Summary
En standardiseret musemodel af subaraknoidalblødning ved intraluminal Circle of Willis perforering er beskrevet. Vessel perforation og subaraknoid blødning overvåges af intrakranielt tryk overvågning. Ud over forskellige vitale parametre registreres og styres for at opretholde fysiologiske betingelser.
Abstract
I denne video publikation en standardiseret musemodel af subaraknoidalblødning (SAH) præsenteres. Blødning er fremkaldt af endovaskulær Circle of Willis perforering (CWP) og dokumenteret af det intrakranielle tryk (ICP) overvågning. Derved en homogen blod fordeling i subaraknoid rum omkring arterielle cirkulation og cerebellare sprækker er opnået. Animal fysiologi vedligeholdes af intubation, mekanisk ventilation, og kontinuerlig on-line overvågning af forskellige fysiologiske og kardiovaskulære parametre: kropstemperatur, systemisk blodtryk, puls, og hæmoglobin mætning. Derved cerebrale perfusionstryk kan følges nøje resulterer i en mindre variabel volumen ekstravasaterede blod. Dette giver en bedre standardisering af endovaskulær endeløse perforering i mus og gør hele modellen meget reproducerbar. Det er således let tilgængelige for farmakologiske og patofysiologiske undersøgelser i vildtype og genetiskly ændret mus.
Introduction
SAH er slagtilfælde undertype med den mindst gunstige virkninger for patienter: 40% af patienterne dør inden for en måned efter blødning 1 og overlevende har sjældent et klinisk gunstigt udfald.
Det store flertal af spontane Sahs (80%) er forårsaget af brud på intrakranielle aneurismer, der er for det meste placeret langs den forreste og bageste kommunikere arterie, basilararterien og midterste cerebral arterie (MCA) 2.
Sådanne aneurismer er vanskelige at modellere i dyr, og derfor dyremodeller af SAH enten udføres ved injektion af blodet ind i subarachnoidealrummet / cerebrale ventrikler eller endovaskulær perforering af subaraknoid fartøj.
Autologt blod injektion i cisterna magna er let at udføre og reproducerbar som blodvolumen kan styres direkte 3. Desværre er nogle aspekter af SAH patofysiologi, fxkarskade ikke kan modelleres ved denne procedure. En anden teknisk metode til induktion af SAH er åbningen af en intracisternal vene 4.
Den intraluminal CWP på grenen MCA synes dog at være den procedure, at modeller patofysiologi i mennesker bedst 5. Metoden blev udviklet og først beskrevet i rotter ved Bederson og kolleger, og på samme tid ved Veelken og kolleger 6,7. Senere intraluminale perforering model blev tilpasset til mus 8,9. En glødetråd er indsat ind i den ydre carotidarterie (ECA) og avancerede til kraniet basen via den interne carotidarterie (ICA). Ved forgreningspunktet MCA perforerer glødetråden beholderen og inducerer en blødning i subarachnoidealrummet på kraniet base. Blodet distribuerer derefter i den resterende subaraknoidale rum langs sprækker og blodkar. Blødning stoppes af koageldannelse på stedet for perforering men rebleedings, WHICH er ofte skadelig for patienter 10, kan forekomme. Derfor blev den endovaskulære glødetråd model en udbredt SAH model i løbet af de sidste par år. Den hyppigst nævnte ulempe af glødetråden perforering model er, at blødende volumen ikke umiddelbart kan kontrolleres og kan derfor være variabel. Denne variabilitet kan reduceres betydeligt ved en stram styring af dyrepsykologi og post-blødende ICP.
Mus har den store fordel, at et stort antal af genetisk modificerede stammer er tilgængelige. Men på grund af deres lille størrelse kirurgiske procedurer har en tendens til at være mere kompleks end i større arter, fx rotter eller kaniner. Derfor nedskalering af teknikker udviklet for rotter til mus ofte ikke fører til de ønskede resultater, f.eks som mus har en meget begrænset kropsvægt og blodvolumen invasive teknikker til blodtryk og blodgasanalyse samt for hæmoglobin mætning og pulsmålingskal anvendes, når det er muligt. Følgelig er formålet med den aktuelle publikation beskriver glødetråden perforering model for SAH i mus og for at vise, hvordan denne model kan udføres på en standardiseret og meget reproducerbar måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske procedurer blev udsat for etisk gennemgang og godkendt af regeringen i Øvre Bayern (referencenummer: 55.2-1-54-2532.3-13-13 og -2532-136-11). Dyr er mænd C57BL / 6 mus med en kropsvægt på cirka 25 gram.
