Summary
蛛网膜下腔出血的威利斯穿孔腔内圆一个标准化的小鼠模型进行描述。血管穿孔和蛛网膜下腔出血是由颅内压监测监控。除了各种重要的参数被记录和控制，以保持生理条件。
Abstract
在这个视频发布蛛网膜下腔出血（SAH）的标准化小鼠模型。出血是由威利斯穿孔（CWP）的血管内圆和诱发颅内压（ICP）监测证实。从而在周围动脉循环蛛网膜下腔空间和小脑裂隙均匀血液分布的实现。体温升高，全身血压，心脏速率和血红蛋白饱和度：动物生理学是通过气管插管，机械通气，并连续在线监测的各种生理和心血管参数维护。由此，脑灌注压可以紧密监视导致淤血较少可变容积。这允许一个更好的标准化小鼠血管内丝穿孔，使整个模型高度重复性。因此，它是现成的野生型和遗传学药理和病理生理研究LY基因小鼠。
Introduction
蛛网膜下腔出血是脑卒中亚型的患者最少的有利结果 ：出血后1个月内的患者40％死亡，幸存者很少有临床有利的结果。
绝大多数自发SAHS（80％）是由颅内动脉瘤，沿前，后交通动脉，基底动脉和大脑中动脉（MCA）2大多位于破裂引起的。
这样的动脉瘤是困难的动物模型，因此，蛛网膜下腔出血动物模型中，不是由注入的血液进行进入蛛网膜下腔/脑室或蛛网膜下腔血管腔内穿孔。
自体血注入枕大池是容易执行和可重复性的血容量可直接控制3。不幸的是，蛛网膜下腔出血病理生理机制的某些方面， 例如：血管损伤，不能由该程序进行建模。诱导SAH的另一种技术方法是一种脑池内静脉4的开口。
然而，所述管腔内CWP在MCA分支似乎是过程，模型在人类的病理生理学最密切5。该方法被开发和大鼠首先描述由Bederson等人，并在同一时间通过Veelken和同事6,7。后来腔内穿孔模型适应于小鼠8,9。灯丝被插入到颈外动脉（ECA）和通过内颈动脉（ICA）推进到颅底。在MCA的分支点处的灯丝刺穿容器和诱导出血进入蛛网膜下腔的颅底。血液然后分发到沿裂缝和血管的剩余蛛网膜下腔。出血是由血凝块形成在穿孔的部位停止了，但rebleedings，WHICH往往是不利的患者10，就可能发生。因此，血管内纤维模型在过去的几年中成为一种广泛使用的SAH模型。最经常提到的缺点灯丝穿孔模型的是，出血量不能直接控制，因此可能是可变的。这种变化可以显著由动物生理学和后出血ICP严格控制减少。
老鼠有很大的优势可用大量转基因株。然而，由于它们的小尺寸的外科手术往往比在较大的物种， 例如大鼠或兔子更加复杂。因此，对于大鼠小鼠开发的技术的按比例缩小往往不会导致所期望的结果， 例如为小鼠具有非常有限的体重和血液量的非侵入性技术血压和血液气体分析以及对血红蛋白饱和度和心脏速率监测必须施加只要有可能。因此，当前出版物的目的是描述灯丝穿孔模型的蛛网膜下腔出血小鼠和演示了如何这种模式可以在一个标准化的和高度可重复的方式进行。
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Protocol
所有的手术均受到伦理审查和批准上巴伐利亚行政区政府（编号：55.2-1-54-2532.3-13-13和-2532-136-11）。动物是雄性C57BL / 6小鼠体重约25g。
1。动物的制备
- 通过将鼠标变成室内诱导麻醉。冲洗室用5％异氟醚，直到动物失去意识。
- 预混注入腹腔麻醉：芬太尼（0.05毫克/千克），咪达唑仑（5毫克/千克）和托咪定（0.5毫克/千克）。在手术过程中之前并定期检查反射。再注入初始量的三分之一每小时维持麻醉。
- 从一个20 G静脉导管11做了一个管插管经口气管。插管固定在倾斜平台（30°）的动物，收回舌头弯曲镊子，可视化操作显微镜下声带和管子插入气管在灵感。
- 鼠标放置在俯卧位，并检查管的正确位置用棉片或microcapnograph。
- 在插管连接到呼吸面罩。通风鼠标与室内空气辅以25％的氧气以180-220次/分和200-250微升的每搏输出量的频率。
