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Chemistry

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Abstract

Todos os processos celulares dependem da funcionalidade das proteínas. Embora a funcionalidade de uma dada proteína é a consequência directa da sua sequência de aminoácidos única, apenas é realizado pela dobragem da cadeia polipeptídica em um único arranjo tridimensional definido ou mais vulgarmente em um conjunto de conformações interconversão. Investigando a ligação entre a conformação da proteína e sua função é, portanto, essencial para um entendimento completo de como as proteínas são capazes de cumprir a sua grande variedade de tarefas. Uma possibilidade para estudar mudanças de conformação de uma proteína sofre, progredindo através do seu ciclo funcional é hidrogénio-1 H / 2 H-troca em combinação com espectrometria de massa de alta resolução (HX-MS). HX-MS é um método versátil e robusto que acrescenta uma nova dimensão às informações estruturais obtidas por cristalografia por exemplo. Ele é usado para estudar a proteína dobrando e desdobrando, a ligação da pequena molligantes ecule, interações proteína-proteína, mudanças conformacionais ligadas à catálise enzimática e allostery. Além disso, HX-MS é muitas vezes utilizado quando a quantidade de proteína é muito limitada, ou a cristalização da proteína não é viável. Aqui proporciona-se um protocolo geral para o estudo da dinâmica das proteínas com HX-MS e descrevem como um exemplo de como a interface para revelar a interacção de duas proteínas de um complexo.

Introduction

O número de estruturas de cristal de proteínas e complexos de proteína aumentou rapidamente nos últimos anos. Apresentam instantâneos inestimáveis ​​da organização estrutural das proteínas e fornecer uma base para a análise da estrutura-função. No entanto, a dinâmica das proteínas e as mudanças conformacionais, que são essenciais para as suas funções, são raramente revelado por cristalografia de raios-X. Cryo-electronmicroscopy, por outro lado, é capaz de capturar os complexos de proteínas e de proteínas em diferentes conformações, mas geralmente não é possível resolver as alterações conformacionais para baixo para o nível de uma estrutura secundária. Dinâmica de conformação de proteínas em solução em detalhes atómicas só pode ser resolvido por RMN, mas este método é ainda limitado a proteínas de tamanhos relativamente pequenos (geralmente ≤ 30 kDa) e necessita de altas concentrações de proteínas (≥ 100 pM), o que dificulta as experiências com oligomerização ou agregação de proteínas propensas 2. Um método queé capaz de ponte entre a alta resolução de cristalografia de raios-X e crio-electronmicroscopy e que não é limitado pelo tamanho ou a concentração de proteína é de hidrogénio amida-1 H / 2 H-troca (HX) em combinação com espectrometria de massa (MS). Nos últimos anos, este método tem desenvolvido para um instrumento analítico valioso para a análise da dinâmica das proteínas, o dobramento de proteínas, a estabilidade da proteína e alterações conformacionais 3-5. A base molecular deste método é a natureza lábil do backbone hidrogénios de amida em proteínas, que irá trocar com átomos de deutério, quando a proteína é colocada em um D 2 O solução. O consequente aumento da massa de proteína ao longo do tempo é medido com alta resolução MS.

Em péptidos não estruturados curtas só HX depende da temperatura, da concentração do catalisador (OH -, H 3 O + por exemplo pH, ver Figura 3) e as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos adjacentes, devido à indutivo, gatoefeitos alytic e estéricos. Estes efeitos sobre o ch intrínseca taxa de permuta química k foram elegantemente quantificada por Bai et al. 6 e um programa está disponível (por cortesia Z. Zhang), que calcula k ch para cada aminoácido num polipéptido dependente do pH e da temperatura. Em pH neutro e temperatura ambiente k ch é da ordem de 10 -10 1 3 seg -1. Em proteínas dobradas HX pode ser 2-9 ordens de grandeza mais lento, principalmente devido a pontes de hidrogénio na estrutura secundária e a um grau menor devido ao acesso limitado de hidratadas OH - iões para o interior de uma proteína fortemente dobrado. HX em proteínas nativas, portanto, implica desdobramento, por permuta química parcial ou global e redobrando para o estado nativo de acordo com a equação (1) e as taxas de câmbio observadas k obs dependem da taxa de abertura op k, os cl k taxa de fechamento ea troca química intrínseca rate k ch de acordo com a equação (2).

Equações 1-2
Sob condições de estado nativo k op é muito menor do k ch e pode ser negligenciada no denominador. Existem dois regimes cambiais extremos chamados EX1 e EX2. Se o cl k é muito menor do k ch (EX1) a taxa observada é praticamente igual à taxa de abertura e HX permite a observação imediata do desdobramento de um elemento estrutural. Tal regime cambial, onde todos os prótons amida troca de uma só vez aquando da abertura do elemento estrutural, é facilmente observáveis ​​em MS por uma distribuição bimodal dos picos de isótopos 7. Se k cl é muito maior do que k ch (EX2) a taxa observada é proporcional à k ch em que a constante de proporcionalidade é igual aos equilíbrios-desdobramento dobráveis ​​constante op K u = k cl. Sob estas condições, muitos eventos de abertura e fecho são necessárias antes de todos os protões amida troca de deutério, que conduz a um aumento gradual da massa média, enquanto a distribuição isotópica permanece praticamente a mesma. O regime EX2 permite a determinação da energia livre de desdobramento ÄG u e, por conseguinte, a estabilidade de um elemento estrutural. Sob condição de estado nativo do regime EX2 é mais comum. Aumento do pH e da adição de agentes caotrópicos pode mudar o mecanismo de troca de EX1. Portanto, HX-MS pode ser utilizada para explorar termodinâmico, bem como os parâmetros cinéticos de dobragem de proteína e alterações conformacionais.

