Summary
Um modelo de rato padronizado de hemorragia subaracnóide por Círculo intraluminal de Willis perfuração é descrito. Perfuração de vasos e hemorragia subaracnóide são monitorados pela monitorização da pressão intracraniana. Além disso os vários parâmetros vitais são registadas e controlada para manter as condições fisiológicas.
Abstract
Nesta publicação de vídeo de um modelo padronizado rato de hemorragia subaracnóide (HSA) é apresentado. Sangramento é induzida pelo Círculo endovascular de Willis perfuração (CWP) e comprovada por pressão intracraniana (PIC) de monitoramento. Assim, uma distribuição homogênea de sangue em espaços subaracnóide em torno da circulação arterial e fissuras do cerebelo é alcançado. Fisiologia animal é mantido por entubação, ventilação mecânica, monitorização contínua e on-line de vários parâmetros fisiológicos e cardiovasculares: temperatura corporal, pressão arterial sistêmica, freqüência cardíaca e saturação de hemoglobina. Deste modo, a pressão de perfusão cerebral pode ser firmemente monitorado resultando em um volume variável de menos de sangue extravasado. Isto permite uma melhor padronização de perfuração filamento endovascular em ratos e faz todo o modelo altamente reprodutível. Assim, é facilmente disponível para os estudos farmacológicos e fisiopatológicos no tipo selvagem e genéticaly alterada ratinhos.
Introduction
HAS é o subtipo tempos com o resultado menos benéfica para os pacientes: 40% dos pacientes morrem dentro de um mês após o sangramento 1 e sobreviventes raramente têm um resultado clinicamente favorável.
A grande maioria da SAHOS espontâneas (80%) são causados pela ruptura de aneurismas intracranianos, que são na sua maioria localizadas ao longo da anterior e posterior da artéria, a artéria basilar, artéria cerebral média (MCA) 2 comunicando.
Tais aneurismas são difíceis de modelar em animais e, portanto, os modelos animais de SAH são realizadas quer por injecção do sangue para dentro do espaço / ventrículos cerebrais subaracnoideos ou por perfuração de um navio de endovascular subaracnóide.
Injeção de sangue autólogo na cisterna magna é de fácil execução e reprodutível, como o volume de sangue pode ser controlada diretamente 3. Infelizmente, alguns aspectos da fisiopatologia da HAS, por exemplo, olesão do vaso, não pode ser modelado por este procedimento. Outra abordagem técnica para indução de HAS é a abertura de uma veia intracisternal 4.
No entanto, o CWP intraluminal no ramo MCA parece ser o processo de que os modelos da fisiopatologia em seres humanos mais estreita 5. O método foi desenvolvido e descrito pela primeira vez em ratos por Bederson e colegas, e ao mesmo tempo por Veelken e colegas 6,7. Mais tarde, o modelo da perfuração intraluminal foi adaptado para ratinhos 8,9. Um filamento é introduzido na artéria carótida externa (ECA) e avançada até à base do crânio, através da artéria carótida interna (ICA). No ponto de ramificação do MCA filamento perfura o vaso e induz a uma hemorragia no espaço subaracnóide da base do crânio. O sangue, em seguida, distribui para o espaço subaracnóide restante ao longo de fissuras e vasos sanguíneos. A hemorragia é parada pela formação de coágulos no local da perfuração, mas rebleedings, which são muitas vezes prejudiciais em pacientes de 10, pode ocorrer. Por conseguinte, o modelo de filamentos endovascular se tornou um modelo amplamente usado HAS durante os últimos anos. A desvantagem mais citada do modelo filamento perfuração é que o volume de sangramento não pode ser diretamente controlado e pode, portanto, ser variável. Esta variabilidade pode ser significativamente reduzido por um rígido controle de fisiologia animal e pós-hemorrágica ICP.
Os ratos têm a grande vantagem de que um grande número de estirpes geneticamente modificados estão disponíveis. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho procedimentos cirúrgicos tendem a ser mais complexo do que em espécies maiores, por exemplo, ratos ou coelhos. Portanto, a redução de escala de técnicas desenvolvidas para os ratos para os ratos costumam não leva aos resultados desejados, por exemplo, como os ratos têm um peso corporal e volume de sangue muito limitadas técnicas não invasivas para a pressão arterial e análise de gases sanguíneos, bem como para a saturação de hemoglobina e monitoramento da freqüência cardíacatem que ser aplicada sempre que possível. Por conseguinte, o objectivo da publicação é descrever o modelo da perfuração de filamentos para HSA em ratinhos e para demonstrar como este modelo pode ser realizado de uma forma padronizada e altamente reprodutível.
