Fleksibel Koloskopi i Mus å vurdere alvorlighetsgraden av kolitt og kolorektal tumorer ved en godkjent Endoskopisk Scoring System

Summary

I løpet av de siste årene har nye generasjon endoskop dukket opp som viktige diagnostiske forsknings hjelpemidler for å vurdere murine kolitt og kolorektal tumorer. Vi presenterer heri detaljert protokoll for endoskopisk evaluering av inflammasjon og kolorektale svulster i mus, så vel som en ny poengsystem som bruker desimaltall identifikatorer for å dokumentere endoskopisk alvorlighetsgraden av kolitt og kolorektale svulster.

Abstract

Bruken av moderne endoskopi for forskningsformål har mye lettere vår forståelse av gastrointestinale sykdommer. Spesielt har eksperimentelt endoskopi vært meget nyttig for studier som krever gjentatt vurderinger i en enkelt forsøksdyr, slik som de evaluere mekanismer av kronisk inflammatorisk tarmsykdom og progresjon av kolorektal kreft. Men metodene som brukes på tvers av studier er svært variabel. Har blitt publisert minst tre endoskopiske scoring systemer for murine kolitt og publisert protokoller for vurdering av kolorektal tumorer unnlater å ta tilstedeværelsen av samtidig colonic betennelse. Denne studien utvikler og validerer en reproduserbar endoskopisk scoring system som integrerer evaluering av både betennelse og svulster samtidig. Denne romanen scoring system har tre hovedkomponenter: 1) vurdering av omfanget og alvorlighetsgraden av tykktarmsbetennelse (basert på perianale funn, transparens av wall, mucosal blødning, og fokale lesjoner), 2) kvantitativ registrering av tumorlesjoner (grid kart og bar graf), og 3) numerisk sortering av kliniske tilfeller av deres patologiske og forskning relevans basert på desimaltall enheter med tildelte kategorier av observert lesjoner og endoskopiske komplikasjoner (desimaler identifikatorer). Videoen og manuskript som presenteres her ble utarbeidet, følgende IACUC-godkjente protokoller, slik at etterforskerne å score sine egne eksperimentelle mus ved hjelp av en godt validert og svært reproduserbare endoskopisk metodikk, med systemet muligheten til å differensiere distal fra proksimale endoskopisk kolitt (D-PECS ).

Introduction

Murine endoskopi har blitt utført som et nyttig forskningsverktøy for over et tiår ^1-3. Hittil har de fleste studier ansette murine endoskopi brukes stive endoskop, selv om noen har også brukt fleksibel sigmoidoskopi. Murine endoskopi gir umiddelbare resultater og en mer objektiv estimat av omfanget av intestinal normalitet, alvorlighetsgraden av inflammasjon og tumorprogresjon i forhold til indirekte mål, slik som kroppsvekttapet, diaré og histologi (som er suboptimal når lesjoner er usammenhengende), mens tilbyr innsikt i den generelle helsen til tykktarmen. Mest spesielt tillater endoskopi for gjentatt vurdering av laboratoriedyremodeller over tid, i motsetning til tradisjonelle histologisk undersøkelse som krever dyr som skal avlives, og kolon å bli høstet for analyse ^1.. Til tross for disse fordeler, har bruken av murine endoskopisk teknologien ikke har vært utbredt og er begrenset av mangel på standardiserte protokoller for implementatipå og scoring av patologiske funn. Riktig implementert, murine endoskopi har store løftet for ytterligere å forenkle vår forståelse og karakterisering av dyremodeller for flere kroniske gastrointestinale sykdomstilstander, inkludert inflammatoriske tarmsykdommer, kolitt og kolorektal tumorer.

Nytten av murine endoskopisk teknologi hengsler på sin reproduserbarhet og objektivitet, som krever at det foreligger standardiserte undersøkelsesprosedyrer og en konsekvent, ikke-redundante, og pålitelig scoring system for tarm patologi. Minst tre beskrivende scoringssystem for endoskopisk evaluering av kolitt ^4-6, så vel som for colonic ^4,7,8 tumorer i mus har blitt publisert. Men disse rapporterte tilnærminger og poengsystemer er ikke lett sammenlignbare på tvers av studier. I mange tilfeller, er det ingen klar definisjon av kriterier brukt for klassifisering av lesjoner, og når kriterier er gitt, de varierer sterkt. VidereDet er ikke rapportert scoringssystem som integrerer en vurdering av både kolitt og tumorer, to av de vanligste colonic patologier som kan forekomme samtidig, og som har interaktive effekter på resultatet, i en enkelt måleverktøy. Til slutt, de endoskopiske scoring systemer som eksisterer for kolitt har ofte provoserende kategorier med begrenset diskriminering (dvs.. Smale scoringsmuligheter over korte heltall skalaer, ofte 1-4) til å representere skikkelig sykdomsprogresjon scenarier og muliggjør bruk av parametrisk statistisk analyse.

I denne artikkelen beskriver vi bruken av et fleksibelt endoskop for å vurdere alvorligheten av murine kolitt og tumorer i kolon, og beskriver en standardisert protokoll for anvendelse av denne teknologi i den anatomiske vurdering av det perianale området, rektum, og distale colon. Vi illustrerer effektiv feilsøking under endoskopi for å redusere traumer og bilderester, og vi beskrive en reproduserbar scoring systembasert på validerte publiserte kliniske parametre. Poengsystemet integrerer evaluering av både tarmbetennelse og svulster ved hjelp av en høy grad av diskriminering med 12 mulige karakterer på betennelse, tumor kartlegging og plotting alternativer, og en roman desimal enhet system (dvs. desimaler identifikatorer) for å markere funn med spesifikk diagnostisk verdi ( dvs. svulstutvikling, komplikasjoner under endoskopi, etc.). Bruken av desimal-identifikatorer muliggjør rask sporing av relevante datasettene for videre nedstrøms analyse. Avslutningsvis gjør vi reliabilitet og validitet testing av poengsystemet i flere murine modeller av kolitt og kolitt-assosiert kreft (dextransulfat natrium (DSS) indusert-kolitt, Clostridium difficile-infeksjon, og azoxymethane / DSS-indusert tykktarmskreft).