Como mencionado acima HX é intrinsecamente pH e dependente da temperatura e meia-vida a troca de um protão exposta completamente solvente do grupo amida espinha dorsal é entre 5-400 ms a um pH fisiológico (pH 7,6) e 30 ° C, mas 10 min a> 15 horas, com uma média de> 2 horas a pH 2,9 e 0 °C (excepto para o protão da primeira estrutura de ligação amida de um polipeptídeo, que troca com uma meia-vida de aprox. 1-2 min). Sob tais condições lenta troca é possível para digerir a amostra usando proteases (por exemplo pepsina) que atuam nessas condições, sem perder todas as informações contidas nos dêuterons incorporadas. Desde a introdução de digestão péptica sob condições troca lenta, não apenas da cinética geral HX de proteínas de comprimento completo pode ser analisado, mas HX pode ser localizado em regiões específicas 8,9. A resolução espacial está limitado ao tamanho dos fragmentos gerados pépticas, que é, em geral, entre 10-30 resíduos. No entanto, fragmentos sobrepostos criados devido à natureza não específica da clivagem por pepsina pode levar a um aumento da resolução espacial. Além disso, várias outras proteases foram encontrados para ser activo em condições de têmpera, contudo, muito menos eficiente do que a pepsina 10. Além disso aumense de resolução espacial pode ser alcançado pela fragmentação de peptídeos em fase gasosa por meio de métodos que preservaram o padrão deuteração tais como a captura eletrônica de dissociação (ECD), transferência eletrônica de dissociação (ETD) e dissociação multiphoton infravermelho (IRMPD) 11-13. Estas técnicas de evitar a perda de resolução espacial devido à migração intramolecular de protões ("scrambling"), que é observada por dissociação induzida por colisão (CID) a técnica de fragmentação mais utilizada. No entanto, estes métodos requerem otimização para cada peptídeo individual e é, portanto, ainda bastante desafiador.

HX-MS foi utilizada para analisar interacções proteína-ligando e de proteína-proteína, incluindo a montagem da cápside viral 14-17. Proteína desdobramento e redobrando assim como temperatura provocadas mudanças conformacionais foram investigados 7,18,19. Fosforilação e conformacional relacionada com mutação único aminoácido muda 16,20 e nucleotmudanças ide-induzidas foram analisados ​​21,22. Portanto, esse método parece idealmente adequado para analisar a montagem e dinâmica de máquinas moleculares. Um candidato atraente, cujo mecanismo é de grande interesse geral, é o complexo chaperone Hsp90.

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Protocol

1. Preparação de Amortecedores e Proteína Amostras

  1. Prepare H2O tampão. Utilização Hsp90 tampão padrão (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glicerol a 10%) na forma de H 2 O tampão.
    Nota: Se a amostra foi dialisada antes da análise, usar o tampão de diálise como H2O tampão. É essencial que o O tampão D 2 difere do ó tampão H 2 apenas no isótopo de hidrogénio. Buffers voláteis como NH 4 componentes 4-acetato ou tampão CO 3 ou NH não são adequados!
  2. Prepare D 2 O tampão por liofilização de solução tampão padrão de Hsp90 usando um concentrador de vácuo. Após completa evaporação da H2O adicionar puro D 2 O para o tubo para atingir o volume total inicial (por exemplo, 1 ml de tampão com 15% de glicerol requerem a adição de 850 ul de D 2 O). Repita a evaporação completa do buffer e dissolver o com buffer / salnentes em D 2 O 2x.
  3. Preparar tampão de têmpera (0,4 M de KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 de pH 2,2).
    Nota: Para melhorar a eficiência da digestão péptica de proteínas muito estáveis ​​4 M de cloridrato de guanidina e 0,5 M de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) podem ser adicionados.
  4. Prepare a 100% da amostra de controlo (6 M de cloridrato de guanidina, D 2 O). Adicionar cloridrato de guanidina a uma alíquota de Hsp90 para atingir uma concentração final de 6 M. evaporar completamente H2O a partir da amostra e adicionar D 2 O para o tubo, para atingir o volume total inicial (por exemplo, amostra de 100 ul com 10% de glicerol requerem a adição de 90 ul de D 2 O). Repetir a evaporação completa do tampão e redissolver os componentes de tampão / sal em D 2 O.
    Nota: 20-100 pmol de amostra são necessários para cada injeção. Prepare amostra suficiente para ter um controle de 100% para todos os dias de experimentos HX-MS.
  5. Preparar 50 pmol Hsp90 em 5 ul de tampão de Hsp90 padrão.
    Nota: Uma quantidade de 20-100 pmol de amostra é necessário para cada ponto de dados brutos. O volume da amostra na reacção é de 1-5 ul idealmente. Ajustar a concentração para atender a esses requisitos. Qualquer tampão pode ser utilizado, desde que ele não contém detergentes ou componentes voláteis.

2. Preparação de Imobilizado pepsina em Aldeído Beads ativado

  1. Dissolve-se 80 mg de pepsina fresco em citrato de sódio 50 mM de 2 ml (pH 5).
  2. Dissolver 20 mg de cianoborohidreto de sódio, manusear com cuidado (muito tóxico!) Em 1 ml de 2 M Na 2 SO 4 e adicionar a solução de pepsina.
  3. Incubar mistura durante 10 minutos à temperatura ambiente enquanto se agita suavemente (por exemplo, agitador de cima).
  4. Adicionar 600 mg de grânulos com grupos aldeído imobilizadas à mistura e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
  5. Adicionar 2,2 ml de 2 M Na 2 SO4 (pH 5) em 100 mL alíquotas a cada 3 min mais de uma hora de sal lentamente a pepsina. Misture suavemente a amostra entre as adições em um agitador vertical à temperatura ambiente.
  6. Incubar os grânulos de pepsina a 4 ° C durante 14-16 horas / dia para o outro num agitador vertical.
  7. Extingue-se a reacção por adição de 1 ml de etanolamina 1 M e incubação à temperatura ambiente durante 2 horas.
  8. Girar as pérolas num tubo falcon de 50 ml a 500 rpm, desprezar o sobrenadante e ressuspender as contas em ácido fórmico a 0,1%. Repita este passo 2x. Após o último passo de centrifugação, descartar o sobrenadante e estimativa do volume de esferas. Adicionar um volume equivalente de ácido fórmico 0,1% e armazenar a 4 ° C.

