Summary
Un modello di topo standardizzato di emorragia subaracnoidea da Circolo endoluminale di Willis perforazione viene descritto. Nave di perforazione e emorragia subaracnoidea sono monitorati da un monitoraggio della pressione intracranica. Inoltre diversi parametri vitali vengono registrati e controllati per mantenere condizioni fisiologiche.
Abstract
In questa pubblicazione il video viene presentato un modello standardizzato di topo di emorragia subaracnoidea (SAH). Bleeding è indotta da Circolo endovascolare di Willis perforazione (CWP) e provato dalla pressione intracranica (ICP) di monitoraggio. In tal modo una distribuzione omogenea di sangue negli spazi subaracnoidei che circondano la circolazione arteriosa e fessure cerebellari è raggiunto. Fisiologia degli animali è gestito da intubazione, ventilazione meccanica, e continuo monitoraggio on-line di vari parametri fisiologici e cardiovascolari: la temperatura corporea, la pressione arteriosa sistemica, frequenza cardiaca e saturazione dell'emoglobina. In tal modo la pressione di perfusione cerebrale può essere strettamente monitorati generando un volume meno variabile di sangue travasato. Questo permette una migliore standardizzazione delle endovascolare perforazione filamento nei topi e rende l'intero modello altamente riproducibile. Così è prontamente disponibile per gli studi farmacologici e fisiopatologici in wild type e geneticaly alterato topi.
Introduction
SAH è il sottotipo corsa con il risultato meno favorevole per i pazienti: 40% dei pazienti muoiono entro un mese dopo l'emorragia 1 e sopravvissuti raramente avere un esito clinico favorevole.
La grande maggioranza di Sahs spontanei (80%) sono causati dalla rottura di aneurismi intracranici che in genere si trovano lungo la anteriore e comunicante posteriore, l'arteria basilare e dell'arteria cerebrale media (MCA) 2.
Tali aneurismi sono difficili da modellare negli animali e quindi modelli animali di SAH sono o eseguite da iniezione di sangue nello spazio / ventricoli cerebrali subaracnoidea o da perforazione endovascolare di una nave subaracnoideo.
Iniezione di sangue autologo nella cisterna magna è facile da eseguire e riproducibile come il volume di sangue può essere controllato direttamente 3. Purtroppo alcuni aspetti della fisiopatologia SAH, ad esempio illesione del vaso, non può essere modellato mediante questa procedura. Un altro approccio tecnico per l'induzione di SAH è l'apertura di una vena intracisternale 4.
Tuttavia, il intraluminale CWP al ramo MCA sembra essere la procedura che modella l'fisiopatologia nell'uomo più strettamente 5. Il metodo è stato sviluppato e descritto nel ratto da Bederson e colleghi e allo stesso tempo da Veelken e colleghi 6,7. In seguito il modello di perforazione intraluminale è stato adattato ai topi 8,9. Un filamento è inserita nella carotide esterna (ECA) e avanzato alla base cranica attraverso l'arteria carotide interna (ICA). Nel punto di diramazione del MCA filamento perfora la nave e induce un sanguinamento nello spazio subaracnoideo alla base del cranio. Il sangue distribuisce poi nello spazio subaracnoideo rimanente lungo fessure e vasi sanguigni. Bleeding è bloccata da formazione di coaguli nel sito di perforazione, ma rebleedings, which sono spesso deleteria nei pazienti 10, possono verificarsi. Di conseguenza, il modello filamento endovascolare diventato un modello SAH ampiamente utilizzato negli ultimi anni. Lo svantaggio più frequentemente citato del modello filamento perforazione è che il volume emorragia non può essere controllato direttamente e può quindi essere variabile. Questa variabilità può essere ridotto significativamente stretto controllo della fisiologia animale e post-emorragica ICP.
I topi hanno il grande vantaggio che un gran numero di ceppi geneticamente modificati sono disponibili. Tuttavia, a causa delle loro dimensioni ridotte procedure chirurgiche tendono ad essere più complessa in specie più grandi, ad esempio topi o conigli. Pertanto, il downscaling di tecniche sviluppate per i ratti di topi spesso non porta ai risultati desiderati, ad esempio come topi hanno un peso corporeo e il volume sanguigno molto limitate tecniche non invasive per la pressione del sangue e analisi dei gas del sangue, nonché per la saturazione dell'emoglobina e il monitoraggio della frequenza cardiacadevono essere applicate quando possibile. Di conseguenza, l'obiettivo della pubblicazione corrente è di descrivere il modello perforazione filamento per SAH nei topi e per dimostrare come questo modello può essere eseguito in modo standardizzato ed altamente riproducibile.
