Summary
Nous décrivons un procédé pour réaliser une immobilisation efficace de la BMP-2 sur les surfaces. Notre approche est basée sur la formation d'une monocouche auto-assemblée de réaliser la liaison de BMP-2 par l'intermédiaire de ses résidus amines libres covalente. Cette méthode est un outil utile pour étudier la signalisation à la membrane cellulaire.
Abstract
la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2) est un facteur de croissance incorporé dans la matrice extracellulaire du tissu osseux. BMP-2 agit comme déclencheur de la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes, stimulant ainsi la guérison et la formation osseuse de novo. L'utilisation clinique de l'humain recombinant BMP-2 (rhBMP-2), en liaison avec des échafaudages a soulevé controverses récentes, sur la base du mode de présentation et la quantité à délivrer. Le protocole présenté ici fournit un moyen simple et efficace pour délivrer la BMP-2 pour des études in vitro sur des cellules. Nous décrivons comment former une monocouche auto-assemblée constituée d'un segment de liaison hétérobifonctionnel, et on montre l'étape ultérieure de liaison pour obtenir une immobilisation covalente de rhBMP-2. Avec cette approche, il est possible d'obtenir une présentation prolongée de la BMP-2, tout en maintenant l'activité biologique de la protéine. En fait, l'immobilisation de la surface de la BMP-2 permet enquêtes ciblées en empêchant annonces non spécifiquesorption, tout en réduisant la quantité de facteur de croissance et, plus particulièrement, ce qui empêche la libération non contrôlée de la surface. Les deux à court et à long terme des événements de signalisation déclenchées par BMP-2 ont lieu lorsque les cellules sont exposées à des surfaces présentant immobilisé de manière covalente rhBMP-2, ce qui rend cette approche appropriée pour des études in vitro sur les réponses cellulaires à la BMP-2 stimulation.
Introduction
Une protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2) est un élément du facteur de croissance transformant (TGF-β) de la famille et agit comme inducteur de la formation de novo de l'os ainsi que la régulation de plusieurs tissus au cours du développement embryonnaire et adulte homéostasie 3.1. Chaque monomère de l'homodimère protéine biologiquement active BMP-2 contient un motif "cysteine de noeud", qui est hautement conservée dans toutes les PGB 4. Six des sept résidus de cysteine forment des ponts disulfure intramoléculaires qui stabilisent chaque monomère, tandis que le septième cysteine est impliquée dans la dimérisation, la formation d'une liaison intermoléculaire entre les deux monomères 5,6. Ce nœud de cysteine hautement conservés définit la structure tridimensionnelle de la protéine BMP-2 et détermine ses propriétés uniques, telles que résistance à la chaleur, et des dénaturants acide pH 7-9. BMP-2 se lie à la sérine / thréonine kinase des récepteurs transmembranaires, ce qui induit une transduction de signal
Dans l'os, la BMP-2 induit la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes, stimulant ainsi la guérison et la formation de novo de l'os. Actuellement, exprimée par recombinaison BMP-2 est appliqué en clinique pour améliorer la guérison des sites fracturés. Une stratégie courante dans l'ingénierie tissulaire osseuse est l'utilisation de facteurs de croissance injectables, ce qui est moins invasive par rapport aux systèmes d'administration locale. Cependant, des études in vivo et des applications cliniques ont montré que la demi-vie biologique courte, loc non spécifiquelisation et domiciliation rapide de BMP-2 peut conduire à plusieurs problèmes locaux, ectopiques et systémiques 15. Par conséquent, pour obtenir une présentation efficace, le piégeage ou l'immobilisation de la BMP-2 à l'intérieur ou sur des matériaux est nécessaire pour sa délivrance locale et prolongée au niveau du site cible. Une distribution prolongée peut être obtenue avec des approches de rétention de non-covalentes, telles que le piégeage physique, l'adsorption ou la complexation