3. Preparação de Colunas para Amida de hidrogênio-troca

  1. Use colunas de guarda com um diâmetro interno de 1 mm para prendendo colunas e com 2 mm para colunas pepsina.
  2. Desapertar um lado da coluna de guarda e remover o filtro. Fortemente parafuso funn embalagemel para a extremidade aberta da coluna. Usar um adaptador de 1/16 de polegada e tubo para conectar uma seringa vazia (5 ml) para a saída de fundo da coluna. Certifique-se de corrigi-lo à prova de gás para a coluna de guarda.
  3. Aplique algumas gotas de material de cordão de lama no topo do funil. Puxar o êmbolo da seringa para sugar a lama através de um funil para a coluna de guarda. Aplicar mais material talão lama para o funil e continuar o processo até que a pré-coluna é completamente preenchida com material de cordão. Remover o funil e colocar filtro e filtro de anel na extremidade aberta. Aperte o parafuso da tampa de coluna na coluna de guarda e remover a seringa do outro lado. Feche ambas as extremidades das colunas de guarda com fichas para evitar a secagem do material da coluna.

4. Configuração do Sistema de Hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa (HX-MS)

  1. Ligue a coluna armadilha com o sistema de HPLC (Figura 1). Equilibrar a coluna ajustando o caudal deUma bomba de 0,4 ml / min com 0,1% de ácido fórmico como solvente. Não ligue a coluna pepsina nem a coluna de análise ainda.
  2. Calibra-se o espectrómetro de massa e ligar a saída da HPLC para a fonte do espectrómetro de massa.

5. Determinação da Faixa Dinâmica de câmbio

  1. Prepare ultrapura solvente A (0,1% de ácido fórmico em água) e ultrapura solvente B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo); solventes misturados prontos estão disponíveis comercialmente. Purificai as bombas de HPLC. Configure a cromatografia e métodos de espectrometria de massa no software de controle, escolhendo um programa com um gradiente passo depois de uma etapa de dessalinização curto. Para full-length Hsp90 utilizar um passo de dessalinização de 1-2 min seguido por comutação da válvula de 6 portas de dessalinizar / LOAD para eluir e um gradiente em degrau de 90% de solvente A/10% de solvente B a 5% de solvente A/95% de solvente B. Antes da injecção definir a válvula de injeção de carga e válvula de 6 portas para dessalinizar / posição de carregamento.
    Nota: Não use a pepsina ou coluna analítica durante esta experiência.
  2. Prepare 100-200 pmol de Hsp90 em 1-10 ul H2O tampão e incubar durante 10 min a 30 ° C. Adicionar temperatura ajustada D 2 O tampão para perfazer o volume da amostra até aos 100 ml e incubar exactamente, por um período definido de tempo (por exemplo 10 segundos, 100 segundos, 1000 seg). Adicionar 100 mL de tampão de têmpera e misture por pipetagem cima e para baixo. Injectar a amostra de 200 ul para o orifício de injecção da válvula de injecção com uma seringa Hamilton. Inicie o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir. Repita isso por pelo menos três pontos de tempo.
  3. Repetir o passo 5.2, mas adicionar excesso de 2 a 3 vezes de STI1 para a Hsp90 amostra antes da incubação durante 10 min a 30 ° C.
  4. Determinar as massas de proteínas de comprimento completo por desconvolução de espectros no software de espectrometria de massa. Calcule o número de incorporandoed dêuterons comparando o peso molecular de Hsp90 de comprimento completo com a massa observada após cada ensaio (por exemplo, 10 segundos, 100 segundos, 1000 seg).
  5. Traçar os deuterões incorporadas para Hsp90 na ausência e presença de STI1 (eixo y) versus tempo (eixo x). Determinar o ponto de tempo no intervalo dinâmico, onde a diferença entre as duas curvas é máxima. Utilize este valor para o tempo de incubação em D 2 O na identificação de interface e dinâmica sobre os níveis de peptídeo Hsp90-STI1.