- 插管管连接到microcapnograph。通过调节换气次数维持呼气末二氧化碳分压在30毫米汞柱。
- 插入直肠温度探头，并将该动物上的加热垫，以保持37℃的体温。
- 适用的环状pulsoximeter传感器上的右后爪。
- 打开用剪刀的头骨上面的皮肤。切口应大约0.5厘米长，耳朵和眼睛之间。
- 解剖与颞骨手术刀左侧颞肌。
- 胶水激光多普勒血流仪（LDF）探头上左颞骨。持探针在固定位置，直到胶硬化。
- 钻头的直径约1.5孔用牙钻成左颞骨。用生理盐水冷却骨，以防止热损伤。
- 将ICP探头插入颅腔。推进以背部尽可能防止脑组织损伤和出血。
- 如果探头是在正确的位置，固定，并用水泥密封。让水泥干燥5分钟。
- 将鼠标仔细仰卧位。
- 对于连续血压监测，导尿左股动脉。
- 股骨导管连接到血压监测装置。
2。 SAH诱导
- 打开用剪刀从胸骨到下巴（2公分）的皮肤。解剖结缔组织直言，推动唾液腺一边。
- 暴露左颈总动脉（CCA），并动员了。保存迷走神经，它运行在相同的结缔组织鞘为CCA。移动颅和揭露和调动使用相同的技术在ICA和ECA。
- 结扎ECA尽量颅越好。
- 预先安排周围的非洲经委会灯丝两个结扎。
- 与microclips闭塞CCA和ICA的暂时。定位与microclip敷贴microclips。确保销子被轻轻拉起他们回到正确应用。
- 切为细丝插入到非洲经委会同一个容器剪了一个洞。
- 插入普理灵5-0长丝12毫米长到非洲经委会。
- 有一个预先安排结扎关闭插入位点。
- 从CCA和ICA的一个microclip喷头拆下microclips。
- 推进灯丝用钳子插入ICA直到ICP升高。对ICP的突然崛起表明出血感应。
- 立即撤销灯丝和关闭两个公关结扎ECAearranged结扎连续。这可以防止渗出的插入位点。
- 缝合皮肤伤口。
- 监测动物的另外20分钟的生理学参数。
- 移去ICP和LDF探头和缝合皮肤伤口。
3。实验结束
- 用20毫升生理盐水（室温）的随后加20ml 4％PFA的PBS（4℃）transcardially灌注动物。
- 解剖出脑颅骨。切开颅骨中线和轨道腔之间。然后从脑剥骨。
- 评估蛛网膜下腔血液分布。
4。在生存手术案例的思考（而不是在视频中所示）
- 后直接麻醉诱导注射卡洛芬（4毫克/公斤皮下注射）用于术后镇痛。在术后观察期间卡洛芬（4毫克/公斤皮下）注射每24小时。 相反创血压测量使用无创血压监测系统。
- 终止注射麻醉剂拮抗皮下：纳洛酮（1.2毫克/千克），氟马西尼（0.5毫克/千克）和阿替美唑（2.5毫克/千克）。
- 拔管的动物。
- 反射恢复后，把动物带进预热室。保持动物在约32℃下24小时。
- 动物被用于在手术后的第一个小时自主呼吸和全身情况定期检查。如果脑干受影响的动物已经呼吸困难，应实施安乐死。
- 动物是他们的一般状况和体重，以及对神经系统和感觉障碍15日常检查。
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Representative Results
死亡
一旦手术技术掌握过程不会引起任何术中死亡。出血也可在几乎所有的动物来实现。术后死亡率为30-40％，与大多数动物死在术后第1天（ 图5）。
SAH后ICP值
出血前的ICP约为4毫米汞柱。在ICP的急剧增加高达120毫米汞柱出血的效果。 ICP值，然后在5分钟内，大约30毫米汞柱（ 图1）稳定。在24小时出血ICP备后仍有小幅升高至10毫米汞柱5。
SAH后血压
血压出血诱导（ 图2）后立即上升。这是由于库欣反射，这是由ICP升高启动。
SAH后的脑灌注
AF之三出血诱导脑灌注的急剧下降可以被监控。灌注到一个单独的不同层次内发生的侮辱（ 图3）后5分钟。
鲜血顺着脑供血动脉和小脑裂隙分布