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Protocol
Tutte le procedure chirurgiche sono stati sottoposti a esame etico e approvati dal governo dell'Alta Baviera (numero di riferimento: 55.2-1-54-2532.3-13-13 e -2532-136-11). Animali sono maschio C57BL / 6 topi con un peso corporeo di circa 25 g.
1. Preparazione degli animali
- Indurre l'anestesia mettendo il mouse in una camera. Lavare la camera con il 5% isoflurano fino a quando l'animale perde conoscenza.
- Iniettare anestetici premiscelati intraperitoneale: fentanil (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg). Controllare i riflessi prima e regolarmente durante la procedura. Reinject terzo del quantitativo iniziale oraria per mantenere l'anestesia.
- Intubare orotracheally con un tubo da un catetere venoso 11 G 20. Per intubazione fissare l'animale su una piattaforma inclinata (30 °), ritrarre la lingua con una pinza piegate, visualizzare le corde vocali sotto un microscopio funzionamento e inserire il tubo nella tracheadurante l'inspirazione.
- Posizionare il mouse in posizione prona e controllare il corretto posizionamento del tubo con un pezzo di cotone o un microcapnograph.
- Collegare il tubo di intubazione al respiratore. Ventilare il mouse con aria ambiente supplementato con 25% di ossigeno con una frequenza di 180-220 respiri / min e un volume di pompaggio di 200-250 microlitri.
- Collegare il tubo di intubazione al microcapnograph. Mantenere la fine espirazione pCO 2 a 30 mmHg regolando la frequenza di ventilazione.
- Inserire una sonda di temperatura rettale e posizionare l'animale su una piastra elettrica per mantenere 37 ° C la temperatura corporea.
- Applicare il sensore pulsoximeter anulare sulla zampa posteriore destra.
- Aprire la pelle sopra il cranio con un paio di forbici. L'incisione dovrebbe essere lungo circa 0,5 cm di lunghezza e tra orecchio e occhio.
- Sezionare il muscolo temporale sinistro con un bisturi dall'osso temporale.
- Incollare il misuratore laser Doppler (LDF) sondal'osso temporale sinistro. Tenere la sonda in una posizione fissa che la colla si indurisce.
- Praticare un foro di circa 1,5 mm di diametro con un trapano dentistico nell'osso temporale sinistro. Raffreddare l'osso con soluzione salina per evitare danni dovuti al calore.
- Inserire la sonda ICP nella cavità cranica. Spingere in avanti come dorsale possibile per evitare danni ai tessuti cerebrali e sanguinamento.
- Se la sonda si trova nella posizione giusta, correggere e sigillarlo con cemento. Lasciare il cemento secco per 5 min.
- Girate con attenzione il mouse in una posizione supina.
- Per il monitoraggio continuo della pressione arteriosa, cateterizzare l'arteria femorale di sinistra.
- Collegare il catetere femorale al dispositivo di monitoraggio della pressione sanguigna.
2. SAH induzione
- Aprire la pelle con un paio di forbici da sterno al mento (2 cm). Sezionare il tessuto connettivo senza mezzi termini e spingere le ghiandole salivari parte.
- Esporre l'arteria carotide comune sinistra (CCA) e mobilitare esso. Preservare l'nervo vago, che corre nella stessa guaina di tessuto connettivo come la CCA. Spostare cranica ed esporre e mobilitare l'ICA e la Corte dei conti utilizzando la stessa tecnica.
- Legare la Corte dei conti, per quanto craniale possibile.
- Predisporre altri due legature per il filamento attorno alla Corte dei conti.
- Occludere il CCA e ICA temporaneamente microclips. Posizionare i microclips con un applicatore microclip. Assicurarsi che i clip vengono applicate correttamente tirandoli delicatamente indietro.
- Tagliare un foro per l'inserimento filamento nella ECA con una forbice nave.
- Inserire un filamento Prolene 5-0 con 12 mm di lunghezza nella ECA.
- Chiudere il sito di inserimento con una sola legatura predisposto.
- Rimuovere i microclips con un applicatore microclip dal CCA e ICA.
- Far avanzare il filo con una pinza nella ICA fino alla ICP aumenta. Un improvviso aumento della ICP indica induzione sanguinamento.
