere spektra av unexchanged prøven for peptider med lignende m / z og identisk charge. Slike peptider vanligvis avvike noe i oppholdstid og intensiteten fordeling av isotop-toppene varierer med elueringstid. I høyoppløselige massespektrometre, kan isotop-topper som ikke tilhører den samme peptid også være preget av desimalene av m / z-verdier. For det andre, overføring fra en tidligere HPLC-MS løp er observert 28. En slik overføring vises som nonexchanged arter og kan elimineres ved tomme HPLC gradient går mellom analyse går. Det er mange årsaker til tilsynelatende EX1 utveksling regime. 1) I HX eksperimenter i nærvær av denatureringsmidler EX1 er ofte observert 29. 2) Spontan eller provosert, reversible eller irreversible local eller global utfoldelsen av proteiner fører EX1 atferd 7,30,31. 3) konformasjonsendring overganger som er treg i forhold til HX forårsaket av f.eks underlaget omsetning, ATP hydrolyse føre bimodal isotop distribusjoner ligner EX1 utveksling regime (figur 7a) 22. 4) ligandindusert langsomme conformational overganger i puls-merking eksperimenter viser også et EX1-aktig signatur (figur 7b) 22.
Tolkningen av innhentet data er slutt hva som gjør HX-MS slik utfordrende, men også kraftig teknikk. En bred kunnskap om protein dynamikk er nødvendig for å få hele veien fra de observerte beskyttelse / avbeskyttelses mønstre til en mekanistisk modell av protein dynamikk. Likevel kan produserer høykvalitets HX-MS data gjøres innen relativt kort tid, og er reproduserbar. Tolkningen av data klart fordelen av ytterligere informasjon om strukturen av proteinet investereigated. På den andre siden, kan HX-MS indikere hvilken del av et protein som kan bøyes, noe som kan ha til å bli fjernet for å lette krystallisering for strukturbestemmelse.
HX-MS er en metode som i stor grad tjener på innovasjoner i massespektrometri og kromatografi. Et nylig fremskritt i HX-MS er bruken av lipid nanodiscs for analyse av membranproteiner som ytterligere utvider bruken av denne teknikken 32. Også bruken av elektronoverføring dissosiasjon (ETD) og elektroninnfanging dissosiasjon (ECD) viser sterke potensial HX-MS som det øker oppløsningen innarbeides deuteron til nivået av enkelt aminosyrer 11,12 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker M. Boysen for kommentarer til manuskriptet. Dette prosjektet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 og MA 1278/4-1 til MPM, og Cluster of Excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM er etterforsker av Cluster of Excellence: CellNetworks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| maXis QTOF | Bruker | ||
| nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
| Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
| 6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
| Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
| Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
| Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
| Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
| Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
| Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
| Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
| Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
| Tubing (various diameters) | IDEX | ||
| Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
- Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
- Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
- Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
- Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
- Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
- Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
- Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
- Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
- Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
- Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
- Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
- Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
- Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
- Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
- Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
- Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
- Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
- Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
- Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
- Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
- Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
- Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).
