Summary
מודל עכבר סטנדרטי של דימום תת עכבישי על ידי מעגל intraluminal של הניקוב וויליס מתואר. ניקוב כלי ודימום תת עכבישי מנוטרים על ידי ניטור לחץ תוך גולגולתי. בנוסף פרמטרים חיוניים שונים נרשמים ומבוקר כדי לשמור על תנאים פיסיולוגיים.
Abstract
בפרסום הסרטון הזה במודל עכבר סטנדרטי של דימום תת עכבישי (SAH) מוצג. דימום הוא מושרה על ידי מעגל endovascular של ניקוב וויליס (קואליציית נשים לשלום) ומוכח על ידי ניטור לחץ תוך גולגולתי (ICP). ובכך חלוקת דם הומוגנית בחללים תת עכבישי המקיפים את מחזור הדם בעורקים וסדקים המוח הקטן מושגת. פיזיולוגיה של בעלי חיים היא מתוחזק על ידי אינטובציה, אוורור מכאני, וניטור רציף של פרמטרים פיסיולוגיים ולב וכלי דם שונים על השורה: טמפרטורת גוף, לחץ דם מערכתי, קצב לב, ורוויה של המוגלובין. וכך לחץ זלוף המוחי יכול להיות במעקב בחוזקה וכתוצאה מכך נפח פחות משתנה של דם extravasated. זה מאפשר סטנדרטיזציה טובה יותר של ניקוב נימה endovascular בעכברים והופך את כל המודל לשחזור מאוד. לכן הוא זמין למחקרים פרמקולוגיים וpathophysiological בסוג בר וגנטיly שינה עכברים.
Introduction
אדון הוא תת סוג השבץ עם התוצאה מועילה לפחות לחולים: 40% מהחולים מתים בתוך חודש לאחר 1 דימום וניצולים לעתים רחוקות יש תוצאה חיובית מבחינה קלינית.
רוב הגדול של SAHs הספונטני (80%) נגרמים על ידי קרע של מפרצת תוך גולגולתי שרובם נמצאים לאורך הקדמי וגם אחורי תקשורת עורקים, עורק basilar, ועורק המוח אמצעי (MCA) 2.
מפרצת כאלה קשות למודל בבעלי חיים, ולכן מודלים של בעלי חיים של אדון מבוצעים גם על ידי הזרקה של דם לתוך החלל / חדרים מוחי תת עכבישי או על ידי ניקוב endovascular של כלי שיט תת עכבישי.
הזרקת דם עצמית לMagna Cisterna היא קלה לביצוע ולשעתק את נפח הדם יכול להיות נשלט על 3 באופן ישיר. למרבה הצער, כמה היבטים של הפתופיזיולוגיה אדון, למשלפגיעה בכלי, לא יכול להיות מודל על ידי הליך זה. עוד גישה טכנית לזירוז של אדון היא הפתיחה של וריד intracisternal 4.
עם זאת, קואליציית הנשים לשלום intraluminal בסניף MCA נראה ההליך שמודלי הפתופיזיולוגיה בבני האדם 5 באופן הדוק ביותר. השיטה פותחה ותוארה ראשון בחולדות על ידי Bederson ועמיתיו ובו בזמן על ידי Veelken ועמיתי 6,7. מאוחר יותר מודל ניקוב intraluminal הותאם לעכברי 8,9. נימה מוכנסת לתוך עורק הצוואר החיצוני (ECA) והתקדמה לבסיס הגולגולת דרך עורק התרדמה הפנימי (הרשפ"ת). בנקודת הסתעפות MCA נימה מנקבת את הספינה וגורמת לדימום לתוך החלל תת עכבישי בבסיס הגולגולת. הדם לאחר מכן מפיץ לתוך החלל תת עכבישי שנותר לאורך סדקים וכלי דם. הדימום הוא נעצר על ידי היווצרות קריש דם באתר של ניקוב, אבל rebleedings, WHich הם לעתים קרובות מזיקים בחולים 10, יכול להתרחש. בהתאם לכך, מודל נימה endovascular הפך מודל אדון בשימוש נרחב במהלך השנים האחרונות. הוזכר בתדירות הגבוהה ביותר החסרון של מודל ניקוב נימה הוא שנפח דימום לא ניתן לשלוט באופן ישיר ולכן עשוי להיות משתנים. השתנות זו באופן משמעותי, ניתן להפחית על ידי שליטה הדוקה של פיזיולוגיה של בעלי החיים וICP הודעה המדמם.