Protocol

En. Sette opp Endoskopi System

1. Sett opp endoskopi systemet før bedøvelse musene, etter produsentens anvisninger. Bruk en video ureteroscope designet for mennesker for denne protokollen (Figur 1). Den ytre diameteren av innføringsrøret er 9,9 Fr (3,3 mm), er dens distale ende 8.5 Fr (2,8 mm), og den indre diameter av instrumentering kanalen er 6 Fr (1,2 mm).
2. Selv om bruken av endoskoper ikke har vært knyttet til sykdomsoverføring [9], sterilisere endoskopet og linse med 70% etanol, ¹⁰ eller med egnede teknikker når det arbeides med sporedannende mikroorganismer. Forbered bakteriostatisk steril smøremiddel og ikke-skrape tørke vev å mette endoskopet tips.
3. Fest en 3 ml sprøyte full av luft (eller en egnet _CO2 gassblanding) til toppen av instrumentering kanalen.
4. Slå på strømmen, og satt opp hvitbalansen i normal hvitt lys,samt smale band imaging (NBI)-modus, når dette er aktuelt. Siden 2001 har NBI gitt diagnostikk fordeler som det understreker fint blodkarstrukturer på slimhinner, inkludert ulcerøs og tumorous lesjoner, som har karakteristisk unormal vaskularisering ^11. NBI-filter modus begrenser bølgelengden fanget lys til 390-445 nm og 530-550 nm, noe som fremhever strukturer med hemoglobin.
5. Skriv ut vurderingsscoringsform (Figur 2) for å registrere dine funn. Bli kjent med forventede normale og NBI bilder (figur 3A) og definisjonen og grader av hvert kriterium før eksamen (se pkt. 6.1).
6. Tilbered en farvebasert løsning på fosfat-bufret saltvann (PBS) for chromoendoscopy, om ønsket. I chromoendoscopy, er eksamen utført ved hjelp av et fargestoff som kontrastmiddel for å markere slimhinneforandringer. Bruk metylenblått (0,1-1%) og indigotin (0,1%) løsninger (Figur 3B). Notesom metylen-blått er et oksidasjons-reduksjons-middel som kan produsere oksiderende radikaler, indirekte tverrbinding av aminosyrerester, og DNA-nedbrytning ^12, som vil kunne forstyrre analyse av prøver.

2. Generell anestesi av mus

1. Velg anestesimiddel og tilførselsvei. Ta kontakt med en veterinær fra et dyr ressurs anlegget eller Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) om eventuelle forstyrrelser av medisiner med immunsystemet og forskning mål. Noen medisiner kan påvirke cytokin profil uttrykk i dyr, inkludert gnagere ^13. Bruk injiserbare tribromoethanol for terminal prosedyrer eller isofluran til redningsendoskopier, sammen med passende kontroller.
2. For induksjon, administrere 4-5% av isofluran i 100% oksygen med en hastighet på 0,2-0,5 l / min, bruke 0,5-2% for vedlikehold. Denne protokollen er ikke hensiktsmessig for alle dyr. Rådfør deg med anlegget veterinærfor riktige instrukser og opplæring. Holde relevante IACUC anbefalinger for å oppnå de høyeste standarder for dyrevelferd. Pass på at musen hvis fullt bedøvet.
3. 'Stropp' bedøvet mus på en bæreflate tabell i en dorsal og ventrale stilling ved hjelp av laboratorie-tape. Pass opp for den anatomiske orientering på endoskop skjermen. Sikre sine underekstremitetene og hale. Et band av tape kan også plasseres over brystet for å hindre bevegelse bort fra respirator, men unngå å begrense thorax ventilatory bevegelser.

Tre. Detaljert endoskopisk undersøkelse

1. Se etter perianale lesjoner før du setter endoskopet inn i endetarmen, og deretter fremme omfanget gjennom anus.
2. Coat endoskopet med steril kirurgisk smøremiddel. Pass på ikke å belegge overflaten av CCD (charge coupled device) sensor.
3. Sett endoskopet og starte innspillingen. Innspilte videoer er nyttige for meticulous evaluering av endoskopi hvis nødvendig etter eksamen. Prøv å utføre endoskopisk i minst mulig tidsrom for å minimalisere tarm / slimhinneirritasjon.
4. Påfør luften ved hjelp av en sprøyte for å sakte beskikket intestinal vegger. Avhengig av størrelsen av musen bruker 1-2 ml med luft. Unngå overdreven luft innblåsning, det kan føre til åndenød og død bedøvet mus.
5. Advance endoskopet frem som du rydde vei med luft eller milde rotasjon av omfanget. Ikke avansere endoskopet hvis du ikke ser intestinal lumen. Perforeringer eller endetarms / colonic tårer kan oppstå på dette stadiet, spesielt i ung mus (<8-10 uker gamle). Ta bilder som nødvendig.
6. Etter hvert som omfanget fremskritt, vurdere om det er spontan blødning (definert som naturlig forekommende mucosal hemorrhaging ikke forbundet med traumatiske endoskopi). Spontane blødninger kan observeres som endoskopet går inn i endetarmen og tykktarmen.
7. SomSess gjennomsiktigheten til colonic veggen. Åpenhet er definert som evnen til å visualisere de egenutført blodkar i tykktarmen, og at av de andre omkringliggende innvoller (figur 4). Lett bevegelse av omfanget (back-forward, klokken, klokken) vil hjelpe avgjøre om blodkar kan ses i sammenheng med andre indre organer. Mesenteric fettvev kan også sees. Legg merke til om endetarmen inne i bekkenhulen vises mindre gjennomsiktig enn den colonic veggen i bukhulen.
8. Inspiser å bestemme type og antall av fokale lesjoner (ødematøse områder, erosjoner, sår, tumorous massene). Dette vil bli tatt opp i scoringsform ved hjelp av tykktarmsbetennelse score og desimal identifikatorer som er blitt utviklet.
9. Når det området hvor kolon bøyer kaudalt inn i den proksimale colon er nådd, trekker endoskopet langsomt og se etter tilstedeværelsen av kontakt blødning (som oppstår på grunn av mucosal sprøhet etterendoskop er avansert eller fjernet). Det er ikke nødvendig å skrape kolon overflate med hensikt. Sunn kolorektal slimhinne ikke blør etter skikkelig endoskopisk undersøkelse.