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Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos foram submetidos à revisão ética e aprovado pelo governo da Alta Baviera (número de referência: 55.2-1-54-2532.3-13-13 e -2532-136-11). Os animais são macho C57BL / 6 com um peso corporal de aproximadamente 25 g.
1. Preparação animal
- Induzir a anestesia, colocando o mouse em uma câmara. Lave a câmara com 5% de isoflurano até que o animal perde a consciência.
- Injectar anestésicos pré-misturados por via intraperitoneal: o fentanil (0,05 mg / kg), o midazolam (5 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg). Verifique reflexos antes e regularmente durante o procedimento. Reinject um terço do volume inicial por hora para manter a anestesia.
- Entubar orotracheally com um tubo feito a partir de um cateter venoso 20 L 11. Para intubação fixar o animal em uma plataforma inclinada (30 °), retrair a língua com uma pinça dobrados, visualizar as cordas vocais sob um microscópio de operação e inserir o tubo na traquéiadurante a inspiração.
- Posicione o mouse em uma posição propensa e verificar o correto posicionamento do tubo com um pedaço de algodão ou um microcapnograph.
- Ligue o tubo de intubação com o respirador. Ventile o mouse com ar ambiente suplementado com 25% de oxigênio com uma frequência de 180-220 ciclos / min e um volume de ejeção de 200-250 mL.
- Ligue o tubo de intubação com a microcapnograph. Manter o final da expiração de pCO 2 a 30 mmHg, ajustando a frequência de ventilação.
- Insira uma sonda de temperatura rectal e colocar o animal numa almofada de aquecimento, a fim de manter a 37 ° C de temperatura corporal central.
- Aplicar o sensor Pulsoximeter anelar na pata traseira direita.
- Abra a pele acima do crânio com um par de tesouras. A incisão deve ser de aproximadamente 0,5 cm de comprimento e entre olhos e ouvidos.
- Dissecar o músculo temporal esquerdo com um bisturi do osso temporal.
- Cole o fluxômetro laser Doppler (LDF) da sonda emo osso temporal esquerdo. Segurar a sonda numa posição fixa até que a cola endurece.
- Faça um furo de aproximadamente 1,5 mm de diâmetro com uma broca de dentista dentro do osso temporal esquerdo. Arrefecer o osso com uma solução salina para evitar danos causados pelo calor.
- Insira a sonda de ICP na cavidade craniana. Empurrar para a frente como dorsalmente quanto possível para impedir danos no tecido cerebral e hemorragia.
- Se a sonda estiver na posição certa, corrigir e selá-lo com cimento. Deixe secar cimento por 5 min.
- Vire o mouse com cuidado para a posição supina.
- Para monitorização contínua da pressão arterial, cateterização da artéria femoral esquerda.
- Conectar o cateter femoral para o dispositivo de monitorização da pressão arterial.
2. SAH Indução
- Abra a pele com um par de tesouras de esterno de queixo (2 cm). Dissecar o tecido conjuntivo sem rodeios e empurre as glândulas salivares de lado.
- Exponha a artéria carótida comum esquerda (CCA) e mobilizá-la. Preserve onervo vago, que corre na mesma bainha do tecido conjuntivo, como o CCA. Mova craniana e expor e mobilizar a ICA ea ECA usando a mesma técnica.
- Ligadura do ECA, tanto cranial possível.
- Prearrange mais duas ligaduras para o filamento ao redor do ECA.
- Ocluir o CCA ea ICA temporariamente com microclips. Posicione os microclips com um aplicador microclipe. Certifique-se que os grampos são aplicados corretamente, puxando-os para trás.
- Corte um buraco para a inserção de filamento no ECA com uma tesoura dos vasos.
- Insira um filamento Prolene 5-0 com 12 mm de comprimento no ECA.
- Feche o local de inserção com uma ligadura premeditado.
- Retire os microclips com um aplicador microclipe do CCA e da ACI.
