Summary
ウィリス穿孔の管腔内サークルによるくも膜下出血の標準化されたマウスモデルが記載されている。血管穿孔やくも膜下出血は頭蓋内圧監視によって監視されています。さらに、種々の重要なパラメータが記録され、生理学的条件を維持するように制御される。
Abstract
このビデオ公報にくも膜下出血（SAH）の標準化されたマウスモデルが提示されている。出血はウィリス穿孔（CWP）の血管内円で誘導され、頭蓋内圧（ICP）モニタリングによって証明されています。それによって動脈循環を取り囲むくも膜下スペースおよび小脳における亀裂均質な血液分布が達成される。体温、全身血圧、心拍数、およびヘモグロビン飽和度：動物生理学に挿管、機械的人工換気、及び種々の生理学的および心臓血管のパラメータの連続オンラインモニタリングによって維持される。それにより脳潅流圧が密に血管外遊出した血液の少ない可変容積をもたらすモニターすることができる。これは、マウスの血管内フィラメント穿孔のよりよい標準化を可能にし、モデル全体が高度に再現可能になります。したがって、野生型および遺伝での薬理学的および病態生理学的研究のために容易に利用可能であるLYマウスを変えた。
Introduction
SAHは、患者のための少なくとも有益な結果とストロークサブタイプである：患者の40％が出血1ヶ月後以内に死亡し、生存者はほとんど臨床的に良好な治療成績を持っていません。
自発SAHs（80％）の大部分は、主に動脈、脳底動脈および中大脳動脈（MCA）2を通信する前方および後方に沿って配置され、頭蓋内動脈瘤の破裂によって引き起こされる。
このような動脈瘤は、動物でモデル化することが困難であるため、SAHの動物モデルは、どちらかクモ膜下腔/脳室へ、またはくも膜下血管の血管内穿孔により血液の注射によって実施されています。
血液量が直接3を制御することができるように、大槽内へmagnaの自己血注入を行うことが容易で、再現可能である。残念ながら、SAHの病態生理のいくつかの側面には、 例えば血管損傷は、この手順によってモデル化することができない。 SAHの誘導のための別の技術的なアプローチは、槽内の静脈4の開口部である。
しかし、MCA支店で管腔内CWP、モデル、ヒトの病態生理最も密接5の手順であるように思われる。この方法は、Veelkenや同僚6,7によってBedersonらが、同時に開発され、最初のラットに記載されている。後で腔内穿孔モデルはマウス8,9に適合させた。フィラメントは、外頚動脈（ECA）に挿入し、内頸動脈（ICA）を介して頭蓋底に進む。 MCAの分岐点で、フィラメントは、血管を穿孔し、頭蓋底でクモ膜下腔への出血を誘発する。その後、血液は亀裂や血管に沿って残りのくも膜下空間内に分配する。出血は穿孔部位での血栓形成により停止したが、rebleedings、WHさICH、患者10にしばしば有害で発生する可能性があります。したがって、血管内のフィラメントモデルは、過去数年の間に広く使用されているSAHモデルとなりました。フィラメント穿孔モデルの最も頻繁に言及欠点は、出血量を直接制御することができず、従って、可変であり得ることである。この可変性は著しく動物生理学および後出血ICPを厳密に制御することによって低減することができる。
マウスは遺伝的に改変された株の大多数が利用可能であるという大きな利点を有する。しかしながら、それらの小さいサイズのために外科的処置は、より大きな種、 例えばラットまたはウサギにおけるよりも複雑になる傾向がある。従ってマウスにラットのために開発された技術の微細化は、しばしば、マウスは非常に限られた体重および血液量、血圧および血液ガス分析のための、並びにヘモグロビン飽和度と心拍数を監視するための非侵襲的な技術を持っている、例えば 、所望の結果をもたらさない可能な限り適用しなければならない。したがって、現在の出版物の目的は、マウスにおけるSAH用フィラメントミシンモデルを記述するために、このモデルは、標準化された再現性の高い方法で行うことができる方法を示すことです。
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Protocol
すべての外科的処置は、倫理審査を受け、バイエルンの政府によって承認された（参照番号：55.2-1-54-2532.3-13-13と-2532-136-11）。動物は、約25gの体重の雄C57BL / 6マウスである。