4. Biopsi

1. Når biopsi er nødvendig, setter de biopsitang gjennom endoskopet kanal dedikert for instrumentering. Overvåk fremme av tang på endoskopet skjermen for å hindre intestinal perforasjon.
2. Åpne biopsi kopper pinsett til om en 60-80 ° cup-til-kopp vinkel, og henvise dem til området av interesse. Overdrevet åpnet tang eller trykk kan gripe ekstra lag av tarmvevet, noe som resulterer i en biopsi-indusert perforasjon av sunne gjennomsiktige intestinal vegger. Hvis perforasjon oppstår, avlive dyret under anestesi følge dine IACUC anbefalinger. Perforeringer resultere i endotoksemi og peritonitt.
3. Lukk biopsi kopper, og trekke dem ut mens du holder pinsett stengt.
4. Remove prøven fra pinsett ved å spyle vevet med en løsning som er skånsom mot vevet og tang. RNA senere og PBS er vanlige arbeidsløsninger, om nødvendig, bruke nål til å løsne prøven. Unngå undergraver forcep kopper eller skjærekanter.

5. Utvinning fra Anesthesia

1. Ved gjennomføring av eksamen, gir et varmt miljø til musen før det kommer seg. Bruk enten en elektrisk lys, eller en varm pute innstilt ved 37 ° C. Unngå overoppheting; perifer vasodilatasjon kompromisser dyr utvinning. Overvåk musen tett inntil full restitusjon.

6. Integrert Endoskopisk Scoring System of Colorectal Helse med Desimalodds identifikatorer

1. Bruk scoringsform (Figur 2) og parameterdefinisjonene nedenfor (Endoskopisk Vurdering av Murint Colorectal Betennelse og Svulster Bruke en desimal vektet Scoring System: Parameter Definisjoner, og Protocol) foreksempler og den valgfrie 'Distal-Proximal Endoskopisk kolitt scoring system' (D-PECS) som retningslinjer for nonbiased vurdering og detaljert journalføring.
2. Scorer fire parametere av kolorektal inflammasjon beskrevet på scoring system form (figur 2). Omhyggelig evaluere perianalområdet, intestinal åpenhet, type intestinal blødning (hvis den finnes), og tilstedeværelse og mengde av fokale lesjoner (erosive, ulcerøs, og / eller tumorous).
3. Ved vurdering av svulster for forskningsformål, undersøke mengde, plassering og størrelse, og beskrive dem ved hjelp av colonic kartet og søylediagram på scoringsform. Den numeriske sum av resultatet som oppnås og antallet lesjoner (når dette er aktuelt) vil bestemme bakgrunnstykktarmsbetennelse, den mest dominerende type av lesjon, og antallet lesjoner.

Representative Results

Protokollen og bilder presentert i denne studien var forberedt med en Olympus URF-V fleksible endoskop ¹⁴ og NBI ^11,15. Videobilder ble lagret i MPEG-2-format og bilder i JPG, TIF, PNG, eller DICOM format med maksimum 1280 x 1024 piksler, overførbar til standard USB flash bærbare minner. NBI forbedrer visuell kontrast av hemoglobin som inneholder vev. Normal lys og NBI bildebehandling er viktige funksjoner for å illustrere normal anatomi av kolorektal slimhinne og forskjellene mellom normal og unormal vaskularisering under sårdannelse og tumor utvikling (Tall 3A og 6A). Bilder med metylenblått som kontrastmiddel under chromoendoscopy vise sine fordeler for nærbilder, avslører antennen normal honeycomb utseende colonic krypter (se på nært hold i Figur 3B).

Hittil har vi gjennomført over 500 murine endoscopies follovinge denne protokollen, med ca 10% som representerer gjentatte avhør. Vanligvis krever prosedyren 10-15 minutter å fullføre, delt likt mellom administrasjon av anestesi, endoskopi, og utvinning fra anestesi. Prøven omfatter fra anus til milt bøyning av den distale colon. Vi har også med hell utført post mortem endoskopiske undersøkelser av den proksimale kolon, cecum og ileum i noen tilfeller, etter post mortem disseksjon av vevet umiddelbart før høsting vev for histologi (figur 6B). I ett tilfelle, har vi også observert og bekreftet mistenkt gastrisk dilatasjon i en mus berørt med alvorlig duodenal striktur og toppelse på grunn av intestinal adhesjon. Den unormale bilde ble observert transmurally fra den kraniale side ved en mildt betent distal colon; post mortem undersøkelse viste oppblåst magen ble sammenstilt til tykktarmen.

Vi har utviklet en gyldig og pålitelig desimaler vektet scoring system for å forbedre den standardiserte anvendelse av murine endos tvers publiserte forskningsstudier. Tre scoring systemer har vært tidligere ansatt og tjente som grunnlag for utvikling av vår desimal vektet system ^4-6. Selv om disse systemene gir mulighet for kategorisering av ulike kriterier og nivåer av lesjon alvorlighetsgrad, mangler de riktige kriterier definisjoner, hvorav noen er vanskelig å vurdere fra endoskopiske bilder. I noen tilfeller, tvetydige parametre som inngår i poengsystemer har tvilsom relevans til endoskopisk undersøkelse hos mus. Et sammendrag av elleve publiserte parametre ^4-6 og deres endoskopiske fordeler, begrensninger og fysiologiske relevans er presentert i tabell 1.