6. Determinação da péptica Peptídeos Usando MS / MS Spectra

  1. Ligue a coluna de pepsina e uma coluna analítica para o sistema.
  2. Configure os parâmetros para a cromatografia e espectrometria de massa no software de controle, escolhendo tipo de gradiente e método de espectrometria de massa. Escolha uma rampa longa (por exemplo, mais de 90 min) para garantir uma boa resolução cromatográfica. Ativar espectros MS / MS no espectrômetro de massa.
    Nota: Boa resolução no HPLC e precisão de massa de alta tem maior prioridade nesta etapa.
  3. Prepare 100-200 pmol de Hsp90 em 100 ul H2O tampão. Adicionar 100 mL de tampão de têmpera e misture por pipetagem cima e para baixo. Injectar a amostra de 200 ul para o orifício de injecção da válvula de injecção com uma seringa Hamilton. Inicie o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição.
    Nota: Se existir mais do que uma proteína deve ser analisada em HX-MS (isto é, as interfaces de interacção proteína-proteína) para cada um dos péptidos de proteínas tem de ser determinadas individualmente.
  4. Identificar os péptidos pépticas de Hsp90, pesquisando uma base de dados (isto é, Mascot) para os péptidos resultantes.
    Nota: É possível utilizar uma base de dados personalizada como o objectivo é determinar como muitos péptidos pépticas quanto possível e análise é feito com a proteína purificada. Amostra de pureza vontade have a ser levado em conta.
  5. Repetir esta etapa sem MS / MS e com o gradiente que vai ser utilizado para a experiência real HX. Para a Hsp90 e STI1 utilizar um gradiente de 10 min desde 90% de solvente A/10% de solvente B a 45% de solvente A/55% de solvente B.
    Nota: Os gradientes são normalmente entre 5-15 min e altamente dependem da complexidade da amostra e as especificações do sistema HX.
  6. Tempo de retenção determinar os tempos de retenção dos péptidos identificados pépticas em 6.4, o gradiente utilizado em 6.5 e criar uma lista que compreende 1). Sequência do péptido 2.) Péptido estado de carga e 3.). Isto irá ser utilizado para identificar cada péptido após as experiências HX.
    Nota: Esteja ciente de que os peptídeos com diferenças pequenas m / z, estado de carga idêntica e tempo de retenção idêntico pode ser uma fonte de ambigüidade.

7. Identificação de Interfaces de interação proteína-proteína

  1. Configure o gradiente eo método de espectrometria de massa no softwar controlee. Use um gradiente linear de 10 minutos a partir de 90% de solvente A/10% de solvente B a 45% de solvente A/55% solvente B. Coloque um método de espectrometria de massa que é otimizado para detecção de massas entre 300-1,500 m / z, embora a maior parte os péptidos serão superiores a 1000 m / z. Ajuste a válvula de injeção na posição de carga, a válvula de 6 portas em carga / dessalinização Position. Ajuste a velocidade de fluxo da bomba de carga de 0,4 ml / min.
    Nota: A duração eo tipo de gradiente são dependentes da amostra e pode ter que ser otimizado. Gradientes mais longos melhorar a resolução da cromatografia, mas diminuir a incorporação de deutério em proteínas, devido ao back-troca. Os métodos escolhidos precisa ser a mesma para todas as experiências deve ser comparado.
  2. Para a referência unexchanged preparar 20-100 pmol de Hsp90 em 100 ul H2O tampão. Adicionar 100 ul de tampão gelada têmpera, pipeta cima e para baixo duas vezes e injetar amostra na válvula de injeção do HPLC. Iniciar imediatamente o programa de cromatografia e swcoçar a válvula de injeção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Faça isso por Hsp90 e STI1 individualmente e para a mistura de proteínas.
  3. Prepare 20-100 pmol de Hsp90 em um volume de 1-5 ul. Adicionar temperatura ajustada D 2 O tampão para trazer o volume de amostra até aos 100 ml e incubar exatamente por um período definido de tempo (por exemplo, 30 segundos, pois dinâmica conformacional ver nota). Adicionar 100 ul de tampão de têmpera gelada, pipeta-se para baixo e duas vezes rapidamente e injectar 200 ul para a válvula de injecção da HPLC. Iniciar imediatamente o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Fazer isto para cada uma das proteínas individualmente, para determinar a incorporação de deutério em cada péptido na ausência da proteína que interage.
    Nota: Ao estudar a dinâmica de conformational alterações, repita o experimento com diferentes tempos de incubação de Hsp90 em D 2 O buffer. Tentar cobrir uma ampla escala de tempo, escolhendo os tempos de incubação logaritmicamente (por exemplo, 10 segundos, 30 segundos, 100 segundos, 300 segundos, 1000 seg, etc.) D 2 O tampão tampão e amostra deve ser exatamente idênticos, exceto para o isótopo de hidrogênio.
  4. Prepara-se uma quantidade igual de 100% da amostra de controlo (20-100 pmol) e adicionar D 2 O tampão para perfazer o volume da amostra a 100 ul. Adicionar 100 ul de tampão de têmpera gelada, pipeta-se para baixo e duas vezes rapidamente e injectar 200 ul para a válvula de injecção da HPLC. Iniciar imediatamente o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição.
  5. Para determinar a superfície de interacção misturar Hsp90 com um excesso de, pelo menos, 2 vezes superior de STI1 para desviar o equilíbrio para o estado ligado (ver nota) e incubarà temperatura desejada até que a formação do complexo está em equilíbrio. Adicionar temperatura ajustada D 2 O tampão para perfazer o volume da amostra até aos 100 ml e incubar exactamente, por um período definido de tempo (por exemplo 30 segundos). Adicionar 100 ul de tampão de têmpera gelada, pipeta-se para baixo e duas vezes rapidamente e injectar na válvula de injecção da HPLC. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Repita esta experiência com 20-100 pmol de STI1 e excesso de Hsp90.
    Nota: As concentrações absolutas dependem da constante de equilíbrio de dissociação da interacção. Idealmente, após diluição em D 2 O a concentração da proteína em excesso adicionado deverá ser pelo menos 10 vezes a K D (correspondente a> 85% da proteína ligada inferior concentrado).
  6. Analisar os dados adquiridos, com um software adequado e usar o tempo de retenção determinadas no passo 6.5 para encontrar cada péptido na análise. Calculate o centróide de distribuição de isótopos para a proteína unexchanged (passo 7.2) e para as experiências de HX (passo 7.3).
    Nota: Embora os padrões de isótopos de peptídeos trocados parecer diferente dos seus homólogos unexchanged, tanto o conhecimento sobre o estado de carga do peptídeo ea exatidão elevada massa do espectrômetro de massa permite a fácil determinação dos centróides.
  7. Compare incorporação de dêuterons de proteína alvo sozinho e com excesso de parceiro de ligação. Isso pode ser feito automaticamente com o software comercial ou manualmente com um programa de planilha. Os valores da amostra de controlo de 100% indicam a troca máxima para cada péptido e pode ser utilizado para determinar a quantidade de D 2 O rótulo perdido durante a experiência, devido à troca de volta.