יש עכברים יתרון הגדול כי מספר גדול של זנים מהונדסים גנטי זמינים. עם זאת, בשל גודלם הזעיר ניתוחים נוטים להיות מורכב יותר מאשר במינים גדולים, חולדות למשל או ארנבות. לכן downscaling של טכניקות שפותחו לחולדות לעכברים לעתים קרובות אינו מביא לתוצאות הרצויות, למשל כמו עכברים טכניקות מוגבלות מאוד במשקל גוף ונפח דם לא פולשנית לטיפול בלחץ דם וניתוח גז דם, כמו גם לרווית ההמוגלובין וניטור קצב לבצריך להיות מיושם בכל הזדמנות אפשרית. בהתאם לכך, מטרת הפרסום הנוכחי היא לתאר את מודל ניקוב נימה לSAH בעכברים וכדי להדגים כיצד מודל זה יכול להתבצע באופן סטנדרטי ולשעתקו מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניתוחים היו נתונים לביקורת אתית ואושרו על ידי הממשלה בעליונה בוואריה (מספר אסמכתא: 55.2-1-54-2532.3-13-13 ו-2532-136-11). בעלי חיים הם עכברי C57BL / 6 גברים עם משקל גוף של כ 25 גרם.
1. הכנת בעלי החיים
- לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר לתוך תא. לשטוף את החדר עם isoflurane 5% עד שהחיה מאבדת את הכרתו.
- הזרק הרדמה מעורבבת מראש intraperitoneally: פנטניל (0.05 מ"ג / קילוגרם), midazolam (5 מ"ג / קילוגרם) וmedetomidine (0.5 מ"ג / קילוגרם). בדקו את הרפלקסים לפני ואופן קבוע במהלך ההליך. Reinject שליש מהסכום הראשוני לשעה כדי לשמור על הרדמה.
- צנרר orotracheally עם צינור עשוי מצנתר ורידי G 20 11. עבור אינטובציה לתקן את החיה על פלטפורמה משופעת (30 מעלות), לחזור בו הלשון עם מלקחיים כפופים, לדמיין את מיתרי קול תחת מיקרוסקופ פעולה ולהכניס את הצינור לתוך קנה הנשימהבמהלך השראה.
- מניחים את העכבר בעמדה פגיע ולבדוק את המיקום הנכון של הצינור עם פיסת צמר גפן או microcapnograph.
- חבר את צינור אינטובציה להנשמה. לאוורר את העכבר עם אוויר חדר בתוספת חמצן 25% בתדירות של 180-220 נשימות / דקה ונפח פעימה של 200-250 μl.
- חבר את צינור אינטובציה לmicrocapnograph. לשמור על קצה הנשיפה PCO 2 ב30 מ"מ כספית על ידי התאמת תדר האוורור.
- הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית ומניח את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף 37 ° C ליבה.
- להחיל את חיישן pulsoximeter טבעתי בכף הרגל האחורית הימנית.
- פתח את העור מעל הגולגולת עם זוג מספריים. החתך צריך להיות כ 0.5 סנטימטר ארוך ובין העין לאוזן.
- לנתח את שריר הרקה השמאלי עם אזמל מהעצם הטמפורלית.
- דבק flowmeter דופלר לייזר הבדיקה (LDF) עלהעצם הטמפורלית השמאלי. החזק את הבדיקה בתנוחה קבועה עד שהדבק מתקשה.