Fordi den foreslåtte murine colonic endoskopi scoring system vil bli brukt til forskningsformål, dens nytte for å utføre statistisk slutning var avgjørende. For å sikre at poengsystemet haddehøy begrepsvaliditet, vi først utviklet et konseptuelt rammeverk for å identifisere relevante parametere, gruppert disse parametrene til færre kriterier (n = 3), og vurderte sin colinearity og korrelasjon med faktiske tilstedeværelsen av inflammasjon og helbredelse (figur 7). Deretter la vi perianale funn ved hjelp av diskrete heltall å representere ordens nivåer av alvorlighetsgrad, og integrert begrepet tumor induksjon og utvikling ved hjelp desimaler identifikatorer. I tillegg la vi 'strukturer' som en annen parameter ikke tidligere vurdert / rapportert i murine intestinal endoskopi. De resulterende ut-satte produsere høy gyldighet og er egnet for parametrisk statistisk analyse. Til slutt la vi kartlegging og numeriske plotting evner for detaljert sykdomsovervåking.

For å vurdere konvergent gyldigheten av vår vurdering systemet, ble resultatet innhentet fra tre publiserte parametere for 36 mus koloskopier sammenlignet mot resultatet obtainert av samme person blindt ved hjelp av tre tidligere scoring systemer ^4-6. Hver sammenligning viste god positiv korrelasjon, noe som indikerer høy konvergent validitet for vår integrerte scoring system (Pearson p <0,0001, figur 8). Analysen støtter inkludering av perianale funn som en del av de kliniske kriterier for å vurdere kolorektal helse, som det var ofte til stede i tilfeller av alvorlig kolitt og forbedret data spredning (P = 0,0351 mellom poengsum 0 og 1, P = 0,0086 mellom poengsum 2 og 3, figur 8B). Når den integrerte scoringssystem (etter tilsetting perianale funn) ble sammenlignet med andre tilgjengelige systemer, var det tydelig at to av de tre andre systemer har stor slutnings begrensning på grunn av opphopning av tilfellene til en av de fire mulige heltall kategorier, en større indikasjon på metoden feilklassifisering skjevhet (figur 8C) ^16. Med desimaltall identifikatorer, har vår romanen scoring system den laveste sannsynligheten for clustrere datapunkter i heltall kategorier.

Figur 1. Instrumenter. Fleksibelt endoskop, video styresystem, lyskilde, videoopptaker, og innånding anestesi maskin brukt i denne studien. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Desimal scoring system skjema for vurdering av kolitt og kolorektal tumorer i mus. Systemet har en kjerne inflammatorisk komponent av fire ikke-ko-lineære parametere, grafikk for tumor informasjon, og desimaltall enheter til kjente skader eller komplikasjoner. Se detaljerte kriterier og eksempler i avsnittet nedenfor (Endoskopisk Vurdering av Murint Colorectal Betennelse og Svulster Bruke en desimal vektet Scoring System). Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. Sammenkoblede bilder av normal slimhinne i normal endoskopisk lysmodus, NBI-modus, og med chromoendoscopy. Arborization av blodkar er normalt mindre vanlig i endetarmen. Klikk her for å se større bilde .

FO: content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4.jpg" width = "500px" />
Figur 4. Tverrsnitt representasjon av tarmslynger for å illustrere prinsippet for endoskopisk transparensen til tarmveggen i mus. Endoskopisk visualisering av mural intestinale fartøy og mesentrialfett og at av mesenteriale fartøy og fett fra tilstøtende friske organer, er det mulig gjennom veggen av en sunn kolon. Betennelse og fortykkelse av tarmveggen i peritoneal deler av distale kolon hindrer visualisering av egenutført og transmurale strukturer fra andre indre organer, selv om andre tarmsegmentene er sunt. Klikk her for å se større bilde .

3/50843fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50843/50843fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Feilsøking. Løse dårlig sikt forårsaket av tarminnholdet, uskarpe bilder og peristaltiske bevegelser. Klikk her for å se større bilde .

Figur 6. Sammenkoblede bilder (vanlig lys vs smale bånd bildebehandling, NBI) av sykelig kolorektal slimhinne og andre proksimale tarmsegmenter. NBI bidrar til å identifisere ulcerøs og tumorous lesjoner. Noen sår vises brunlig med NBI, andre, dekket med fibrinous materialet vises tykk og hvit. AOM / DSS svulster er bedre karakterisert med NBI, spesielt i tidlige stadier når de ikke erstikker inn i lumen. Stjerner (*) markere endoskopisk artefakt (slimhinne corrugation) i tykktarmen fylt med PBS, ikke observert i alle andre bilder der tykktarmen er forstorrede med luft. Klikk her for å se større bilde .

Figur 7. Teoretisk korrelasjon og co-linearitet mellom alvorlighetsgraden av tarmbetennelse og evnen til å visuelt skjelne og grade ulike publiserte kriteriene for tykktarmsbetennelse (se tabell 1). Klikk her for å se større bilde .

Figur 8. Sammenligning av ytelse mellom vår scoring system og tidligere publiserte scoring systemer. Data fra sammenkoblede blinde analyser av 36 mus videoendoskopier. A) Sammenligning av System A (5 parametre) til de inflammatoriske parametre, unntatt perianale lesjoner (3 parametre). B) Viktigheten av å inkludere perianale funn i poengsystemet;. perianal undersøkelse konsekvent gitt ekstra statistisk signifikant informasjon i tilfeller av moderat / alvorlig kolitt hos mus C) Utførelse av poengsystemet etter inkludert perianale funn i forhold til tidligere rapportert systemer (36 mus video endoscopies ble scoret med hver metode). Legg merke til at systemene B og C har en stor begrensning på grunn av opphopning av tilfellene i en av sine fire kategorier som leder til misclassification skjevhet (Systems B og C klase tilfeller i nonequivalent kategorier). Ved å legge til desimaler identifikatorer, vi også senket sjansen for clustering i heltall kategorier, samtidig som sporing av nå meningsfulle numeriske score. Klikk her for å se større bilde .