- Avançar o filamento com uma pinça para o ICA até o ICP sobe. Um aumento repentino do ICP indica indução sangramento.
- Retire o filamento imediatamente e ligadura do ECA, fechando tanto prligaduras earranged consecutivamente. Isso evita que o sangramento fora do local de inserção.
- Suturar o ferimento da pele.
- Monitorar os parâmetros fisiológicos do animal por mais 20 min.
- Remover ICP e sondas FDL e suturar o ferimento da pele.
3. Fim da Experiência
- Perfundir o animal transcardíaca com 20 ml de solução salina (temperatura ambiente), seguido de 20 ml de 4% de PFA em PBS (4 ° C).
- Dissecar o cérebro fora do crânio. Cortar o crânio, na linha média e entre as cavidades orbitais. Em seguida, descascar o osso a partir do cérebro.
- Avaliar a distribuição de sangue no espaço subaracnóide.
4. Considerações Em caso de cirurgia de sobrevivência (não mostrado no vídeo)
- Injetar carprofeno (4 mg / kg por via subcutânea) para analgesia pós-operatória imediatamente após a indução da anestesia. Durante o período de observação pós-operatória carprofeno (4 mg / kg por via subcutânea) é injectada a cada 24 horas. Em vez de medição de pressão arterial invasiva fazer uso de um sistema de monitoramento de pressão arterial não invasiva.
- Para a interrupção da anestesia injectar agentes antagonizar subcutaneamente: naloxona (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezol (2,5 mg / kg).
- Extubar o animal.
- Depois de recuperar de reflexos colocar o animal em uma câmara de pré-aquecido. Manter o animal em cerca de 32 ° C durante 24 hr.
- Os animais são verificados regularmente para a respiração espontânea e seu estado geral durante as primeiras horas após a cirurgia. Se o tronco cerebral é afectada animais têm problemas respiratórios e deve ser sacrificados.
- Os animais são controlados diariamente para a sua condição geral e do peso corporal, assim como para os défices neurológicos e sensoriais 15.
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Representative Results
Mortalidade
Uma vez que a técnica de cirurgia é dominado o procedimento não provocou quaisquer mortalidade intra-operatória. Além disso o sangramento pode ser conseguida em quase todos os animais. Mortalidade pós-operatória é de 30-40%, com a maior parte dos animais morrer no dia 1 após a cirurgia (Figura 5).
ICP valores após SAH
O ICP antes de sangramento é de cerca de 4 mmHg. Sangramento resulta em um aumento acentuado do ICP até 120 mmHg. Valores ICP então estabilizar dentro de 5 min a cerca de 30 mm Hg (Figura 1). Às 24 horas após a sangria do ICP ainda é um pouco elevado para 10 mmHg 5.
A pressão arterial após SAH
A pressão arterial sobe imediatamente após a sangria de indução (Figura 2). Isto é devido ao reflexo de Cushing, que é iniciado pelo PIC elevada.
Perfusão cerebral após SAH
Afindução de sangramento ter uma diminuição dramática de perfusão cerebral pode ser monitorizada. A reperfusão ao nível individualmente diferente ocorre dentro de 5 min após o insulto (Figura 3).
Sangue distribui ao longo do cérebro fornecendo artérias e fissuras do cerebelo
Nós perfundido animais três horas após SAH transcardíaca com 20 ml de solução salina, seguida por 20 ml de refrigeradas PFA a 4%. O cérebro foi cuidadosamente removido e foi observada a distribuição de sangue no espaço subaracnóide. Sangue distribui ao longo do espaço perivascular de cérebro fornecendo artérias para o córtex dorsal. Em todos os casos, o sangue extravasado coberto a MCA-se para a segunda ramificação. O lado ipsilateral à hemorragia foi coberto com mais sangue do que o hemisfério contralateral (Figura 4).
Distribuição de sangue não se correlaciona com aumento ICP
Em cinco animais que investigou se o surgimento da ICP d urante HAS tem um impacto sobre a distribuição de sangue no espaço subaracnóide. Uma hipótese é que os animais que mostram apenas uma subida moderada ICP durante HAS pode apresentar sangue extravasado menos, que, em seguida, não distribui para as partes dorsais do córtex. Descobrimos que apenas o tamanho do hematoma na base do crânio parece correlacionar-se com o aumento do ICP. Distribuição de sangue ao longo das artérias cerebrais fornecimento não diferiu entre os animais com diferentes valores de pico ICP.