- לקדוח חור בקוטר של כ 1.5 מ"מ עם מקדח שיניים לתוך העצם הטמפורלית השמאלי. לקרר את העצם עם מי מלח כדי למנוע נזק חום.
- הכנס את הבדיקה ICP לתוך חלל הגולגולת. לדחוף קדימה כdorsally ככל האפשר כדי למנוע נזק לרקמות מוח ודימום.
- אם הבדיקה היא במיקום הנכון, לתקן, ולאטום אותו במלט. בואו יבש המלט למשך 5 דקות.
- הפעל את העכבר בזהירות למצב שכיבה.
- לניטור לחץ דם רציף, לצנתר את עורק הירך השמאלי.
- חבר את הקטטר הירך למכשיר הניטור לחץ דם.
2. אדון אינדוקציה
- פתח את העור עם זוג מספריים מעצם החזה לסנטר (2 סנטימטר). לנתח את רקמת חיבור בבוטות ולדחוף את בלוטות הרוק בצד.
- לחשוף את עורק התרדמה המשותף שמאל (CCA) ולגייס אותו. לשמר אתעצב מחנק, אשר פועל באותו נדן רקמת חיבור כמרכז לאמנות העכשווית. הזז גולגולת ולחשוף ולגייס את ICA וECA תוך שימוש באותה הטכניקה.
- ולקשור את ECA ככל cranially ככל האפשר.
- לתאם שתי ligations יותר לחוט הלהט סביב ECA.
- לחסום את המרכז לאמנות עכשווית והמנהל האזרחי באופן זמני עם microclips. מקם את microclips עם המוליך microclip. ודא קליפים מיושמים בצורה נכונה על ידי משייכתו בעדינות אותם בחזרה.
- לחתוך חור להכנסת החוט לECA עם מספריים כלי שיט.
- הכנס נימה Prolene 5-0 עם 12 אורך מ"מ לתוך ECA.
- סגור את אתר ההכנסה עם קשירה מראש אחד.
- הסר את microclips עם המוליך microclip מהמרכז לאמנות העכשווית והמנהל האזרחי.
- לקדם את חוט הלהט עם מלקחיים לתוך ICA עד ICP עולה. עלייה פתאומית של ICP מציינת אינדוקציה דימום.
- למשוך את החוט באופן מיידי ולקשור ECA ידי סגירת שני יחסי הציבורligations earranged ברציפות. זה מונע דימום מאתר ההכנסה.
- תפר את הפצע בעור.
- לפקח על הפרמטרים הפיזיולוגיים של בעלי החיים לעוד 20 דקות.
- הסר ICP ובדיקות LDF ותפרת את הפצע בעור.
3. סוף הניסוי
- תנקב את החיה transcardially עם 20 מיליליטר של תמיסת מלח (בטמפרטורת חדר) ואחריו 20 מיליליטר של PFA 4% ב-PBS (4 מעלות צלזיוס).
- מנתחים את המוח מהגולגולת. חותכים את הגולגולת בקו האמצע ובין החללים מסלולית. לאחר מכן לקלף את העצם מהמוח.
- להעריך את חלוקת הדם בחלל תת עכבישי.
4. שיקולים במקרה של ניתוח הישרדות (לא מוצג בוידאו)
- הזרק Carprofen (4 מ"ג / קילוגרם תת עורי) על כאבים שלאחר ניתוח ישירות לאחר אינדוקציה הרדמה. במהלך תקופת המעקב שלאחר ניתוח Carprofen (4 מ"ג / קילוגרם תת עורי) מוזרק כל שעה 24. במקום מדידת לחץ דם פולשנית לעשות שימוש במערכת לניטור לחץ דם לא פולשנית.
- להפסקת להזריק הרדמה להרגיז סוכנים תת עורי: נלוקסון (1.2 מ"ג / קילוגרם), flumazenil (0.5 מ"ג / קילוגרם) וatipamezole (2.5 מ"ג / קילוגרם).
- Extubate בעלי החיים.