d'ions 16. Cependant, il est connu que l'adsorption non spécifique de protéines sur les surfaces peut élément de dénaturation des molécules 17. Pour la liaison des facteurs de croissance covalente, différents types de supports ont été développés au cours de la dernière décennie. L'utilisation de molécules de liaison bifonctionnels qui ciblent des groupes amino ou carboxyle de la protéine, par exemple, est un type d'approche qui ne nécessite pas nécessairement une modification de la protéine pour obtenir son immobilisation. En fait, tandis que la modification des protéines offre l'avantage de contrôler l'orientation de la protéine,l'introduction de domaines artificiels, des étiquettes et des chaînes peptidiques spécifiques à un site peut modifier l'activité biologique de facteurs de croissance 17. Ainsi, pour contourner la dénaturation due à l'interaction avec le matériau de support, les surfaces peuvent être fonctionnalisés à l'avance, par exemple, avec une monocouche auto-assemblée (SAM) d'une molécule de liaison, suivie d'un couplage du facteur désiré 18. Nous avons utilisé une approche fondée sur les SAM pour immobiliser de manière covalente BMP-2 sur une surface en ciblant ses résidus aminés libres et avons montré que la protéine immobilisée conserve à la fois son activité biologique à court et à long terme 19. Ce protocole offre un moyen simple et efficace pour délivrer la BMP-2 dans des cellules pour des études in vitro sur les mécanismes qui se produisent à la membrane cellulaire et régulent la signalisation intracellulaire responsable de la signalisation ostéogénique.
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Protocol
Une. Synthèse de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide ester (NHS-MU)
- Ajouter goutte à goutte une solution de 500 mg de N-hydroxysuccinimide et 30 mg de 4 - (diméthylamino) pyridine dans 10 ml d'acétone (PA) pour 1 g d'acide 11-mercaptoundécanoïque dans 40 ml de dichlorométhane (pa) à la température ambiante (RT).
- Refroidir la réaction à 0 ° C et ajouter goutte à goutte 1,1 g de N, N '-dicyclohexylcarbodiimide dans 10 ml de dichlorométhane (sous atmosphère d'azote). Gardez la réaction à basse température pendant 1 heure puis mélanger à température ambiante jusqu'au lendemain.
- Filtrer le précipité et le sécher sous pression réduite. On purifie le produit par Chromatographie éclair avec du benzène de pétrole et d'acétate d'éthyle (ap) dans un rapport de 1:1.
2. Préparation de couches d'or homogènes
- Des lamelles de verre propres avec des lingettes de précision et soniquer les pendant 5 min dans une solution contenant un mélange 1:1 d'acétate d'éthyle (pa) et de méthanol (pa). Rinse substrats avec du méthanol et sèchent sous flux d'azote.
- Placer les substrats de nettoyage dans le dispositif de revêtement par pulvérisation. Évacuer la chambre. Enlever la couche d'oxyde de chrome plus élevée à partir de la cible de chrome par pulvérisation cathodique pendant 60 sec. Placer les échantillons au-dessous de la poutre métallique et les enrober d'une couche de chrome de 10 nm, suivi par enrobage avec une couche d'or de 40 nm.
3. L'immobilisation de la surface de la BMP-2
- Dissoudre MU-NHS dans du N, N-dimethlyformamide (DMF) à une concentration finale d'environ 1 mM et l'incubation des substrats d'or dans la solution MU-NHS à température ambiante pendant 4 heures sous atmosphère d'azote.
- Surfaces soniquer dans le DMF pendant 2 min, rincer avec du DMF et MeOH et sèchent sous flux d'azote.
- Préparer une solution stock de rhBMP-2 dans HCl stérile 4 mm avec une concentration de 100 pg / ml (aliquotes de conserver à -80 ° C). Pour les dilutions de travail (3,5 pg / ml), diluer la solution mère dans du PBS / NaCl (PBS contenant 1 M de NaCl) et undjust à pH 8,5, immédiatement avant utilisation.
- Incuber les surfaces fonctionnalisées MU-NHS dans la solution de travail rhBMP-2 à 4 ° C pendant une nuit. Retirer surnageant d'incubation. Surfaces soniquer dans PBS / NaCl pendant 2 minutes et laver 3 fois avec PBS stérile / NaCl.
