Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

Summary

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Abstract

Todos os processos celulares dependem da funcionalidade das proteínas. Embora a funcionalidade de uma dada proteína é a consequência directa da sua sequência de aminoácidos única, apenas é realizado pela dobragem da cadeia polipeptídica em um único arranjo tridimensional definido ou mais vulgarmente em um conjunto de conformações interconversão. Investigando a ligação entre a conformação da proteína e sua função é, portanto, essencial para um entendimento completo de como as proteínas são capazes de cumprir a sua grande variedade de tarefas. Uma possibilidade para estudar mudanças de conformação de uma proteína sofre, progredindo através do seu ciclo funcional é ^{hidrogénio-1} H / ² H-troca em combinação com espectrometria de massa de alta resolução (HX-MS). HX-MS é um método versátil e robusto que acrescenta uma nova dimensão às informações estruturais obtidas por cristalografia por exemplo. Ele é usado para estudar a proteína dobrando e desdobrando, a ligação da pequena molligantes ecule, interações proteína-proteína, mudanças conformacionais ligadas à catálise enzimática e allostery. Além disso, HX-MS é muitas vezes utilizado quando a quantidade de proteína é muito limitada, ou a cristalização da proteína não é viável. Aqui proporciona-se um protocolo geral para o estudo da dinâmica das proteínas com HX-MS e descrevem como um exemplo de como a interface para revelar a interacção de duas proteínas de um complexo.

Introduction

O número de estruturas de cristal de proteínas e complexos de proteína aumentou rapidamente nos últimos anos. Apresentam instantâneos inestimáveis ​​da organização estrutural das proteínas e fornecer uma base para a análise da estrutura-função. No entanto, a dinâmica das proteínas e as mudanças conformacionais, que são essenciais para as suas funções, são raramente revelado por cristalografia de raios-X. Cryo-electronmicroscopy, por outro lado, é capaz de capturar os complexos de proteínas e de proteínas em diferentes conformações, mas geralmente não é possível resolver as alterações conformacionais para baixo para o nível de ^uma estrutura secundária. Dinâmica de conformação de proteínas em solução em detalhes atómicas só pode ser resolvido por RMN, mas este método é ainda limitado a proteínas de tamanhos relativamente pequenos (geralmente ≤ 30 kDa) e necessita de altas concentrações de proteínas (≥ 100 pM), o que dificulta as experiências com oligomerização ou agregação de proteínas propensas ^2. Um método queé capaz de ponte entre a alta resolução de cristalografia de raios-X e crio-electronmicroscopy e que não é limitado pelo tamanho ou a concentração de proteína é de hidrogénio ^amida-1 H / ² H-troca (HX) em combinação com espectrometria de massa (MS). Nos últimos anos, este método tem desenvolvido para um instrumento analítico valioso para a análise da dinâmica das proteínas, o dobramento de proteínas, a estabilidade da proteína e alterações conformacionais ^3-5. A base molecular deste método é a natureza lábil do backbone hidrogénios de amida em proteínas, que irá trocar com átomos de deutério, quando a proteína é colocada em um D ₂ O solução. O consequente aumento da massa de proteína ao longo do tempo é medido com alta resolução MS.

Em péptidos não estruturados curtas só HX depende da temperatura, da concentração do catalisador (OH ^-, H ₃ O ⁺ por exemplo pH, ver Figura 3) e as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos adjacentes, devido à indutivo, gatoefeitos alytic e estéricos. Estes efeitos sobre o _ch intrínseca taxa de permuta química k foram elegantemente quantificada por Bai et al. ⁶ e um programa está disponível (por cortesia Z. Zhang), que calcula k _ch para cada aminoácido num polipéptido dependente do pH e da temperatura. Em pH neutro e temperatura ambiente k _ch é da ordem de 10 -10 ^{1 3} seg ^-1. Em proteínas dobradas HX pode ser 2-9 ordens de grandeza mais lento, principalmente devido a pontes de hidrogénio na estrutura secundária e a um grau menor devido ao acesso limitado de hidratadas OH ^– iões para o interior de uma proteína fortemente dobrado. HX em proteínas nativas, portanto, implica desdobramento, por permuta química parcial ou global e redobrando para o estado nativo de acordo com a equação (1) e as taxas de câmbio observadas k _obs dependem da taxa de abertura _op k, os _cl k taxa de fechamento ea troca química intrínseca rate k _ch de acordo com a equação (2).