Tabell 1. Kliniske parametre publisert som endoskopiske kriterier for å vurdere tarmbetennelse hos mus. Klikk her for å se større bilde .

Endoskopisk assessment av Murint Colorectal Betennelse og Svulster Bruke en desimal vektet Scoring System: Parameter Definisjoner og protokoll

Vår integrerte endoskopisk scoring system for kolorektal helse har tre hovedkomponenter: 1) vurdering av omfanget og alvorlighetsgraden av tykktarmsbetennelse, med fire parametere og 12 mulige numeriske karakterer; 2) opptak av plassering, størrelse og antall tumorous lesjoner, og tre ) desimaler enheter med tildelte typer primære eller dominerende lesjoner og endoskopiske komplikasjoner for å markere funn av spesiell betydning for forskeren, heretter kalt "desimaler identifikatorer". Plasseringen og størrelsen på svulstene blir registrert på en virtuell colonic kart, og antallet av tumorer i hvert prosentandel av fremspringet (obstruksjon) inn i hulrommet blir tatt opp i en graf. Disse to listene gi svulst informasjon som kan integreres i tre dimensjoner. Desimalen enheter for lesjon kategorier spenner 0,0 til 0,9. Hvis numBER lesjoner for en bestemt kategori er relevante, andre og tredje desimaler kan brukes til å indikere antallet lesjoner. Hvis for eksempel tre lesjoner er observert, og legger 0.003 ville tillate forskeren til å vite at det var tre lesjoner, hvis det er 12 lesjoner, så 0.012 ville bli brukt. Dette system for sporing er av spesiell fordel hvis gjentatte endoskopiske undersøkelser er forventet. Detaljerte definisjoner av betennelse kriteriene og alvorlighetsgrad karakterene er gitt nedenfor.

A. Vurdering av kolorektal infammation med fire kliniske parametre - Definisjon av endoskopiske kriterier

En. Perianale funn: Vurdere dette aspektet før du begynner scoping å unngå forveksling med post-endoskopi blødning. Helsen til perianal-regionen er en proxy for helsetilstanden i tykktarm, hud, og dyrets holdning generelt, og inngår som en del av endoskopisk undersøkelse fordi noen lesjoner kan ikke og should ikke bli undersøkt nøye med det blotte øye. Utøve biosikkerhet tiltak som er hensiktsmessig. Merk at sunne grooming vaner av musene kan fjerne blod / utslipp, men vil ikke fjerne hudlesjoner fra perianalområdet. Scoring:

0. Normal. Ingen blod, diaré, sprekker, fistler eller utflod observert.
1. Klumper av avføring eller diaré observert.
2. Propper / klumper av blodig utflod, løs avføring (diaré), pus, eller mindre sår observert.
3. Granulasjonsvev eller lesjoner observert som involverer de fleste av de omkringliggende hud og indikerer at dyret har merket irritasjon eller betennelse i perianal regionen, rektal prolaps.

2. Åpenhet av kolon: definert som evnen til å visualisere blodårer eller ekstramurale organer gjennom colonic veggen som kolon-endoskop er forsiktig flyttes. Legg merke til at endetarmen er naturligvis mindre gjennomsiktig på grunn av muskellagene end fordi det er i bekkenhulen der mindre kontrast eksisterer. Dette er en av de mest omfattende fysiologisk parameter som det reflekterer den samlede inflammatorisk tilstand eller helsen til den murine colon. Legg merke til at det er mulig å ha en ikke-betent tykktarm med slimhinne erosjoner / sår i tidlige stadier av infeksjonen eller toksiske effekter på epitelet. Vær oppmerksom på at fysiologisk isotonisk oppløsning skal brukes til å spyle under endoskopi, som hypotoniske løsninger, som for eksempel vann, forårsake endringer med bleking og sammentrekning av slimhinnen i mus hvis bruk for lengre perioder (Se stjernene i figur 6).

0. Normal. Store og små blodårer i tykktarmen og de omkringliggende innvoller er klart synlig. Flytt endoskopet litt (frem og tilbake, klokke / mot klokka). Hvit mesentrialfett eller mørk innholdet på andre indre organer kan også observeres.
1. Små fartøy er delvis usynlige, men store fartøy er synlige.
2. Liten vessels er usynlig og store fartøy er ikke klart. Den mucosa vises ikke tyknet.
3. Tilsynelatende fortykkelse av tarmveggen og / eller slimhinneødem / generalisert. Blodårene er ikke synlig. Få oppblåst / varicose fartøy kan være synlig i noen tilfeller.

Tre. Mucosal blødning: Skille kontakt blødning fra spontane blødninger. Rutinemessig standard endoskopiske prosedyrer i sunn mus bør ikke indusere blødning. Hvis det er betennelse, kan den økte mucosal vaskularitet og vev skjørhet føre til slimhinneerosjon og blødning. Det er ikke nødvendig å med hensikt skrape tykktarmen for å vurdere denne parameteren.

0. Normal, ingen blødning.
1. Felles kontakt blødning. Denne traumatisk blødning er definert som kontakt blødning, den skal bedømmes først etter uttak av endoskopet.
2. Ikke relevant. Forsettlig ikke tildelt tvinge sensor for å bestemme nature for blødning.
3. Spontan blødning, definert som en ikke-traumatisk og naturlig forekommende blødning som er observert som endoskopet trer i tykktarmen. Noen ganger, induserer luft innblåsning spontan blødning under alvorlig kolitt.

4. Fokale lesjoner: For å imøtekomme den usammenhengende, uforutsigbare natur colorectal sykdommer, gjør at denne integrerte scoring system gradering for tilstedeværelsen av fokale lesjoner (for det meste ulcerøs i naturen) av alvorlighetsgraden av betennelse. Siden kolon er en kort, rett rørformet segment i mus, ble det ansett unødvendig å beskrive plasseringen av lesjoner. I stedet er antallet lesjoner registrert og lagt inn i den totale poengsum ved hjelp av systemet av desimaldata identifikatorer. Men hvis vekt på plasseringen av lesjonene er nødvendig, har vi et alternativ som heter "Distal-Proximal Endoskopisk kolitt Scoring System '(D-PECS) beskrevet nedenfor i punkt F. Videre strømlinjeformede bruksområder kan væreutledet fra vår desimal scoring system. Fordi svulster sjelden eksistere uten å indusere noen form for betennelse i endetarms regionen i mus, har vi tatt med svulster i desimaltall identifikatorer delen for å unikt tillate studiet av svulster i sammenheng med tarmhelse (se nedenfor).