1.. Animal Forberedelse
- Fremkald anæstesi ved at sætte musen ind i et kammer. Skyl kammer med 5% isofluran, indtil dyret mister bevidstheden.
- Injicer forblandede anæstetika intraperitonealt: fentanyl (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) og medetomidin (0,5 mg / kg). Check reflekser før og regelmæssigt under proceduren. Reinjicere en tredjedel af den oprindelige mængde time for at opretholde anæstesi.
- Intubationstid orotracheally med et rør fremstillet af en 20 G venekateter 11. For intubation løse dyr på en skrå platform (30 °), trække tungen med bøjede pincet, visualisere stemmebånd under en operation mikroskop og læg slangen ind i luftrøretunder inspiration.
- Placer musen i en udsat position og kontrollere den korrekte placering af røret med et stykke bomuld eller et microcapnograph.
- Slut intubationsrøret til respirator. Udluft mus med rumluft suppleret med 25% ilt med en frekvens på 180-220 vejrtrækninger / min og et slagvolumen på 200-250 ul.
- Slut intubationsrøret til microcapnograph. Bevare sluteksspiratoriske pCO 2 på 30 mmHg ved at justere frekvensen ventilation.
- Sæt en rektal temperatursonde og placere dyret på en varmepude for at fastholde 37 ° C kropstemperaturen.
- Påfør den ringformede pulsoximeter sensoren på højre bagpote.
- Åbn huden over kraniet med en saks. Snittet skal være ca 0,5 cm lang og mellem øret og øjet.
- Dissekere venstre temporale muskel med en skalpel fra tindingebenet.
- Lim laser Doppler flowmåler (LDF) sonde påvenstre temporale knogle. Hold sonden i en fast position, indtil limen hærder.
- Bor et hul på ca 1,5 mm i diameter med et tandlægebor ind i venstre tindingebenet. Afkøl ben med saltvand for at forhindre varmeskader.
- Sæt ICP sonde ind i kraniehulen. Skub fremad så dorsalt som muligt for at undgå skade på hjernevæv og blødning.
- Hvis sonden er i den rigtige position, fix, og forsegle det med cement. Lad cementen tørre i 5 min.
- Vend musen omhyggeligt for at en liggende position.
- Til kontinuerlig blodtrykskontrol kateteriserer venstre femorale arterie.
- Forbind den femorale kateter til blodtryksovervågende indretning.
2. SAH Induktion
- Åbn huden med en saks fra brystbenet til hagen (2 cm). Dissekere bindevæv uden omsvøb og skub spytkirtlerne side.
- Udsætte den venstre fælles carotidarterie (CCA) og mobilisere det. Bevarvagus nerve, som løber i samme bindevævshinde som CCA. Flyt kranie og afsløre og mobilisere ICA og Revisionsretten ved hjælp af samme teknik.
- Ligere Revisionsretten så langt kranialt som muligt.
- Prearrange to ligations for glødetråd omkring ECA.
- Occlude CCA og ICA midlertidigt med microclips. Placer microclips med microclip applikator. Sørg for, at klippene anvendes korrekt ved forsigtigt at trække dem tilbage.
- Skær et hul til glødetråd indsættelse i Revisionsretten med et fartøj saks.
- Indsæt en prolene 5-0 glødetråd med 12 mm længde i Revisionsretten.
- Luk indsættelsesstedet med en forudbestemt ligatur.
- Fjern microclips med en microclip applikator fra CCA og ICA.
- Advance filamentet med en pincet i ICA indtil ICP stiger. En pludselig stigning i ICP indikerer blødning induktion.