4. Caractérisation de surface
- Pour bloquer l'adsorption non spécifique de l'anticorps, incuber les surfaces avec une BSA à 5% (p / v) dans une solution PBS pendant 1 heure à température ambiante, suivi d'une incubation avec un anticorps anti-BMP-2 (1:100 dans 1% (w / v ) solution de BSA / PBS) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les surfaces deux fois avec du PBS et de traitement par ultrasons pendant 30 s.
- Incuber les substrats avec un anticorps secondaire conjugué à HRP (1:1000 dans 1% (p / v) de solution de BSA / PBS) pendant 30 min à température ambiante, puis le laver deux fois avec du PBS.
- Utilisez Ampliflu essai rouge pour mesurer l'activité enzymatique HRP à 570 nm avec un lecteur de plaque.
5. Analyse de l'activité biologique
- Seed 1 x 10 5 souris C2C12 myoblastes par puits dans 6 puits plates dans un milieu de croissance, consistant en un haut DMEM contenant du pyruvate de glucose supplémenté avec 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et de les incuber pendant 24 heures à 37 ° C / 5% CO 2.
- Affamer les cellules dans du DMEM sans sérum pendant 3-5 heures avant le semis sur les surfaces décorées avec BMP-2 immobilisé.
- Pour l'enquête de court terme signalisation induction, remplacer le milieu par 200 ul DMEM sans sérum frais et placer les immobilisés BMP-2 surfaces au-dessus des cellules. La surface doit être manipulé avec des pincettes fines de pointe pour éviter les rayures.
- Retirez délicatement la surface de et aspirer le milieu avec une pipette, laver les cellules deux fois avec du PBS. Procéder à l'analyse des réponses cellulaires.
- Pour l'analyse de l'activité biologique à long terme, les cellules de la plaque sur les surfaces et leur culture à 37 ° C / 5% CO 2 dans des conditions de sérum faible (2% de FBS) pendant six jours.
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Representative Results
Dans notre configuration, l'or a été choisi comme excipient car il fournit un système biologique non spécifique mais chimiquement accordable. En outre, l'application de monocouches auto-assemblage comporte de nombreux avantages: SAM adsorber spontanément par leurs «tête-groupes" sur les métaux et forment des monocouches avec quelques défauts, tandis que leurs groupes terminaux fonctionnels peuvent encore être modifiés. Ainsi, ils fournissent une plateforme pour adapter les propriétés de l'interface d'une manière encore très adaptable contrôlée 20.
Pour l'immobilisation de la BMP-2 sur des surfaces revêtues d'or, nous avons utilisé une approche en deux étapes: 1) la liaison du lieur MU-NHS à la couche d'or, puis 2) la réaction du linker avec la protéine (voir la figure 1). Pour prouver la liaison de la rhBMP-2, nous avons utilisé un test immuno-enzymatique. Dans ce dosage, les surfaces présentant immobilisé rhBMP-2 ont été incubées avec un anticorps spécifique de la BMP-2 et un anticorps secondaire conjugué à HRP. La liaison de ce dernier peut être determined utilisant une solution Ampliflu Rouge. En présence de peroxyde d'hydrogène, HRP catalyse la conversion de l'incolore Ampliflu Red (10-acétyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) dans la résorufine de composé fluorescent. Nous avons détecté surface immobilisée rhBMP-2 (IBMP-2) avant et après l'approche ci-dessus à partir de cellules adhérentes avec des surfaces fonctionnalisées. S'il vous plaît noter que pour la détection de rhBMP avec le dosage Ampliflu Rouge, les échantillons sont soumis à plusieurs étapes d'incubation et les traitements. Par conséquent, il n'est pas possible d'étudier la même surface avant et après la stimulation des cellules. Figure 2A montre le succès de la liaison de la rhBMP-2 à la surface dans une conformation reconnu par l'anticorps anti-BMP-2 IgG. Figure 2B montre une IBMP- 2 surface qui a été utilisé pour stimuler les cellules pendant 30 min avant l'essai immunologique HRP. Même après la stimulation des cellules de la protéine est détectée à la surface.