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Representative Results

Hsp90 é uma chaperone molecular em leveduras e membro da família acompanhante Hsp90. Ao passar por um ciclo de ATPase complexo que auxilia etapas de dobramento final de muitos clientes de proteína. Dobrável eficiente requer transferência de clientes de Hsp70 e interação do Sti1/Hop co-acompanhante. STI1 se liga diretamente a Hsp90 e facilita o cliente a ligação através da inibição da atividade ATPase da Hsp90. Interação da Hsp90 com STI1 foi estudada recentemente usando HX-MS 23. Aqui apresentamos resultados representativos dos experimentos subjacentes seguindo o protocolo acima.

A interacção proteína-proteína foi testado directamente por marcação do complexo de proteínas em equilíbrio com D 2 O e comparando os espectros de péptido STI1 na ausência e na presença de Hsp90.The resultante diferença trama pode ser visto na figura 5A (dados a partir de 23). Os péptidos são orientadas de cima para baixo começando com a N-terminal. Principalmente em peptídeosTPR2a e TPR2b mostram uma protecção forte na presença de Hsp90 (valores negativos de D + Hsp90 - D-Hsp90), indicando que esta região interage com Hsp90. A protecção em TPR2a pode ser facilmente racionalizar a partir da estrutura de cristal de STI1-TPR2a-TPR2b em complexo com um péptido que representa o MEEVD-motivo C-terminal da Hsp90 (Figura 5B). Tal proteção clara em interações proteína-proteína nem sempre é observado. A protecção de Hsp90 na presença de STI1 não é tão pronunciada e não como localizada como no STI1 (Figuras 5C e 5D). Todos os peptídeos mostrar um pouco maior proteção da incorporação deuteron na presença de STI1. STI1 obviamente estabiliza Hsp90 globalmente como qualquer região da proteína mostra uma maior flexibilidade na presença de STI1. Nós, entretanto, não pode distinguir, se isso reduziu a incorporação de deutério se origina de interação direta com STI1 ou através de efeitos alostéricos na conformaçãode Hsp90. A informação obtida reduz o local de interacção putativo para alguns péptidos (por exemplo péptidos 43-62 de NBD). As experiências adicionais, tais como a reticulação são geralmente utilizados para confirmar os locais de ligação, após HX-MS 23. De nota, a cobertura seqüência de Hsp90 é diminuída quando se mede o complexo Hsp90-STI1. Desde STI1 foi adicionado em excesso de 3,5 vezes o montante global teórica de peptídeos em análise foi de quatro vezes maior do que alguns apenas com Hsp90. Isso aumenta o risco de peptídeos STI1 ofuscando ou sobrepostos peptídeos Hsp90 durante a análise. Para otimizar a maior cobertura sequência de separação cromatográfica melhor parece ser a abordagem mais promissora.

Uma possibilidade para estudar a dinâmica de diferentes regiões da proteína é a utilização de rotulagem contínua HX-MS. Ela envolve a incubação da amostra de proteína, equilibrada em D 2 O durante diferentes períodos de tempo e, por conseguinte, permite que as previsões sobre a estabilidade desegmentos individuais de proteínas. Figura 6 ilustra os espectros de peptídeo 43-62 do NBD de Hsp90 na presença e na ausência de um excesso de 3,5 vezes de STI1. Os tempos de incubação foram escolhidas numa escala logarítmica (10 s, 100 s, e 1000 seg) para obter uma boa cobertura durante uma janela de tempo grande. Os espectros de péptidos apresentam um tempo de incorporação dependente de deutério para a proteína que aumenta para tempos de incubação mais longos. Para o péptido 43-62 de troca segue o mecanismo de EX2 em que o int k << k cl. O grau de protecção muda ao longo do tempo de incubação, mostrando a maior diferença no mais curto tempo de incubação e a taxa de câmbio quase semelhante no ponto de tempo mais longo. Isto sugere uma estabilização menor grau ou uma região de interações dinâmicas com dissociação e reassociação freqüente. Tanto a protecção observada é devida a uma taxa de conversão total reduzida de protões amida do peptídeo ou o efeito pode ser atribuído a um ou doisprótons amida específicos que trocam mais lentamente na presença de STI1. Neste caso, o último é muito mais provável que a estrutura do cristal Hsp90 revelou esta região é um circuito exposta ao invés de uma estrutura secundária normal como α-hélices ou β-folhas.

É importante mencionar que a troca de trás não foi subtraído dos dados mostrados o que implica que os efeitos observados será mais pronunciada quando normalizado para o controlo de 100%.

Figura 1
Figura 1. Configuração HPLC para HX-MS. a) Configuração típica de uma HX-MS configurar. As diferentes áreas coloridas representam seções mantidas em diferentes temperaturas. A amostra é injetada no loop de amostra da válvula de injeção (em modo de carga, ciano) e depois de trocar a válvula em "modo de injetar" (preto) bombeada atravésa coluna de pepsina na válvula 6-porta. A coluna de pepsina é mantida aproximadamente a 10 ° C, para melhorar a actividade enzimática da pepsina. A válvula de 6 portas tem dois modos, "Modo de Carregamento / Dessalinização" e "Modo de eluição" (ver b). Após dessalinização da amostra, os péptidos são separados por cromatografia com um gradiente de acetonitrilo numa coluna de fase inversa analítica. Os peptídeos são, então, pulverizado no espectrômetro de massa com um ESI-source. B) Modos da válvula de 6 portas. Logo após HX a válvula de 6 portas está em "posição de carregamento / Dessalinização" para prender os peptídeos pépticas na coluna armadilha. Este é continuada durante cerca de três minutos para remover os sais ou compostos de tampões de reacção que poderiam interferir com a espectrometria de massa. Depois disto, os interruptores de válvula de 6 portas para "Modo de eluição" colocando a coluna armadilha carregado no caminho de fluxo entre a bomba de gradiente e a coluna analítica. Os peptídeos pépticas presos agora saem da colu armadilhamn e separam-se em um gradiente de 0,1% acid/0.1% de ácido fórmico fórmico em acetonitrilo.