- Træk glødetråd straks og liger Revisionsretten ved at lukke både PRearranged ligations fortløbende. Dette forhindrer blødning ud af indsættelsen site.
- Sy hudsår.
- Overvåg fysiologiske parametre for dyr til en anden 20 minutter.
- Fjern ICP og LDF sonder og suturere huden såret.
3. Forsøgets afslutning
- Perfuse dyret transcardialt med 20 ml saltvand (stuetemperatur) efterfulgt af 20 ml 4% PFA i PBS (4 ° C).
- Dissekere hjernen ud af kraniet. Skær kraniet i midterlinjen og mellem orbital hulrum. Så skræl knoglen fra hjernen.
- Vurdere bloddistribution i subarachnoidealrummet.
4.. Overvejelser i sag om overlevelse Surgery (ikke vist i videoen)
- Injicer Carprofen (4 mg / kg subkutant) til postoperativ analgesi umiddelbart efter anæstesi-induktion. Under den postoperative observationsperiode Carprofen (4 mg / kg subkutant) injiceres hver 24 timer. I stedet for invasiv blodtryksmåling gøre brug af en ikke-invasiv blodtryk overvågningssystem.
- Til afslutning af anæstesi injicere antagoniserende agenter subkutant: naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) og atipamezol (2,5 mg / kg).
- Extubate dyret.
- Efter at have fået reflekser aflive dyret i en forvarmet kammer. Hold dyr på cirka 32 ° C i 24 timer.
- Dyrene jævnligt kontrolleres for spontan vejrtrækning og deres generelle tilstand i de første timer efter operationen. Hvis hjernestammen påvirkes dyr har åndedrætsproblemer og bør aflives.
- Dyrene kontrolleres dagligt for deres generelle tilstand og kropsvægt samt neurologiske og sensoriske underskud 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dødelighed
Når operationen teknik er mestret procedure ikke fremkalde nogen intraoperativ dødelighed. Også blødning kan opnås i næsten alle dyr. Postoperativ dødelighed er 30-40% med de fleste dyr dør på dag 1 efter operationen (figur 5).
ICP værdier efter SAH
ICP før blødningen er omkring 4 mm Hg. Blødning resulterer i en kraftig stigning af ICP op til 120 mm Hg. ICP-værdier og derefter stabilisere inden for 5 minutter til cirka 30 mm Hg (figur 1). På 24 timer efter afblødning ICP er stadig lidt hævet til 10 mmHg 5..
Blodtryk efter SAH
Blodtrykket stiger umiddelbart efter afblødning induktion (figur 2). Dette skyldes Cushing refleks, som initieres af forhøjet ICP.
Cerebral perfusion efter SAH
After blødning induktion kan overvåges et dramatisk fald i cerebral perfusion. Reperfusion til et individuelt andet niveau sker inden for 5 minutter efter spot (figur 3).
Blood distribuerer langs hjernen leverer arterier og cerebellare sprækker
Vi perfunderet dyrene 3 timer efter SAH transcardialt med 20 ml saltvand efterfulgt af 20 ml afkølet 4% PFA. Hjernen blev forsigtigt fjernet og blod fordeling i subarachnoidealrummet blev observeret. Blood distribuerer langs perivaskulær rum i hjernen leverer arterier mod dorsale cortex. I alle tilfælde dækkede ekstravaseret blod MCA op til anden forgrening. Den side ipsilaterale til blødning blev dækket med mere blod end den kontralaterale hemisfære (figur 4).
Blood fordeling ikke korrelerer med ICP stigning
I 5 dyr undersøgte vi, om stigningen af ICP d nder SAH har en indvirkning på blod distribution i subarachnoidealrummet. En hypotese var, at dyr, der viser kun en moderat ICP stigning i løbet af SAH kunne udstille mindre ekstravasaterede blod, som derefter distribuerer ikke til dorsale dele af cortex. Vi fandt, at kun størrelsen af hæmatom på basis cranii synes at korrelere med ICP stigning. Blood fordeling langs hjernen leverer arterier var ikke forskellig mellem dyr med forskellige ICP spidsværdier.