1。動物の準備
- チャンバー内にマウスを置くことによって麻酔を誘導する。動物が意識を失うまで、5％イソフルランでチャンバーをフラッシュします。
- 腹腔内に予混合麻酔薬を注入：フェンタニル（0.05 mg / kg）を、ミダゾラム（5 mg / kg）をし、メデトミジン（0.5 mg / kg）を。手順の間に前と定期的に反射神経をチェックしてください。麻酔を維持するために時間ごとに初期量の3分の1を再注入。
- 20 Gの静脈カテーテル11から作られたチューブを挿管orotracheally。挿管のために、曲がったピンセットで舌を引っ込める手術用顕微鏡下に声帯を視覚化し、気管にチューブを挿入し、傾斜プラットフォーム（30°）で動物を修正吸気時。
- 腹臥位でマウスを置き、木綿のピースまたはmicrocapnographでチューブの正しい配置を確認してください。
- 呼吸器への挿管チューブを接続します。 180〜220回/分であり、200〜250μLの拍出量の周波数で25％の酸素を補給し室内空気とマウスを換気する。
- microcapnographに挿管チューブを接続します。換気回数を調整することにより、30 mmHgので呼気終末PCO 2を維持する。
- 直腸温度プローブを挿入し、37℃の中核体温を維持するために、加熱パッド上に動物を置く。
- 右後肢に環状pulsoximeterセンサーを適用します。
- はさみで頭蓋骨の上の皮膚を開きます。切開は約0.5cm、長と耳と目の間でなければなりません。
- 頭骨のメスで、左側頭筋を解剖。
- レーザードップラー流量計（LDF）プローブにのり左頭骨。接着剤が硬化するまで固定位置にプローブを保持する。
- 左側頭骨に歯科用ドリルで約1.5ミリメートル径の穴を開けます。熱損傷を防止するために、生理食塩水で骨を冷却する。
- 頭蓋腔へのICPプローブを挿入します。脳組織の損傷や出血を防ぐために、背側に可能な限り進めて。
- プローブが正しい位置にあれば、修正し、セメントでそれを封印。 5分間のセメント乾燥させる。
- 仰臥位に慎重に、マウスの電源を入れます。
- 連続血圧監視のために、左大腿動脈カテーテルを挿入。
- 血圧監視装置に大腿カテーテルを接続します。
2。 SAH誘導
- あご（2 CM）への胸骨からハサミで皮膚を開きます。ぶっきらぼうに結合組織を解剖し、脇に唾液腺を押してください。
- 左総頸動脈（CCA）を露出し、それを動員する。守るCCAと同じ結合組織鞘で実行される迷走神経、。頭蓋移動して、同じテクニックを使用してICAとECAを公開し、動員する。
- 限り頭側できるだけECAを結紮。
- ECAの周りのフィラメントのための2以上のライゲーションを予定する。
- マイクロクリップで一時的にCCAとICAを塞ぐ。マイクロクリップアプリケーター付きマイクロクリップを配置します。クリップはそっとそれらを引き戻すことで正しく適用されていることを確認します。
- 血管はさみでECAにフィラメントを挿入するための穴をカット。
- ECAに12ミリメートルの長さとプロレン5-0フィラメントを挿入します。
- 1事前に決められたライゲーションで挿入部位を閉じます。
- CCAとICAからマイクロクリップアプリケーターをマイクロクリップを削除します。
- ICPは上昇するまで、ICAに鉗子でフィラメントを進める。 ICPの急激な上昇は、出血の誘導を示している。
- すぐにフィラメントを撤回し、PRの両方を閉じることでECAを結紮連続earrangedライゲーション。これは挿入部位からの出血防止します。
- 皮膚創傷を縫合。
- さらに20分間、動物の生理的パラメータを監視する。
- ICPおよびLDFプローブを除去し、皮膚創傷を縫合。
3。実験終了
- PBS内の20mlの4％PFA（4°C）、続いて食塩水（室温）20mlを経た動物を灌流。
- 頭蓋骨から脳を解剖。正中線に軌道空洞間頭蓋骨を切った。そして、脳から骨をはがします。
- クモ膜下腔の血分布を評価。
4。サバイバル手術の場合の考慮事項（ビデオで示されていない）
- 直接麻酔導入後の術後鎮痛のためにカルプロフェン（4 mg / kgを皮下投与）を注入。術後観察期間中カルプロフェン（4 mg / kgを皮下投与）24時間毎に注入される。 代わりに侵襲的な血圧測定の非観血血圧モニタリングシステムを利用する。