- לאחר שהשיב את הרפלקסים של לשים את בעלי החיים לחדר שחומם מראש. לשמור על בעלי החיים בכ 32 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- בעלי חיים נבדקים באופן קבוע לנשימה ספונטנית ומצבו הכללי שלהם בשעות הראשונות שלאחר ניתוח. אם גזע המוח מושפע בעלי חי בעיות נשימה וצריכים להיות מורדמים.
- בעלי חיים נבדקים מדי יום על מצבו הכללי שלהם ומשקל גוף, כמו גם לגירעונות נוירולוגיות וחושיים 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמותה
ברגע שטכניקת הניתוח היא שולטת ההליך לא לעורר שום תמותה במהלך ניתוח. כמו כן דימום יכול להיות מושגת כמעט בכל בעלי החיים. תמותה לאחר ניתוח היא 30-40% עם רוב בעלי החיים מתים ביום 1 לאחר הניתוח (איור 5).
ICP ערכים לאחר SAH
ICP לפני הדימום הוא סביב 4 מ"מ כספית. דימום תוצאות בעלייה חדה של ICP עד 120 מ"מ כספית. ערכי ICP אז יתייצבו בתוך 5 דקות בכ 30 מ"מ כספית (איור 1). ב24 שעות לאחר דימום ICP הוא עדיין גבוה במקצת ל10 מ"מ כספית 5.
לחץ דם לאחר SAH
לחץ דם עולה באופן מיידי לאחר דימום אינדוקציה (איור 2). זאת בשל רפלקס קושינג, אשר יזם ICP גבוה.
זלוף מוחין אחרי אדון
Afאינדוקציה דימום ter ירידה דרמטית של זלוף מוחין יכולה להיות במעקב. Reperfusion לרמה אחרת בנפרד מתרחש בתוך 5 דקות לאחר העלבון (איור 3).
דם מפיץ יחד עורקי מוח אספקה וסדקים המוח הקטן
אנו perfused חיות 3 שעות לאחר SAH transcardially עם 20 מיליליטר של תמיסת מלח ואחריו 20 מיליליטר של 4% PFA המצוננים. המוח הוסר בזהירות והפצת דם בחלל תת עכבישי נצפתה. דם מפיץ יחד חלל perivascular של עורקי מוח אספקה אל הקליפה הגבי. בכל המקרים הדם extravasated כיסה את MCA עד ההסתעפות השנייה. Ipsilateral צד לדימום היה מכוסה בדם יותר מהאונה הנגדית (איור 4).
חלוקת דם אינה מתאם עם עליית ICP
ב5 חיות אנחנו בדקנו אם עלייתו של ד ICP uring אדון יש השפעה על חלוקת דם בחלל תת עכבישי. אחת השערות היו שבעלי חיים המראים רק עליית ICP מתונה במהלך SAH עלולים להפגין פחות דם extravasated, אשר לאחר מכן לא להפיץ לחלקי הגבי של קליפת המוח. מצאנו שנראה רק בגודל של שטף הדם בבסיס הגולגולת לתאם עם עליית ICP. חלוקת דם לאורך עורקי מוח אספקה לא הייתה שונה בין בעלי חיים עם ערכי שיא ICP שונים.