Figur 1. ICP værdi efter SAH. Repræsentant ICP værdier på 5 dyr efter SAH. Klik her for at se større billede .
pload/50845/50845fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Blodtryk efter SAH. Repræsentative blodtryk værdier på 5 dyr efter SAH. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Cerebral perfusion efter SAH. Repræsentative laser Doppler flowmeter værdier på 5 dyr efter SAH. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Blood fordeling langs hjernen leverer arterier. Repræsentant blod distribution af 5 dyr efter SAH. Røde linjer angiver blod fordeling langs hjerne leverer arterier. Klik her for at se større billede .
Figur 5. Survival kurven efter SAH. Survival kurve efter SAH i 49 mandlige C57BL / 6 mus. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandlingsmuligheder efter SAH er knappe og for det meste virkningsløs. Derfor patofysiologi post-hæmorrhagisk hjerneskade skal yderligere forstås med henblik på at identificere nye terapeutiske mål og udvikle nye terapeutiske tilgange. Standardiseret og godt reproducerbare dyremodeller i genetisk modificerede dyr, dvs mus, er afgørende for sådanne undersøgelser. CWP-modellen er blevet en udbredt model for SAH da det ligner patofysiologien i mennesker tæt, men dets anvendelse er i mus hæmmet af lav reproducerbarhed og en høj interpersonel variation. Variationer af modellen er forårsaget af forskellige bedøvelsesmidler protokoller, som ændrer fysiologiske betingelser. Mængden af blødning varierer mellem dyr på grund af fartøjets reaktionsevne, blodtryk og koagulation forskelle 12. Derfor er det vigtigt at overvåge fysiologiske forhold i hele proceduren og til at etablere kirurgiske og overvågning protokoller, som reducerer variability af denne model.
Blood fordeling efter SAH kan være forskellige mellem arterne. I rottemodellen blod synes at være ligeligt fordelt på begge hjernehalvdele 6. Som menneskelige hjerne viser en gyrencephalic arkitektur blodet er sandsynligvis at distribuere primært langs hjerne sulci og ikke primært langs fartøjer. På den anden side, hjerne leverer arterier kører i disse sulci fx MCA lateral sulcus. Således vessel patologier kan være ens i dyremodeller og den menneskelige hjerne.
I vores laboratorium bruger vi en kombination af fentanyl, medetomidin og midazolam som beskrevet ovenfor for kirurgisk anæstesi. Denne kombination har en relativt lille effekt på blodtryk og fartøj reaktivitet 11. I modsætning hertil isofluran, en udbredt bedøvelsesmiddel i SAH forskning fører til perifer vasodilation, alvorligt nedsat cerebral autoregulation 13, og lavt blodtryk umiddelbart agtenis SAH 12 fund, der ikke regelmæssigt forbundet med tidlig patofysiologi SAH hos mennesker. Derfor er anvendelse af et bedøvelsesmiddel protokol, der ikke forstyrrer post-hæmorrhagisk patofysiologi er en vigtig forudsætning for en gyldig eksperimentel SAH model.
Mængden af blødning afhænger af fartøjet læsion og varierer derfor med glødetråd størrelse 14. Et andet afgørende skridt i modellen er tilbagetrækning af glødetråd efter skibets perforering. Blodgennemstrømningen i ICA forstyrres af glødetråd og en forsinket tilbagetrækning kan resultere i mindre blødninger. Derfor er det afgørende at standardisere tiden mellem skib perforering og tilbagetrækning glødetråd. Dette er naturligvis kun muligt, hvis tidspunkt fartøj perforering kan bestemmes med høj tidsmæssig præcision. I vores setup dette opnås ved kontinuerlig måling af ICP. En kraftig stigning i ICP indikerer en succesfuld fartøj perforering og tillader dermed standardization for tilbagetrækning glødetråd og dermed blødning intensitet. Desuden ICP-styret fartøj perforering forhindrer, at glødetråden fremføres for langt derved forhindre skade på hjernevæv. Derfor kontinuerlig ICP måling er en fremragende teknik til at minimere variabilitet af murine SAH model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Den aktuelle forskning er finansieret af Solorz-Zak Grundforskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