- Ritirare immediatamente il filamento e legare la Corte dei conti chiudendo entrambi prlegature earranged consecutivamente. Questo impedisce sanguinamento dal sito di inserzione.
- Suturare la ferita della pelle.
- Monitorare i parametri fisiologici dell'animale per altri 20 min.
- Rimuovere ICP e le sonde LDF e suturare la ferita della pelle.
3. End of Experiment
- Perfusione l'animale transcardially con 20 ml di soluzione fisiologica (temperatura ambiente) seguiti da 20 ml di PFA 4% in PBS (4 ° C).
- Sezionare il cervello dal cranio. Tagliare il cranio sulla linea mediana e tra le cavità orbitali. Quindi rimuovere l'osso dal cervello.
- Valutare la distribuzione sangue nello spazio subaracnoideo.
4. Considerazioni in caso di vita Surgery (non mostrato nel video)
- Iniettare Carprofen (4 mg / kg per via sottocutanea) per l'analgesia postoperatoria direttamente dopo l'induzione dell'anestesia. Durante il periodo di osservazione postoperatoria Carprofen (4 mg / kg per via sottocutanea) viene iniettato ogni 24 ore. Invece di misurazione della pressione arteriosa invasiva fare uso di un sistema di monitoraggio della pressione arteriosa non invasiva.
- Per la terminazione di anestesia iniezione sottocutanea agenti antagonizzare: naloxone (1.2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezolo (2,5 mg / kg).
- Estubare l'animale.
- Dopo aver ripreso dei riflessi mettere l'animale in una camera preriscaldato. Mantenere l'animale a circa 32 ° C per 24 ore.
- Gli animali vengono controllati per respirazione spontanea e la loro condizione generale durante le prime ore dopo l'intervento. Se il tronco cerebrale è influenzata animali hanno problemi di respirazione e devono essere eutanasia.
- Gli animali vengono verificati ogni giorno per la loro condizione generale e del peso corporeo e per neurologiche e sensoriali deficit 15.
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Representative Results
Mortalità
Una volta che la tecnica chirurgica è padroneggiata la procedura non suscitare alcuna mortalità intraoperatoria. Sanguinamento può anche essere raggiunto in quasi tutti gli animali. La mortalità postoperatoria è del 30-40% con la maggior parte degli animali muore il giorno 1 dopo l'intervento chirurgico (Figura 5).
ICP valori dopo SAH
L'ICP prima del dissanguamento è di circa 4 mmHg. Sanguinamento risultati in un forte aumento della ICP fino a 120 mmHg. I valori ICP poi stabilizzarsi entro 5 min a circa 30 mmHg (Figura 1). A 24 ore dopo il dissanguamento della ICP è ancora leggermente elevato a 10 mmHg 5.
Pressione sanguigna dopo SAH
La pressione sanguigna si alza subito dopo dissanguamento induzione (Figura 2). Ciò è dovuto al riflesso di Cushing, che viene avviata da elevata ICP.
Perfusione cerebrale dopo emorragia subaracnoidea
Afsanguinamento induzione ter una drastica riduzione di perfusione cerebrale può essere monitorato. Riperfusione ad un livello diverso singolarmente verifica entro 5 minuti dopo l'insulto (Figura 3).
Il sangue distribuisce lungo le arterie cerebrali fornitura e fessure cerebellari
Abbiamo perfuso animali 3 ore dopo SAH transcardially con 20 ml di soluzione salina seguiti da 20 ml di refrigerate 4% PFA. Il cervello è stato accuratamente rimosso e distribuzione del sangue nello spazio subaracnoideo è stata osservata. Sangue distribuisce lungo lo spazio perivascolare di fornire arterie cerebrali verso la corticale dorsale. In tutti i casi il sangue travasato riguardato il MCA fino alla seconda ramificazione. Il lato omolaterale alla emorragia era coperto con più sangue nell'emisfero controlaterale (Figura 4).
Distribuzione del sangue non è correlato con l'aumento ICP
In 5 animali abbiamo studiato se l'aumento della ICP d urante SAH ha un impatto sulla distribuzione del sangue nello spazio subaracnoideo. Una ipotesi era che gli animali che mostrano solo un moderato aumento ICP durante SAH potrebbero presentare sangue meno stravasato, che poi non distribuisce alle parti dorsali della corteccia. Abbiamo trovato che solo la dimensione del ematoma alla base del cranio sembra correlare con l'aumento ICP. Distribuzione del sangue lungo le arterie del cervello fornendo non differiva tra animali con diversi valori di picco ICP.