איור 1. ערך ICP אחרי ערכי SAH. נציג ICP של 5 בעלי חיים לאחר SAH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
pload/50845/50845fig2.jpg "width =" "/> 600px
איור 2. לחץ דם לאחר SAH. ערכי לחץ דם נציג של 5 בעלי חיים לאחר SAH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. זלוף מוחין אחרי אדון. ערכי נציג דופלר לייזר flowmeter של 5 בעלי חיים לאחר SAH. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. חלוקת דם לאורך עורקי מוח אספקה. נציג dist דםribution של 5 בעלי חיים לאחר SAH. קווים אדומים מצביעים על חלוקת דם לאורך עורקי מוח אספקה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. עקומת הישרדות לאחר עקומת אדון. ההישרדות הבאה אדון ב49 זכר עכברי C57BL / 6. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אפשרויות טיפול לאחר SAH נדירות ובעיקר inefficacious. לכן הפתופיזיולוגיה של נזק מוחי לאחר מדמם צריכה להיות מובנת נוסף על מנת לזהות מטרות טיפוליות חדשות ולפתח גישות טיפוליות חדשניות. טופל ומודלים של בעלי חיים גם לשחזור בבעלי חיים מהונדסים גנטי, עכברים כלומר, הם קריטיים לחקירות מסוג זה. מודל קואליציית הנשים לשלום הפך למודל בשימוש נרחב עבור אדון כפי שהוא דומה להפתופיזיולוגיה בבני האדם באופן הדוק, עם זאת, השימוש בו בעכברים הקשו על ידי שחזור נמוך ושונות בין אישית גבוהות. וריאציות של המודל נגרמות על ידי פרוטוקולי הרדמה שונים, אשר לשנות את התנאים פיסיולוגיים. כמות הדימום משתנה בין בעלי החיים עקב תגובה של כלי, לחץ דם והבדלי קרישה 12. לכן חשוב לעקוב אחר תנאים פיסיולוגיים בכל ההליך ולהקים פרוטוקולים כירורגית ומעקב המקטין את variability של מודל זה.
חלוקת דם לאחר SAH עשויה להיות שונה בין מינים. בדם מודל עכברים נראה שיחולקו באופן שווה על פני שני אונות המוח 6. כמוחות אנושיים להראות ארכיטקטורת gyrencephalic הדם עלול להפיץ בעיקר לאורך sulci המוח ולא בעיקר לאורך כלי דם. מצד השני, עורקי מוח אספקה מנוהלים בsulci אלה למשל MCA במענית לרוחב. כך פתולוגיות כלי עשויות להיות דומות במודלים של בעלי חיים מכרסמים והמוח האנושי.
במעבדה שלנו אנו משתמשים בשילוב של פנטניל, medetomidine וmidazolam כפי שתואר לעיל עבור הרדמה כירורגית. שילוב זה יש השפעה קטנה יחסית על לחץ דם ותגובתיות כלי 11. לעומת זאת, isoflurane, הרדמה בשימוש נרחבת במחקר SAH, מובילה להרחבת כלי דם היקפי, autoregulation המוחי פגע פגיעה הקשה ב13, ולחץ דם נמוך באופן מיידי ומאחוראה 12 אדון, ממצאים שאינם משויכים באופן קבוע עם הפתופיזיולוגיה המוקדמת של אדון בבני אדם. לפיכך, השימוש בפרוטוקול הרדמה שלא מפריע הפתופיזיולוגיה פוסט מדממת הוא תנאי חשוב למודל אדון ניסיוני בתוקף.
כמות הדימום תלויה בנגע הכלי ולכן משתנה עם גודל נימה 14. עוד צעד חשוב של המודל הוא הנסיגה של חוט הלהט אחרי ניקוב כלי שיט. זרימת דם בICA מופרת על ידי חוט הלהט ונסיגה התעכבה עלולה לגרום לדימומים קטנים יותר. בהתאם לכך, זה הכרחי כדי לתקנן את הזמן בין ניקוב כלי ונסיגת נימה. זה כמובן אפשרי רק אם נקודת ניקוב כלי הזמן ניתן לקבוע בדייקנות גבוהה זמנית. בהתקנה שלנו זו מושגת על ידי מדידה רציפה של ICP. עלייה חדה בICP מציינת ניקוב כלי מוצלח ומאפשרת על ידי כך standardization של נסיגת נימה ועוצמה ומכאן דימום. בנוסף, ניקוב כלי שליטת ICP מונע שהנימה היא מתקדמת יותר מדי ובכך למנוע נזק לרקמות מוח. בהתאם לכך, מדידת ICP מתמשכת היא טכניקה מצוינת כדי למזער את השונות של מודל אדון העכברי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחקר הנוכחי ממומן על ידי קרן מחקר Solorz-זק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