réponses cellulaires à des surfaces présentant rh immobiliséBMP-2 a été évaluée et comparée à l'effet de substrats d'or non traités (contrôle négatif). Afin de minimiser l'influence du procédé d'adhérence sur l'analyse de la signalisation de courte durée, une configuration spéciale a été développée pour la stimulation cellulaire. Ici, les cellules C2C12 ont été stimulées pendant 30 minutes par la rhBMP-2 surfaces fonctionnalisées qui s'approchent par le haut. La lignée cellulaire de myoblastes de souris C2C12 est une lignée de cellules précurseurs mésenchymateuses pluripotentes, qui est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la phase précoce de différenciation ostéogénique pendant la formation osseuse dans les tissus musculaires. Dans ce modèle, la BMP-2 inhibe la différenciation des cellules en myotubes multinucléés et induit des phénotypes 21 ostéoblastes. L'activation de Smad 1/5/8, qui sont des reporters aval de la voie de signalisation des BMP-2, est analysé par western blot. Comme le montre la figure 3A, la phosphorylation de Smad n'est observée après 30 minutes de stimulation par IBMP-2, alors qu'aucune de phosphorylation se produit Smad 1/5/8dans des cellules exposées à des échantillons non traités d'or. Ce résultat indique que le procédé d'immobilisation ne modifie pas l'activité de BMP-2 à court terme et déclenche les étapes précoces de la signalisation Smad.
Pour déterminer si IBMP-2 affecte la différenciation ostéogénique à long terme, le niveau de la phosphatase alcaline (ALP) d'expression, un marqueur ostéogénique, a été étudiée par un test colorimétrique. L'activité des cellules C2C12 ALP a été mesurée après incubation des cellules pendant 6 jours sur l'or brut (contrôle) et l'IBMP-2 surfaces. Activité ALP dans des lysats de cellules cultivées sur des surfaces IBMP-2 montre une absorption sensiblement plus élevée en comparaison au témoin (figure 3B). Ce résultat montre que IBMP-2 induit l'expression de l'ALP marqueur ostéogénique dans les cellules C2C12. Cette lignée cellulaire est connue pour différencier à confluence pour atteindre dans la condition de faible sérum, formant ainsi des myotubes et l'expression de protéines caractéristiques myogéniques. Cependant, le traitement avec la BMP-2 provoque un décalage dansla voie de différenciation ostéoblastique à partir myoblastique, supprimant par conséquent la formation de myotubes. Pour étudier l'effet de l'IBMP-2 sur la myogenèse, les cellules C2C12 ont été étalées directement sur l'or (contrôle) ou surfaces fonctionnalisés et cultivées dans la différenciation (bas) sériques conditions. Après 6 jours, la coloration de chaîne lourde de myosine (MHC) a été réalisée. Comme le montre la figure 3C, les cellules C2C12 ne parviennent pas à former des myotubes positives MHC en présence d'IBMP-2, mais pas sur des substrats d'or.
Figure 1. Schéma du procédé d'immobilisation de la rhBMP-2 sur des surfaces d'or. Lamelles de verre sont revêtus d'une couche d'or et ensuite incubé avec un lieur hétérobifonctionnel (MU-NHS), résultant en une monocouche auto-assemblée NHS-fonctionnalisé (SAM). Des amines primaires de la BMP-2 réagissent avec l'agent de liaison menant à la coprotéine de valence immobilisé sur le substrat. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Surface-liée rhBMP-2 peut être détectée par un test immunologique enzymatique avant (A) et après (B) expériences de stimulation de cellules immobilisées. RhBMP-2 a été quantifiée à l'aide de dosage colorimétrique Ampliflu rouge. L'absorption a été mesurée à 570 nm et les données ont été normalisées à commander (non traité surfaces d'or) valeurs. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de la moyenne n> 3.