Figura 1. Valore ICP dopo che i valori ESA. Rappresentante ICP di 5 animali dopo SAH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 2. La pressione sanguigna dopo che i valori di pressione arteriosa SAH. Rappresentativi di 5 animali dopo SAH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Perfusione cerebrale dopo che i valori di misuratori di portata SAH. Rappresentante Doppler laser su 5 animali dopo SAH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Distribuzione del sangue lungo le arterie cerebrali fornitura. Rappresentante sangue distribution di 5 animali dopo SAH. Le linee rosse indicano distribuzione del sangue lungo le arterie cerebrali fornitura. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 5. Curva di sopravvivenza dopo curva ESA. Sopravvivenza seguente SAH in 49 maschi C57BL / 6 topi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Le opzioni di trattamento dopo SAH sono scarse e per lo più inefficace. Pertanto la fisiopatologia del danno cerebrale post-emorragica deve essere ulteriormente compreso per identificare nuovi bersagli terapeutici e sviluppare nuovi approcci terapeutici. Standardizzati e modelli animali ben riproducibili negli animali geneticamente modificati, ossia topi, sono cruciali per tali indagini. Il modello CWP è diventato un modello ampiamente utilizzato per SAH come assomiglia alla fisiopatologia nell'uomo vicino, ma il suo uso nei topi è ostacolata dalla scarsa riproducibilità e una elevata variabilità interpersonale. Variazioni del modello sono causate da diversi protocolli anestetici, che alterano le condizioni fisiologiche. La quantità di sanguinamento varia tra animali a causa della reattività vaso, pressione sanguigna e differenze coagulazione 12. Perciò è importante per monitorare le condizioni fisiologiche durante tutta la procedura e stabilire protocolli chirurgici e monitoraggio che riducono la vaRIABILITY di questo modello.
Distribuzione del sangue dopo SAH può essere diversa tra le specie. Nel modello di ratto sangue sembra essere equamente distribuiti in entrambi gli emisferi cerebrali 6. Come il cervello umano mostrano un'architettura gyrencephalic il sangue è probabile distribuire principalmente lungo solchi cervello e non principalmente lungo i vasi. D'altra parte, fornendo arterie cerebrali eseguite in quei solchi pe la MCA nel solco laterale. Così patologie dei vasi potrebbero essere simili in modelli animali roditori e il cervello umano.
Nel nostro laboratorio si usa una combinazione di fentanil, medetomidina e midazolam come descritto sopra per l'anestesia chirurgica. Questa combinazione è relativamente piccolo effetto sulla pressione arteriosa e vaso reattività 11. Al contrario, isoflurano, un anestetico ampiamente utilizzato nella ricerca SAH, porta alla vasodilatazione periferica, gravemente compromessa autoregolazione cerebrale 13, e bassa pressione sanguigna immediatamente a poppaer SAH 12, i risultati che non sono regolarmente associati al precoce fisiopatologia del SAH negli esseri umani. Pertanto, l'uso di un protocollo anestetico che non disturba fisiopatologia post-emorragica è un presupposto importante per un modello SAH sperimentale valido.
La quantità di sanguinamento dipende dalla lesione nave e quindi varia con la dimensione filamento 14. Un altro passo fondamentale del modello è il ritiro del filamento dopo la perforazione del vaso. Il flusso sanguigno nel ICA è interrotta dal filamento e di un ritiro in ritardo può causare sanguinamenti minori. Pertanto, è fondamentale per standardizzare il tempo tra la perforazione dei vasi e ritiro filamento. Ciò è naturalmente possibile solo se il punto temporale di perforazione del vaso può essere determinato con precisione temporale. Nella nostra configurazione ciò è ottenuto mediante misurazione continua della ICP. Un forte aumento ICP indica successo la perforazione dei vasi e permette quindi la standardization di recesso filamento e l'intensità, quindi il sanguinamento. Inoltre, la perforazione dei vasi ICP-controllato impedisce che il filamento sia troppo avanzata impedendo così danni tessuto cerebrale. Di conseguenza, continua misurazione ICP è una tecnica eccellente per ridurre al minimo la variabilità del modello SAH murino.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
L'attuale ricerca è finanziata dalla Fondazione Solorz-Zak Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
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