0. Normal, ingen fokale lesjoner.
1. Veldefinerte områder av liten flat høyde er dekket av normal slimhinne observert. Dette er å ta opp lokale ødematøse områder eller potensielle områder for celle infiltrasjon / spredning, som finnes i mild kolitt.
2. Rødlig eller erosive områder observert.
3. Sårdannelse eller strikturer. Sår er identifisert av rødhet og misdannelse (uregelmessige kanter med tegn på unormal vaskularisering) på grunn av ødem eller fibrotisk reparasjon såret. NBI endoskopi er nyttig å skille deteksjon eller observasjon av sår. Strikturer er anerkjent som områder unormalt smale, sirkulære eller uregelmessige og statiske i form, som ikke kontrakt eller utvide som exventet. Ofte strikturer innebærer områder av unormale slimhinne krypter, eller villi i ileum. I tilfellet av fleksible endoskoper (ytre diameter = 3,3 mm) den manglende evne til å fremme grundig omfanget til mer proksimale deler av tykktarmen har vært konsekvent forbundet med unormale strukturer bekreftet post-mortem.

B. Tumor diagrammer for opptak beliggenhet, størrelse og antall

En. Virtuell colonic map: Denne er en virtuell perspektivbilde av den distale colon og rektum som er laget ved å kutte toppen av hulrommet (0 °) og rulle den ut. Toppen og bunnen av diagrammet er tilordnet proksimalt i tykktarmen (bøyning) og anus, respektivt. Senterlinjen (180 °) viser undersiden av hulrommet (ventrale del av dyr), og høyre og venstre halvdeler av halvsirkler viser høyre og venstre vegg i lumen. Kartet kan benyttes til å beskrive plasseringen og den horisontale størrelsen av svulster, samtsom sår.

2. Tumor tallene for hver grad av tumor okkupasjon: Selv om tykktarms kartet gir bare todimensjonal informasjon, er i hvilken grad svulster vokser inn i tarmlumen en viktig funksjon av svulster, siden utstikket kan forårsake intestinal stenose eller obstruksjon. For å fange opp denne informasjonen, la vi en opptaks graf for prosent fremspring inn i hulrommet som dokumenterer antall tumorer i hvert prosent-området, slik at en tredimensjonal perspektiv for vurdering av omfanget av colonic tumorer.

C. Desimalgrader identifikatorer for å gjøre numeriske skårer meningsfylt og fast-track relevante saker

Vår scoring system bruker en roman desimal identifikator system for å registrere tilstedeværelsen av relevante skader eller komplikasjoner. Disse identifikatorer er for beskrivende formål, og er ment å lette tolkningen av poengsummene og fast-track tilfeller av endoskopisk interesse. Men de tjener også til numerisk vekt dominerende typer lesjoner, og la den generasjonen av datasett mottagelig for parametrisk statistikk. Når du bruker den utviklede scoringsform, merker lesjoner som hensiktsmessig, og velg en desimal identifikator for å bli lagt til den inflammatoriske poengsum.

0. Ingen spesielle funn.
1. Perianal fistel, eller overdreven perianal betennelse, rektal prolaps.
2. Primært erosive lesjoner med mindre veggen engasjement.
3. Mostly ulcerøs lesjoner, noen dekket med fibrin, blødning, eller store med uregelmessige former på grunn av coalescing av små sår (antall sår kan bli registrert som 0.301 for en svulst, 0,302 for to svulster, 0,311 for elleve svulster, etc.).
4. Tarm Innsnevringen (valgfritt fordi striktur er en alvorlig betennelses komplikasjon i kolitt, tilsett 2 poeng til den totale inflammatorisk score).
5. Veldefinert plakk (tykk / ikke-transparent vev i tarmveggen, f.eks & #160, en flat lav høyde tumor). Antallet plakk kan bli registrert som beskrevet for lesjoner (dvs. 0,401, 0,402, ... 0.411, etc.). De kan virke som en flat ikke-utvidbart underlag som kan virke til å rage opp til ca 5 til 10% som modifiserer den omkretsmessige utseendet av tarmlumen.
6. Utstå masse eller tumorous lesjon. Antallet massene kan tas opp som beskrevet for lesjoner (dvs. 0,601, 0,602, ... 0.611, etc.). De er tydelig buler, men kan virke flat, men utstå> 15% av den utspilte omkretsen av tarmlumen.
7. Indusert tåre / perforasjon under endoskopi.
8. Død av dyr under endoskopi.
9. Annet: _____________ (f.eks alvorlig proksimale endoskopisk kolitt, se Distal-Proximal Endoskopisk kolitt Scoring System nedenfor).

D. Eksempler og programmer

Murine endoskopi poengsystem presentert i denne artikkelen er specifically utviklet for å integrere innsamling og analyse av data om colonic betennelse og kolorektal tumorer. Med hensyn til svulster, kan dataene bli analysert ved hjelp av flere statistiske metoder, inkludert arealet under kurven, median, modus, eller prinsipal komponent analyse. På individnivå, kan poengsystemet hjelpe forskerne overvåke colonic helse i et enkelt muse over tid. Etter å summere inflammatoriske subscores og tilføye den riktige desimal identifikator for type og antall lesjoner der dette er hensiktsmessig, vil den totale poengsum tillate forskere å numerisk kvantifisere omfanget av tykktarmsbetennelse, den mest dominerende type av lesjon, og antallet lesjoner. For eksempel, en score på 12,609 indikerer at denne musen har alvorlig tykktarmsbetennelse og ni utstå tumorous massene, en sunn mus med en normal perianalområdet og kolorektal slimhinne som ble perforert under endoskopi ville ha en total poengsum på 0,7. Den desimal identifikator system viltillate forskere å katalogisere og enkelt søke store datalagre av scoret mus. For eksempel kan en forsker satt søkekriterier for å identifisere alle poeng som slutter på "0,6" og hente alle saker som har utstående svulster. Flere eksempler er illustrert i den supplerende Tall S1-S3.