Figura 2
Figura 2. Fluxo esquema de um experimento HX. 1) proteína alvo é purificado e fornecido em buffers padrão sem detergente. 2) A proteína é digerida enzimaticamente com pepsina e os péptidos pépticas são identificados e caracterizados por espectrometria de massa em tandem (MS / MS). Somente após a obtenção seqüência, cobrar do estado e tempo de retenção de tantos peptídeos possível HX-MS pode ser realizada com sucesso. 3) As condições experimentais são configurados tais como a incubação da proteína sob condições específicas (adição de composto ligando / química ou mudança de temperatura ou de pH. 4) permutador de calor é realizada por diluição da amostra de 1:10 ou superior em D 2 O tampão . O ó tampão D 2 deve ser idêntico ao tampão de amostra para avoefeitos tampão ID. Em seguida, a amostra é incubada exatamente por um período de tempo definido. 5) Após a incubação, a reacção é extinta e injectado no sistema de HPLC-MS. A amostra é enzimaticamente clivada e os péptidos pépticas resultantes são separados num gradiente de solvente orgânico e injectado no espectrómetro de massa. 6) A análise dos espectros de péptidos obtidos. Os centroides dos espectros de péptido são comparados sob diferentes condições de reacção. Isto pode ser feito manualmente com o software adequado, ou automaticamente por um programa de análise de HX.

Figura 3
Figura 3. Mecanismo de troca de hidrogénio. A reacção de troca de hidrogénio pode ser catalisada por base ou ácido e, portanto, é dependente do pH com uma taxa de troca mínima entre pH 2,5 e 3 de acordo com as cadeias laterais dos resíduos que flanqueiam a ligação amida 6. Dudessalinização anel e separação cromatográfica dos péptidos, que é realizada em H2O contendo solventes, dêuterons incorporados sejam trocadas para trás, para protões de acordo com o mesmo mecanismo de ("troca de volta"). Portanto, a optimização do sistema e os solventes utilizados é essencial para reduzir a perda de dêuterons incorporadas.

Figura 4
Figura 4. Princípio da HX-MS. A ligação de um ligando de proteína resulta na protecção da espinha dorsal de amida hidrogênios no local de ligação a partir do solvente envolvente. Isso diminui as taxas de câmbio de prótons afetados e diminui a incorporação de deutério. Porque a diferença entre o peso do protão e deutério é um Da, péptidos derivados desta região da proteína irá mostrar uma menor m / z em espectrometria de massa. Comparando os espectros de péptido dos experimentosna ausência e presença de parceiro de ligação irá revelar uma mudança do centro de gravidade da espectros para valores mais baixos m / z (evento proteção). As regiões que apresentam proteção proeminente após a adição de parceiro de ligação são potenciais sítios de ligação. Dependendo da cobertura seqüência ea disponibilidade de sobreposição de peptídeos sítios de ligação pode ser reduzida a uns poucos aminoácidos.

Figura 5
Figura 5. Interação da Hsp90 e STI1. b, a representação dos desenhos animados de um enredo, Diferença de deutério incorporação STI1 na presença de ligação parceiro Hsp90 menos deuteron incorporação STI1 na ausência de Hsp90 (dados de 23). de um fragmento de STI1 compreendendo TPR2a e TPR2b (código PDB 3UQ3) em complexo com um péptido, o qual representa o MEEVD-motivo C-terminal da Hsp90. O cartoon é colorido According para o número de prótons amida protegido de deutério incorporação, conforme indicado. c, Diferença lote de Hsp90 em presença de ligação parceiro STI1. Incorporação deutério observada em Hsp90, após 10 min de pré-incubação com excesso STI1 3.5x a 30 ° C e 30 seg; HX à mesma temperatura. O experimento foi realizado em triplicado e erro padrão da média é mostrada para cada péptido. Valores globais negativos denotam incorporação reduzida de dêuterons e, portanto, maior estabilidade geral do Hsp90 em presença de STI1. Voltar troca não foi considerada neste experimento. D, a representação dos desenhos animados de levedura Hsp90 (código PDB 2CG9) colorido de acordo com o número de prótons amida protegido de deutério incorporação, conforme indicado em b. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6. Curso de tempo de deutério de incorporação em levedura Hsp90 na ausência e na presença de STI1. um, não transformados espectros peptídeo de peptídeo 43-62 do domínio de ligação de nucleotídeos de Hsp90 após troca rotulagem contínua de hidrogênio. 20 uM Hsp90 foram incubados com 70 uM STI1 durante 10 min a 30 ° C para alcançar o equilíbrio e D 2 O rótulo foi realizada a 30 ° C durante 10 segundos, 100 segundos, e 1000 seg. Marcadores puntiformes vermelhas indicam os centróides calculados para cada peptídeo. B, cinética Taxas de peptídeo 43-62 na presença e ausência de 3.5x excesso STI1. Voltar troca não foi considerada neste experimento.