Figure 3. Immobilisé rhBMP-2 reste biologiquement actif et induit à court termeet à long terme. événements de signalisation (A) Des cellules C2C12 ont été stimulées pendant 30 minutes par une exposition à des surfaces d'or (de commande) et les surfaces immobilisé de manière covalente avec la rhBMP-2 (IBMP-2) à l'approche de la partie supérieure. Après lyse des cellules, les échantillons ont été immunoblottées pour p-Smad1/5/8 et β-actine. (B) L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline (ALP) indique la différenciation ostéogénique des cellules C2C12 et a été mesurée à partir de lysats de cellules après une incubation de 6 jours période sur le contrôle ou l'IBMP-2 surfaces, respectivement. Activité ALP a été mesurée en tant que l'absorbance à 405 nm. Bar graphique montre les données acquises après une réaction de 60 min. Les barres d'erreur indiquent l'écart type, n = 3, * p <0,01 (C) des cellules C2C12. Ont été ensemencées sur des surfaces indiquées et cultivées pendant 6 jours dans des conditions de sérum faibles pour permettre la myogenèse. Images montrent la chaîne lourde de la myosine (MHC) de coloration de myotubes multinucléées (vert) et DAPI noyaux coloration (bleu). Grossissement de l'image 20x.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de surfaces fonctionnalisées avec bioactif rhBMP-2. Cette approche comporte deux étapes: 1) la formation initiale d'une monocouche d'auto-assemblage (SAM) d'un groupe de liaison bifonctionnel sur la surface d'or, 2) l'immobilisation covalente de la protéine de rhBMP-2. Dans des travaux antérieurs, nous avons validé la liaison efficace de l'agent de liaison bifonctionnel, et le facteur de croissance, et démontré que la surface immobilisée rhBMP-2 conserve son activité biologique 19. La bioactivité de facteurs de croissance présentés sous une forme immobilisée a également été montré dans d'autres études, indiquant que la libération des protéines et leur internalisation ultérieure ne sont pas essentiels pour la stimulation des cellules 24,25. En fait, l'immobilisation covalente de facteurs de croissance permet la stimulation prolongée des cellules cibles tout en maintenant un dosage efficace en raison de taux d'occupation accrue des différents types de récepteurs de la membrane cellulaire 22,23,26-28.
Pour la préparation des surfaces présentant immobilisé rhBMP-2, les soins devraient être prises dans le traitement des surfaces toute la procédure et à la préparation de la solution de rhBMP-2. Les lamelles de verre doit être propre et sec et aucun signe de défaut ou d'impuretés doivent être visibles. Gratter la surface avec des pincettes et des pipettes doit être évitée. Pour l'étape de fonctionnalisation de surface utilisant la rhBMP-2, il est essentiel d'utiliser une protéine recombinante sans support, c'est à dire sans ajouter de la sérum albumine bovine dans la préparation, pour éviter l'immobilisation indésirable du support sur la surface. Le rhBMP-2 stock (100 pg / ml) est dissous dans HCl 4 mM. Lorsque les surfaces sont mises en incubation avec la solution de rhBMP-2, le pH doit être ajusté à la neutralité à faible pH alcalin pour améliorer la réaction du groupe amino de la protéine avec le groupe NHS de l'agent de liaison lié à une surface. Si le pH est trop faible, le groupe NHS peut être hydrolyse avant qu'il puisse réagir esprith les groupes amino de la protéine. Nous utilisons PBS contenant 1 M de NaCl 29 et ajoutons rhBMP-2 en stock, puis ajuster le pH avec du KOH (10 mM).