我们SAH后灌注动物3小时transcardially用20毫升生理盐水随后加20ml冷4％的煤灰。大脑被小心取出，观察蛛网膜下腔血液分布。血沿着分发脑供血动脉的朝向背侧皮质周围的空间。在所有情况下，淤血覆盖在MCA到第二分路。侧面同侧的出血嵌着比对侧半球（ 图4）更多的血液。
血液分布不与ICP升高相关
在5只动物，我们调查是否ICP备D的崛起 uring蛛网膜下腔出血对蛛网膜下腔血液分布产生影响。一个假设是，该SAH期间仅显示温和上升ICP备动物可能表现出较少的淤血，然后不分发到皮层的背侧部分。我们发现，血肿只在颅底的大小似乎与ICP的崛起。沿脑供血动脉的血液分布与动物不同的ICP峰值之间没有显着差异。
图1。为SAH后5只动物SAH。代表ICP价值后，ICP值 。 点击这里查看大图 。
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图2。后 SAH后5只动物SAH。代表血压值的血压 。 点击这里查看大图 。
图3。之后的5只动物SAH后蛛网膜下腔出血。代表激光多普勒流量计的值脑灌注 。 点击这里查看大图 。
图4。沿脑供血动脉的血液分布。代表血区ribution的SAH后5只动物。红色线表示沿脑供血动脉的血液分布。 点击这里查看大图 。
图5。 SAH后在49雄性C57BL / 6小鼠蛛网膜下腔出血。生存曲线后生存曲线 。 点击这里查看大图 。
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Discussion
蛛网膜下腔出血后的治疗方案是稀缺的，大多inefficacious。因此需要后出血性脑损伤的病理生理机制还有待进一步了解，以确定新的治疗靶点，开发新的治疗方法。标准化和转基因动物， 如小鼠，重现性好动物模型对于这样的调查是至关重要的。该CWP模式已经成为一种广泛使用的型号为蛛网膜下腔出血，因为它类似于人类中的病理生理密切，但是，它在小鼠的使用是由低重复性和高际变化受到阻碍。该模型的变化是由不同的麻醉方案，这改变生理条件造成的。由于血管反应性，血压和凝血功能差12动物之间出血量不同而不同。因此，监控整个手术过程中生理条件，并建立其降低VA手术和监控的协议是非常重要的riability这种模式的。
SAH后血分布可能是物种之间的不同。在大鼠模型中的血液似乎是平均分布在两个大脑半球6。随着人类的大脑表现出gyrencephalic架构的血很可能分布主要沿脑沟，而不是主要沿血管。另一方面，在这些沟运行脑供血动脉，例如在MCA在外侧沟。因此，血管病变可能是在啮齿类动物的动物模型和人类大脑相似。
在我们的实验室，我们使用的芬太尼，美托咪定和上述用于外科麻醉咪达唑仑的组合。这种组合有对血压和血管反应性11相对小的效果。与此相反，异氟醚，在SAH研究一种广泛使用的麻醉剂，会导致周围血管扩张，严重受损脑自动调节13，和低血压立即船尾呃SAH 12，这是不经常与SAH在人类早期的病理生理相关的调查结果。因此，使用麻醉剂的协议，不打扰后出血的病理生理学是一个有效的实验性蛛网膜下腔出血模型的重要前提。
出血量取决于容器病变，因此与灯丝大小14而变化。该模型的另一关键步骤是灯丝的容器穿孔后撤出。中的ICA的血流是由灯丝破坏和延迟的戒断，可能会导致较小的出血。因此，关键的是要标准化血管穿孔和灯丝撤回之间的时间。这当然是只可能是，血管穿孔的时间点可以以高的时间精度来确定。在我们的设置，这是由ICP的连续测量来实现。 ICP的急剧增加，显示成功的血管穿孔，并允许从而standardizatioÑ丝撤出，因此出血强度。此外，ICP控制血管穿孔防止灯丝被推进太远从而防止脑组织损伤。因此，连续的ICP测定是一个极好的方法，以减少鼠蛛网膜下腔出血模型的可变性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
目前的研究是由Solorz-扎克研究基金会资助的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