Figura 7
Figura 7. Exemplos de espectros de péptido com distribuindo bimodalião. um, deutério de incorporação em E. coli Hsp90 na ausência e na presença de ATP (dados retirados de 22 suppl. Figura 3). Espectros de resíduos peptídicos 192-206 são apresentados antes de incubação em D 2 O (0% D), depois de 30 s, 5 min, 10 min e 30 min de incubação em D 2 O, e o controlo de 100% (100% de D) . Na ausência de ATP (ATP-) um comportamento típico de troca EX2 é observada. Na presença de ATP (ATP +) uma protecção forte é observado em 30 seg e em 5 min e 10 min distribuições bimodais dos picos isotópicos, indicando duas populações de proteínas, uma população semelhante ao estado de ATP ligado e uma segunda semelhante ao o estado livre de nucleotídeos. Aos 30 min nenhuma diferença entre ausência e presença de ATP é observado. A distribuição bimodal é provavelmente causado pela ATP hidrólise e de transição através do estado livre de nucleotídeos com maior flexibilidade neste segmento de proteína. Estes espectros se assemelhar a um clássico regi taxas EX1me. b, distribuição bimodal de picos isotópicos em experimentos HX-rotulagem de pulso. E. coli Hsp90 foi incubado na ausência de ATP ou na presença de ATP para 10-300 segundos e, subsequentemente, impulsos marcado para 10 seg em D 2 O, tal como indicado (dados retirados de 22 Figura 4A). As distribuições bimodais indicar novamente duas populações de moléculas co-existentes, uma troca mais rapidamente protões amida de deutério do que o outro. ATP induz uma lenta transição do mais rápida troca na conformação troca lenta.

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Discussion

A ligação de um parceiro de interacção com uma proteína, inevitavelmente, provoca alterações na acessibilidade do solvente sobre o local de ligação. Além disso, muitas proteínas sofrem alterações conformacionais dinâmicas sobre a ligação, que afetam outras regiões do que a interface de união real. HX-MS é um método robusto para monitorar essas mudanças e ainda é capaz de revelar mudanças conformacionais em proteínas em escalas de tempo que outros métodos não pode cobrir.

Para executar com êxito HX-MS três pontos são fundamentais: 1) uma configuração ideal do sistema, 2) execução precisa de processamento de amostras e 3) análise de dados cuidadoso ao atribuir espectros peptídeo e interpretação dos resultados.

A configuração do sistema

Uma vez que a espectrometria de massa é usada para detectar a incorporação de deutério para os péptidos, as mesmas precauções em relação a preparação de amostras para aplicar HX-MS. Os detergentes, sais e outros compostos que interferem com a espectrometria de massa should ser evitados ou removidos antes da análise. Enquanto HX-MS permite a análise de grandes complexos de proteínas, a maior complexidade exige um aumento de qualidade de separação de péptidos e de espectrometria de massa. Otimização das condições cromatográficas é a chave para a obtenção de dados de boa qualidade. Isto envolve a escolha dos solventes orgânicos de elevada qualidade, o material de fase reversa, bem como a optimização dos gradientes e solventes. Lavagem das colunas com solventes orgânicos pode ser feito entre experimentos e durante a noite para reduzir o sinal de fundo. Métodos de espectrometria de massa deve ser otimizado para a detecção de peptídeos pépticas (entre 300-1,200 m / z). Espectrómetros de massa de alta resolução facilitar grandemente a análise de dados, porque os clusters picos isotópicos parcialmente sobrepostas provenientes de diferentes peptídeos podem ser distinguidos.

O processamento de amostras é essencial para HX-MS. Normalmente os amortecedores e as amostras são centrifugadas durante 10 min a 13.000 rpm (microcentrifugadora) para remover agregados e particulos. Além disso, vários filtros de linha podem ser instalados no sistema de HPLC, para evitar o entupimento das colunas. Pequenos desvios em D 2 O período de incubação pode ter grandes efeitos. Para as regiões da proteína muito flexíveis uma diferença de apenas alguns segundos podem fazer a diferença entre não incorporação deuteron em tudo e deuteração completo. Uma vez que a dinâmica da proteína, bem como a taxa de câmbio estão intrínseca em função da temperatura, a incubação da amostra e os buffers são firmemente temperatura controlada. É vantajoso para sempre repetir a seqüência exata dos passos para cada experimento. Se executado corretamente o erro entre dois experimentos será relativamente pequeno. Hoje, os sistemas automatizados para HX-MS estão disponíveis no mercado e reduzir os desafios de processamento da amostra.

Análise de dados

O passo mais importante na HX-MS é a análise dos dados, em particular, a atribuição de espectros de péptido e determinação de níveis de deuteração. The saída de HX-MS é um perfil de eluição de gradiente de cromatografia contendo um grande número de espectros de péptido. A tarefa operadores é de atribuir estes espectros para os péptidos identificados por MS / MS no passo 6) do protocolo. Isso pode ser um pouco difícil, pois o espectro pode mudar significativamente para uma maior m / z após HX. Além disso, a sobreposição parcial dos espectros pode complicar a atribuição de peptídeos. Neste caso, o uso de espectrômetros de massa de alta resolução com alta precisão massa compensa, porque muitas vezes pode resolver peptídeos sobrepostos. Diferenças na deuteron incorporação são calculados com base nos centróides de espectros peptídeo. Os centróides pode ser determinada: 1) manualmente, marcando cada pico isotópica de um espectro de peptídeo e transferir os seus valores de intensidade e m / z em um programa de planilha eletrônica (por exemplo, Excel, Microsoft) e calcular o baricentro ou 2) com software projetado para atribuir os picos isotópicos pertencente a um péptido identificado e para calcular ocentroids automaticamente (por exemplo, HDExaminer, Serra Analytics ou HeXicon 24,25).