Sob condições de estado nativo k _op é muito menor do k _ch e pode ser negligenciada no denominador. Existem dois regimes cambiais extremos chamados EX1 e EX2. Se o _cl k é muito menor do k _ch (EX1) a taxa observada é praticamente igual à taxa de abertura e HX permite a observação imediata do desdobramento de um elemento estrutural. Tal regime cambial, onde todos os prótons amida troca de uma só vez aquando da abertura do elemento estrutural, é facilmente observáveis ​​em MS por uma distribuição bimodal dos picos de isótopos ^7. Se k _cl é muito maior do que k _ch (EX2) a taxa observada é proporcional à k _ch em que a constante de proporcionalidade é igual aos equilíbrios-desdobramento dobráveis ​​constante _op K _u = k </sub> K / _cl. Sob estas condições, muitos eventos de abertura e fecho são necessárias antes de todos os protões amida troca de deutério, que conduz a um aumento gradual da massa média, enquanto a distribuição isotópica permanece praticamente a mesma. O regime EX2 permite a determinação da energia livre de desdobramento ÄG _u e, por conseguinte, a estabilidade de um elemento estrutural. Sob condição de estado nativo do regime EX2 é mais comum. Aumento do pH e da adição de agentes caotrópicos pode mudar o mecanismo de troca de EX1. Portanto, HX-MS pode ser utilizada para explorar termodinâmico, bem como os parâmetros cinéticos de dobragem de proteína e alterações conformacionais.

Como mencionado acima HX é intrinsecamente pH e dependente da temperatura e meia-vida a troca de um protão exposta completamente solvente do grupo amida espinha dorsal é entre 5-400 ms a um pH fisiológico (pH 7,6) e 30 ° C, mas 10 min a> 15 horas, com uma média de> 2 horas a pH 2,9 e 0 °C (excepto para o protão da primeira estrutura de ligação amida de um polipeptídeo, que troca com uma meia-vida de aprox. 1-2 min). Sob tais condições lenta troca é possível para digerir a amostra usando proteases (por exemplo pepsina) que atuam nessas condições, sem perder todas as informações contidas nos dêuterons incorporadas. Desde a introdução de digestão péptica sob condições troca lenta, não apenas da cinética geral HX de proteínas de comprimento completo pode ser analisado, mas HX pode ser localizado em regiões específicas ^8,9. A resolução espacial está limitado ao tamanho dos fragmentos gerados pépticas, que é, em geral, entre 10-30 resíduos. No entanto, fragmentos sobrepostos criados devido à natureza não específica da clivagem por pepsina pode levar a um aumento da resolução espacial. Além disso, várias outras proteases foram encontrados para ser activo em condições de têmpera, contudo, muito menos eficiente do que a pepsina ^10. Além disso aumense de resolução espacial pode ser alcançado pela fragmentação de peptídeos em fase gasosa por meio de métodos que preservaram o padrão deuteração tais como a captura eletrônica de dissociação (ECD), transferência eletrônica de dissociação (ETD) e dissociação multiphoton infravermelho (IRMPD) ^11-13. Estas técnicas de evitar a perda de resolução espacial devido à migração intramolecular de protões ("scrambling"), que é observada por dissociação induzida por colisão (CID) a técnica de fragmentação mais utilizada. No entanto, estes métodos requerem otimização para cada peptídeo individual e é, portanto, ainda bastante desafiador.

HX-MS foi utilizada para analisar interacções proteína-ligando e de proteína-proteína, incluindo a montagem da cápside viral ^14-17. Proteína desdobramento e redobrando assim como temperatura provocadas mudanças conformacionais foram investigados ^7,18,19. Fosforilação e conformacional relacionada com mutação único aminoácido muda ^16,20 e nucleotmudanças ide-induzidas foram analisados ^​​21,22. Portanto, esse método parece idealmente adequado para analisar a montagem e dinâmica de máquinas moleculares. Um candidato atraente, cujo mecanismo é de grande interesse geral, é o complexo chaperone Hsp90.

Protocol

1. Preparação de Amortecedores e Proteína Amostras Prepare H2O tampão. Utilização Hsp90 tampão padrão (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glicerol a 10%) na forma de H 2 O tampão. Nota: Se a amostra foi dialisada antes da análise, usar o tampão de diálise como H2O tampão. É essencial que o O tampão D 2 difere do ó tampão H 2 apenas no isótopo de hidrogénio. Buffers voláteis como NH <sub…

Representative Results

Hsp90 é uma chaperone molecular em leveduras e membro da família acompanhante Hsp90. Ao passar por um ciclo de ATPase complexo que auxilia etapas de dobramento final de muitos clientes de proteína. Dobrável eficiente requer transferência de clientes de Hsp70 e interação do Sti1/Hop co-acompanhante. STI1 se liga diretamente a Hsp90 e facilita o cliente a ligação através da inibição da atividade ATPase da Hsp90. Interação da Hsp90 com STI1 foi estudada recentemente usando HX-MS 23. Aqui apresentam…

Discussion

A ligação de um parceiro de interacção com uma proteína, inevitavelmente, provoca alterações na acessibilidade do solvente sobre o local de ligação. Além disso, muitas proteínas sofrem alterações conformacionais dinâmicas sobre a ligação, que afetam outras regiões do que a interface de união real. HX-MS é um método robusto para monitorar essas mudanças e ainda é capaz de revelar mudanças conformacionais em proteínas em escalas de tempo que outros métodos não pode cobrir.

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Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator	Valco	#EPC6W
Injection valve (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	use fresh pepsin
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubing (various diameters)	IDEX
Fittings	IDEX	#PK-110 with PK-100