Avec ce protocole nous avons atteint l'immobilisation succès bioactif rhBMP-2 sur les surfaces parce que: 1) nous avons établi une approche en deux étapes; 2), nous avons utilisé un lieur approprié pour obtenir la distance de la surface et de lier la protéine sans grandes perturbations sur son interaction avec le récepteur. L'alcane-thiol-réactif d'amine, ester 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxy-succinimide (NHS-MU), a été attaché au substrat d'or dans la première étape. Comme alcanethiols s'auto-assembler sur des métaux tels que l'or, formant une monocouche très ordonnée, ils facilitent la décoration de surfaces avec une variété de molécules de liaison de 30 à 32. Le SAM protège biomolécules d'un contact direct avec la surface solide, réduisant ainsi le risque de dénaturation 32. En outre, la longueur du segment de liaison détermine également la reactivité de la SAM. Les groupes NHS de linkers constitués d'au moins onze atomes de carbone, tels que la MU-NHS, sont plus accessibles, ce qui entraîne une augmentation de l'immobilisation de protéines par rapport à la liaison à des lieurs plus courts 34. L'immobilisation de la rhBMP-2 se fait par le déplacement du groupe NHS par les résidus de lysine de la protéine 34. Compte tenu de l'environnement purement stérique, la réaction des groupes NHS surface immobilisée prend probablement lieu dans les résidus N-terminaux flexibles 35. Cependant, comme indiqué pour les autres ligands, la longueur et la flexibilité du lieur peut permettre une interaction avec autrement encombrement stérique des sites de liaison, compensant ainsi l'orientation défavorable 36,37. Dans un travail non publié, nous avons comparé la seule étape avec une stratégie d'immobilisation en deux étapes. La comparaison entre l'utilisation d'une solution contenant à la fois des protéines et des segments de liaison, et la surface de liaison séquentielle de l'agent de liaison et de la protéine, a montré que seuls les deux-stratégie de l'étape a donné lieu à l'immobilisation du ligand bioactif. Cela peut être dû à un effet protecteur de la SAM, ce qui empêche la dénaturation des protéines qui pourraient avoir lieu sur l'or. En outre, étant donné que le groupe de liaison est déjà ancré à la surface, la reticulation entre les protéines à travers les groupes de l'agent de liaison et leur inactivation résultant extrémité sont contournées 38.
Pour les expériences avec des cellules stimulées par immobilisé sur la surface de la rhBMP-2, il est essentiel de déterminer à l'avance qui ne forment pas C2C12 myotubes dans le flacon de culture avant leur ensemencement sur le substrat. Par conséquent, les cellules doivent être maintenues en culture sous-confluente. Le lot de sérum foetal bovin utilisé pour la culture et pour les expériences doit être testé pour s'assurer qu'aucun stimuli ostéogéniques sont présents. Ceci est effectué en utilisant l'essai Quantikine pour la détection de protéines morphogénétiques osseuses et en testant les cellules de marqueurs de différenciation ostéogénique, par exemple Alkal expression de la phosphatase ine. Lors de la manipulation des substrats pour la stimulation de la partie supérieure de cultures, il est de nouveau important d'éviter les rayures avec la pince à épiler. Le séchage de la culture et de compression des cellules doit être évitée dans tous les cas, sinon la distorsion et la mort cellulaire affectera négativement la réponse à la BMP-2 stimulation. Il est recommandé de pipetage environ 100 ul de DMEM dans chaque puits d'une plaque à 6 puits où les cellules sont cultivées avant d'appliquer le substrat sur les cellules. Les cellules doivent être observées au microscope pour s'assurer qu'aucun changement morphologique sont déclenchés par la présence des surfaces au-dessus des cultures. Enfin, lors de l'enlèvement des substrats, dont un côté est soigneusement levé avec la pince et le substrat est légèrement décollée. Un contrôle immédiat de tout dommage cellulaire avec un microscope en champ lumineux doit être effectuée, ainsi qu'un contrôle des substrats pour déterminer si des attaches cellulaires ou les principales impuretés sont présents.
_content "> En conclusion, la procédure en deux étapes présenté fournit un outil utile pour immobiliser rhBMP-2 sur des substrats par l'intermédiaire de ses résidus d'amine d'étudier son impact sur les réponses cellulaires. La stratégie décrite combine de nombreux avantages. D'une part, il n'est pas limitée à la BMP-2, mais elle peut également être appliquée à d'autres facteurs de la famille des BMP de croissance, étant donné qu'ils présentent une structure d'acides aminés hautement conservée. D'autre part, en empêchant l'adsorption non spécifique, cette approche permet l'étude de la BMP-2 ciblé , tout en réduisant la quantité de facteur de croissance et, plus particulièrement, ce qui empêche la libération non contrôlée de la surface.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Professeur JP Spatz (Département de chimie biophysique de l'Université de Heidelberg et du ministère des nouveaux matériaux et des biosystèmes, Institut Max Planck pour les systèmes intelligents, Stuttgart) pour son soutien en nature. Le soutien financier de la Max-Planck-Gesellschaft et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 à EAC-A.) Sont également très reconnu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
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