Otimização de HX-MS

Se o número de péptidos avaliáveis ​​é muito baixa, existem diversas outras possibilidades de optimizar a experiência: 1) optimização da cromatografia (solventes, comprimento / forma de gradiente, o uso de diferentes materiais de fase reversa) ou 2) a mutação de clivagem enzimática de a proteína (alternativa de protease, mais longo / curto período de incubação com a pepsina, a adição de agentes desnaturantes para o tampão de têmpera). Ambos os parâmetros de alterar o comportamento de eluição de péptidos como eles ou alterar o próprio conjunto de peptídeos ou separação por HPLC. Ambas as abordagens de optimização chegar a um preço para a necessidade de modificar a caracterização péptidos. Outras proteases irá produzir péptidos diferentes que têm de ser identificados por MS / MS e caracterizados tal como descrito no passo 6.6). Alterar as condições cromatográficas não irá alterar a piscina peptídeo mas a ti retençãomes dos péptidos individuais. Os tempos de retenção tem de ser determinado novamente, em seguida, como na etapa 6.5). Refira-se que os tempos de retenção mais elevadas sempre vai diminuir a quantidade de marcação detectável como back taxas aumenta em tempos de retenção mais longos. A normalização dos dados para o controle de 100% é a melhor maneira de lidar com a troca de volta. Troca de volta alta leva a uma perda de dêuterons incorporados e, portanto, o sinal. Recomenda-se fortemente para reduzir a quantidade de troca de volta ao mínimo. Deve notar-se que diferentes configurações de HX-MS terão as taxas de troca de volta divergentes, dependendo do hardware, a composição de tampões e solventes utilizados e do tipo de gradientes que são utilizados 26.

Interpretação dos dados

Ao analisar os dados, a distribuição de intensidade dos picos isotópicos precisa ser avaliada com cuidado, já que pode dar indicações ao mecanismo de troca. Para péptidos com uma massa de menosde 2.000 Da as intensidades dos picos isotópicos da amostra unexchanged é geralmente assimétrica com intensidades mais elevadas para o monoisotope ou o primeiro pico maior isótopo. Para o regime de troca EX2 esta distribuição de intensidade Gaussian torna-se assimétrica, como com o aumento do tempo em D 2 O e extensão da transferência de maior m / z e a largura do aumento agregado isotópico por cerca de 50% (Figura 7). Como mencionado na introdução EX2 é mais frequentemente observados em HX-MS sob condições nativas e a taxa observada de troca é proporcional à constante de equilíbrio K u desdobramento e, por conseguinte, para a estabilidade termodinâmica das proteínas. Em contrapartida, para o regime de câmbio EX1 a distribuição largura das isotópicas aumenta significativamente de cluster e distribuições de intensidade bimodais ou multimodais são observados (ver Figura 7) 25,27. Distribuições bimodais de isótopos indicam sempre duas ou mais espécies de moléculas diferentesNa análise, os quais são potencialmente interessante. No entanto, existem dois tipos de armadilhas. Em primeiro lugar, o conjunto do isótopo pode ser composta de picos provenientes dos dois peptídeos diferentes. Por conseguinte, é obrigatório para verificar os espectros da amostra unexchanged para péptidos com m igual / z e carga idênticas. Tais peptídeos normalmente diferem ligeiramente no tempo de retenção e a distribuição de intensidade dos picos isotópicos varia com o tempo de eluição. Em espectrômetros de massa de alta resolução, picos isotópicos que não pertencem ao mesmo peptídeo também podem ser distinguidos pelas casas decimais dos valores m / z. Em segundo lugar, extravasamento de uma execução anterior HPLC-MS é observada 28. Esta transição aparece espécies como nonexchanged e pode ser eliminado em branco gradiente HPLC corre entre a análise de execuções. Há muitas razões para o regime de câmbio EX1 aparente. 1) Nas experiências HX, na presença de agentes desnaturantes EX1 é frequentemente observada 29. 2) loc espontâneo ou induzido, reversível ou irreversívelal ou global desdobramento de proteínas provoca comportamento EX1 7,30,31. 3) as transições conformacionais que são lentos em comparação com HX causada por volume, por exemplo de substrato, a hidrólise do ATP causar distribuições bimodais de isótopos que se assemelham regime troca EX1 (Figura 7a) 22. 4) transições conformacionais lentos induzidas Ligand em experiências de rotulagem pulso também exibem uma assinatura EX1-like (Figura 7b) 22.

A interpretação dos dados obtidos é, eventualmente, o que faz HX-MS uma técnica tão desafiador, mas também poderosa. Um amplo conhecimento da dinâmica de proteína é necessário para obter todo o caminho a partir dos padrões de proteção / desproteção observados a um modelo mecanicista da dinâmica de proteínas. No entanto, a produção de alta qualidade de dados HX-MS pode ser feito no prazo de tempo relativamente curto e é altamente reprodutível. A interpretação dos dados claramente beneficia de qualquer informação adicional sobre a estrutura da proteína de investirigated. Por outro lado, HX-MS pode indicar quais as partes de uma proteína são flexíveis, o que pode ter que ser removido para facilitar a cristalização para a determinação da estrutura.

HX-MS é um método que aproveita muito por inovações em espectrometria de massa e cromatografia. Um avanço recente na HX-MS é o uso de nanodiscs lipídicos para a análise de proteínas de membrana que alarga ainda mais o uso desta técnica 32. Além disso, a utilização de transferência de electrões de dissociação (DTE) e captura de electrões de dissociação (ECD) mostram um forte potencial para o HX-MS, uma vez que aumenta a resolução de deutério incorporada ao nível dos aminoácidos individuais 11,12 33.

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Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos M. Boysen para comentários sobre o manuscrito. Este projecto foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 e MA 1278/4-1 a MPM, e Cluster de Excelência: CellNetworks EXC 81/1). MPM é investigador do Cluster de Excelência: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

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