E. Distal-proksimale endoskopisk kolitt scoring system (D-PECS)

Dette er en valgfri modifikasjon av vår desimal identifikator poengsystem for å skille tilfeller med alvorlig / omfattende proksimale kolitt. Fordi de endoskopiske tegn på kolitt og kolorektale tumorer i mus synes å utvikle konsekvent i de distale deler av kolon anbefales:

• Å score kolon etter kriteriene beskrevet, betaler spesiell oppmerksomhet til de fjerne to tredjedeler av tykktarmen og ignorere den proksimale segmentet hvis det er tilsynelatende friske. Dette unngår forvirring og øker diskriminerende effekt av endoskopi til forskjellertiate dyr med ulike grader av omfattende kolitt.
• Hvis inflammatoriske eller tumor endringer er observert i proksimale tredje, anbefaler vi å legge ett punkt til den totale poengsum (1,0) og tilordne desimal identifikator som '0 0,9 - Annet ", som kunne merkes så alvorlig proksimale endoskopisk kolitt. Plott funnene i kart rutenett og stolpediagram.
• Overvåk dyr som har endoskopiske abnormaliteter i den proksimale tredjedel av tykktarmen. Vær spesielt oppmerksom post mortem, som sykdom kan være uvanlig alvorlig eller kan strekke seg utover milten flexure mot proksimale kolon.
• Dersom denne anbefalingen ble fulgt, ta denne tilnærmingen i 'observasjoner delen av evalueringsskjemaet, og følge denne trenden over eksperimenter. Vennligst sitere i den endelige publikasjonen at vurderingen ble gjennomført etter vår "distal-proximal endoskopisk kolitt scoring system 'eller D-PECS, som spenner 0 til 13,9. Legg merke til at denne modifikasjon ikke har noen s tatistical effekt på vår scoring system hvis de brukes på dyr uten omfattende / alvorlig proksimale kolitt.

Supplerende Tall.

Figur s1. Eksempel på endoskopisk vurdering av en mus med kolorektal tumorer. Dyrene ble behandlet med AOM og DSS før endoskopi. A) Representant bilde i normal og NBI-modus, henholdsvis. B) Scoring skjema fylt med endoskopiske funn. Legg merke til at selv om det er to relevante funn, valgte forskeren å tildele desimal identifikator 0,6 basert på klinisk alvorlighetsgrad og forskning mål. En rekke parametrisk statistisk analyse kan gjennomføres med de data som er registrert i "Kart av svulster / sår" og "Record av tumorfremspring 'diagrammer. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Figur s2. Eksempel på en mus med en colonic innsnevring og en endoskopisk komplikasjon. Legg merke til innsnevring av tarmlumen og at en nonperforating, slimhinne tåre ble indusert under endoskopi bare distal til innsnevring nettstedet. Innsnevring og svekkelse av den betente tykktarmen kan føre til slimhinne tårer. Dyret var under generell anestesi. Merk at poengsystemet har tillatt oss å overvåke og redusere komplikasjoner. Klikk her for å se større bilde .

43/FigureS3.jpg "width =" 500px "/>
Figur s3. Eksempel på tiden løpet av betennelse og endoskopisk scoring i en DSS-behandlede mus. Merk at tallene kan være selvforklarende og viser at colonic betennelse kommet (1-5 og 8), og at erosjoner utviklet av dag 8 (desimal 0,2 ) og sår etter dag 11 (desimal 0,3). Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Det er flere hensyn angående modifikasjon og feilsøking av endoskopisk teknikk i mus. Kritiske aspekter ved fremgangsmåten som må beherskes ved bruk av fleksible endoskopi omfatter justeringen av luftmengden som trengs for å hindre abdominal distensjon og respiratorisk kompromiss av musen, og mindre tekniske aspekter vis kontroll med koordinering av vinkelen og momentkontroller . Dreiemoment-kontroll er viktig å minimalisere risikoen for intestinal perforering. Når håndteres riktig, blir murine fleksibel endoskopi en veldig trygg, rask prosedyre som tillater direkte visualisering og biopsi prøvetaking av tarm forskningsområder interesse.

For å løse vise blokkeringer på grunn av avføring (figur 5), er det viktig å forstå at fecal pellet blir vanligvis observert selv etter fasting eller bruk av avføringsmidler. Når stede, kan avføringen bli lett flyttes proksimalt med milde luft insufflation. Omkring 11% av tilfellene, er det nødvendig å også benytte 1 ml PBS klyster. Før gjennomfører klyster, utvise forsiktighet når undersøke dyr som synes å ha oppblåst mage eller som er gravide. For peristaltiske bevegelser er det viktig å vente noen sekunder før den peristaltiske bølgen passerer siden luft innblåsning stopper ikke peristalsis.

Til dags dato, de fleste endoskopiske vurderingssystemer som brukes til å evaluere murine tarmsykdom er spesifikke for enten kolitt eller kreft. Gitt at disse to forholdene ofte forekommer samtidig, og kan samhandle med hverandre, en standardisert scoring system som tar hensyn til både betennelse og svulstdannelse vil i stor grad forenkle tverrfaglig kommunikasjon, og dermed styrke brukbarheten av informasjon fikk i løpet av gastrointestinal forskning av kreftforskere, og vice versa. Fordi tumorer eksistere sjelden uten å indusere noen form for inflammatorisk endring i kolorektal region in mus, har vi tatt med svulster i desimaltall identifikatorer delen av vår poengsystem for å unikt tillate studiet av svulster i sammenheng med tarmhelse. For å styrke gyldigheten og påliteligheten til scoring system og tilrettelegge bruken i langsiktige eksperimenter eller kliniske studier, har vi også utviklet en standardisert rapportskjema for å bruke sammen med poengsystemet (Figur 2), som systematisk lagrer dataelementene som kreves for å beregne murine tarmbetennelse score, basert på presise definisjoner for hver klassifiseringskriteriene.