Figura 1. Valor ICP após valores SAH. Representante do ICP de 5 animais após SAH. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 2. A pressão arterial após SAH. Valores de pressão arterial representativa de 5 animais após SAH. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Perfusão cerebral após SAH. Representante laser Doppler valores do medidor de vazão de 5 animais após SAH. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Distribuição de sangue ao longo do cérebro fornecendo artérias. Representante dist sangueribution de 5 animais após SAH. As linhas vermelhas indicam distribuição de sangue ao longo do cérebro fornecendo artérias. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 5. Curva de sobrevida após a curva de HAS. Survival seguinte HAS em 49 machos C57BL / 6. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
As opções de tratamento após SAH são escassos e pouco ineficaz. Portanto, a fisiopatologia da lesão cerebral pós-hemorrágica precisa ser mais bem compreendidos, a fim de identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Padronizado e modelos animais bem reprodutíveis em animais geneticamente modificados, ou seja, ratos, são cruciais para tais investigações. O modelo CWP tornou-se um modelo amplamente utilizado para a HAS, uma vez que se assemelha a fisiopatologia em seres humanos de perto, no entanto, o seu uso em ratos é dificultada pela baixa reprodutibilidade e uma variabilidade interpessoal alta. Variações do modelo são causadas por diferentes protocolos anestésicos, que alteram condições fisiológicas. A quantidade de sangramento varia entre os animais devido à reatividade embarcação, da pressão arterial e das diferenças de coagulação 12. Assim, é importante para monitorar as condições fisiológicas em todo o processo e estabelecer protocolos cirúrgicos e monitoramento que reduzem a variability deste modelo.
Distribuição de sangue após SAH pode ser diferente entre espécies. No modelo de rato sangue parece ser distribuído igualmente entre os dois hemisférios cerebrais 6. Como os cérebros humanos mostram uma arquitetura gyrencephalic o sangue tende a distribuir-se principalmente ao longo de sulcos do cérebro e não primariamente ao longo dos vasos. Por outro lado, o fornecimento de artérias cerebrais funcionam nesses sulcos, por exemplo, o MCA no sulco lateral. Assim, patologias dos vasos pode ser similar em modelos animais de roedores e do cérebro humano.
No nosso laboratório, utilizar uma combinação de fentanil, a medetomidina e midazolam, tal como descrito acima para anestesia cirúrgica. Esta associação tem um efeito relativamente pequeno sobre a pressão sanguínea e reactividade vaso 11. Em contraste, o isoflurano, um anestésico amplamente utilizado em pesquisas HAS, leva à vasodilatação periférica, auto-regulação cerebral severamente prejudicada 13, e pressão arterial baixa imediatamente a réer SAH 12, os resultados que não são regularmente associados com a fisiopatologia precoce de HAS em humanos. Por isso, o uso de um protocolo anestésico que não perturbe fisiopatologia pós-hemorrágica é um requisito importante para um modelo experimental SAH válido.
A quantidade de sangramento depende da lesão do vaso e, portanto, varia de acordo com o tamanho do filamento 14. Um outro passo crucial do modelo é a retirada do filamento depois de perfuração de vasos. O fluxo de sangue no ICA é interrompido pelo filamento e uma retirada tardia pode resultar em hemorragias menores. Por conseguinte, é essencial para padronizar o tempo entre a perfuração de vasos e de retirada do filamento. Isto é, naturalmente, apenas possível se a ponto de tempo de perfuração de vasos pode ser determinada com alta precisão temporal. Na nossa configuração isto é conseguido através de medição contínua da ICP. Um aumento acentuado na ICP indica perfuração bem sucedida embarcação e permite, assim, a standardization da retirada do filamento e, consequentemente, o sangramento intensidade. Além disso, a perfuração de vasos controlado por ICP impede que o filamento é avançada evitando assim demasiado tecido cerebral danificado. Por conseguinte, a medição contínua do ICP é uma excelente técnica para minimizar a variabilidade do modelo murino de HAS.
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Disclosures
Autores têm nada a revelar.
Acknowledgments
A atual pesquisa é financiada pela Fundação Solorz-Zak Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
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