Den forrige tilgjengeligheten av flere murine endoskopi scoring systemer har begrenset gyldighet hindrer tolkning av resultater på tvers av studier. For å minimere forvirring oppleves av laboratoriepersonell i å avgjøre hvilke publisert metode å bruke, anbefaler vi utfører endoskopisk vurdering etter kriterier som kan utledes fra to-dimensjonale bilder (f.eks unngå kriterier that henvises til tekstur eller konsistens - av avføring,. oppmerksom på at noen mus inkludert bakterie-fri kan ha myk avføring), og som ikke ko-lineære (dvs. som er fysisk og tidsmessig drives av den samme inflammatorisk forbindelse) På grunn av at kardinaltegn av betennelse er sekvensiell grunn kronologisk provoserende hendelser, anbefaler vi følgende kriterier: 1) intestinal åpenhet, først beskrevet av Becker et al ^fire, som en refleksjon av veggtykkelse, 2) blødning, som en indikator på slimhinnene og blodkar integritet. , 3) perianale funn, som en indikator for colonic integritet og irritasjon eller predisposisjon skin for sterk inflammasjon og 4) fokale lesjoner, å gradere alvorlighetsgraden av inflammatoriske lesjoner (som er i mus primært ulcerativ). Til dags dato har vi ikke sett tumorous lesjoner i de typiske modeller av 3% DSS-indusert murine kolitt. Murine endoskopisk scoring system er beskrevet i denne artikkelen gir for første gang, til vår kunnskapen kvantitativ mekanisme for å evaluere tilstedeværelsen og induksjon av tumor lesjoner i sammenheng med colonic inflammasjon.

For første gang har vi også fremheve viktigheten av å inkludere strikturer som en parameter under murine endoskopi, siden de ser ut til å være vanlig til stede i visse dyremodeller av tarmbetennelse, f.eks SAMP / Yit / Fc. Strikturer representerer (semi) omkretsområder submucosal kronisk inflammasjon, med tap av intestinal elastisitet på grunn av økt fibrose, som er vanskelige å bedømme endoskopisk for nybegynnere. Vi har lagt merke til i endoskopisk definerte striktur rammede mus, at det er mer betennelse i segmenter som er proksimale til innsnevring i forhold til de distale segmenter (som kan undersøkes endoskopisk), sannsynligvis på grunn av bremset intestinal transitt. For forskningsformål, er det tilrådelig å følge opp dyrene histologisk ved slutten av eksperimenter for å bedre karakterisere betennelsesmatory responser som flankerer kandidat striktur regioner.

Uten riktig trening og ekspert tilbakemeldinger, kan en hvilken som helst scoring system ha variasjon til enhver tid. Det er viktig å understreke at endoskopiske opplæringsprosedyrer utført på mus bør overvåkes av en utdannet veterinær av medisinsk faglig for å sikre: i) riktig trening av andre forskere eller teknikere, og ii) for å sikre at dyr ikke er feildiagnostisert eller utilsiktet skadet under fremgangsmåte. Konsultere veterinær som har ansvar for dyret ditt forskningsanlegg for ekspertråd før du fortsetter å gjennomføre denne prosedyren for å sikre best mulig praksis og dyrevelferd. Det er tilrådelig å rutinemessig overvåke ytelsen av utdannede endoscopists. Bruke bildene vi har presentert her som retningslinjer, randomisere rekkefølgen der dyrene blir evaluert, og vurdere alle dyr i en blindet måte. Rådfør parameterdefinisjoner og protokollkriteriene jevne og kEEP dem på hånden under endoskopi og scoring § 6).

I sammendraget, som et team av medisinske og veterinær gastroenterologer, presenterer vi en standardisert protokoll og semi-kvantitativ scoring system for endoskopisk evaluering av murine modeller av kolitt og svulster. Disse forskningsverktøy vil gjøre forskere til å utføre rutinemessige murine endoskopier, og vil tillate forskning personell på alle nivåer av erfaring å generere reproduserbare og sammenlignbare målinger av tarmbetennelse og tumordannelse på tvers av laboratorier og mellom fagområder. Vi har utviklet systemet for å produsere meningsfulle numeriske skårer med høy gyldighet, og gitt muligheter for rask sporing av spesielle funn, som kan være passelig for intern bruk i enkelte laboratorier. Vi beskriver også en diskriminerende scoring alternativ som tar hensyn til forskjeller i regional mottakelighet for sykdom i tykktarmen (se avsnitt E, ̵6; Distal-proksimale endoskopisk kolitt scoring system, akronym D-PECS). Den datarapportform og noen tall kan anvendes som vegg plakater til hjelp uerfarne forskere (figurene 1, 3, 5, 6). Vellykket gjennomføring av murine endoskopi hengsler på å bli kjent med normal anatomi mucocutaneous krysset i anus, rektum, colon, og rundt indre organer, som anatomiske forskjeller står for subtile endoskopiske forskjeller ^17.

Selv i dag selv de minste, mest fleksible, og fineste endoskopiske teknologier ikke kan nå den proksimale colon in vivo, raske teknologiske fremskritt innen kapsel og enkelt fiber endoskopi kan bli tilgjengelige for mus i nær fremtid. Den standardiserte protokollen og endoskopisk scoring system presentert i denne artikkelen representerer verdifulle verktøy for å visualisere og vurdere status for murine intestinal miljøet i levende dyr. Disse verktøyene vil facilitate sammenlignbarhet av resultater mellom avisene og på tvers av fagområder, og vil ha anvendbarhet til nye og kommende murine endoskopiske teknologier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System