- 皮下に薬を拮抗麻酔注入の終了のため：ナロキソン（1.2 mg / kg）を、フルマゼニル（0.5 mg / kg）をし、アチパメゾール（2.5 mg / kg）を。
- 動物を抜管。
- 反射の回復後に予熱したチャンバー内に動物を入れる。 24時間、約32℃で動物を保管してください。
- 動物は、手術後の最初の数時間の間に自発呼吸とその全身状態を定期的にチェックされます。脳幹が影響を受ける場合の動物が問題を呼吸しているし、安楽死させなければならない。
- 動物は、その一般的な状態や体重のためだけでなく、神経学的および感覚欠損15を毎日チェックされます。
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Representative Results
死亡
手術技術を習得したら手順は任意の術中死亡率を誘発しない。また、出血は、実質的に全ての動物において達成することができる。術後の死亡率は、ほとんどの動物が手術後（ 図5）1日目に死んで百分の30から40までです。
ICPはSAH後の値
出血の前に、ICPは約4 mmHgである。 120 mmHgの、最大のICPの急激な増加をもたらす出血。 ICP値は、次いで、約5分以内に30 mmHgの（ 図1）を安定させる。 24時間後に、ICP、出血した後も、わずかに10 mmHgの5まで上昇させる。
SAH後の血圧
血圧は直ちに誘導（ 図2）、出血後に上昇する。これは上昇し、ICPによって開始され、クッシング反射、に起因している。
SAH後の脳灌流
AFター出血の誘導は、脳灌流の劇的な減少をモニターすることができる。個別に異なるレベルに再灌流を侮辱します（ 図3）の後5分以内に発生します。
血液は、脳に供給する動脈および小脳割れ目に沿って分配し
私たちは、チルドを4％PFAの20ミリリットルが続くの生理食塩水20ミリリットルで経SAH後の動物を3時間後に灌流した。脳を慎重に除去し、くも膜下空間における血液分布が観察された。血液は背側皮質に向かって脳供給する動脈の血管周囲の空間に沿って配布しています。すべての場合において、溢血は、第二の分岐までのMCAをカバーした。出血側同側は半球（ 図4）よりも多くの血で覆われていた。
血液分布は、ICPの上昇と相関しない
5匹の動物では、ICP Dの台頭かどうかを調べた uring SAHはクモ膜下腔における血液分布に影響を与えます。 1つの仮説は、SAHの間には中程度のICPの上昇を示している動物は、その後皮質の背の部分に配布しません少ない溢血を呈するかもしれないということでした。私たちは、頭蓋底の血腫のサイズのみが、ICPの上昇と相関するようであることがわかった。脳供給する動脈に沿って、血液の分布が異なるのICPピーク値と動物の間に差は認められなかった。
図1。 SAH後の5匹の動物のSAH。代表のICP値の後、ICP値 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。 SAH後の血圧。SAH後の5匹の動物の代表的な血圧値。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 SAH後の脳灌流。5匹の動物の代表的なレーザードップラー流量計の値SAH後。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。脳供給する動脈に沿って血液分布。代表血液DISTSAH後の5匹の動物ribution。赤い線は、脳に供給する動脈に沿って血液分布を示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。 49オスのC57BL / 6マウスにおけるSAH以下SAH。生存曲線後の生存曲線は 。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
SAH後の治療の選択肢が乏しいと、ほとんど効果のないです。したがって、ポスト出血性脳損傷の病態生理学は、更に、新たな治療標的を同定し、新規な治療アプローチを開発するために理解する必要がある。標準化された遺伝子改変動物、 すなわちマウス、でよく再現可能な動物モデルは、そのような調査のために重要である。それは密接にヒトでの病態生理に似ているようにCWPモデルは、SAHのために広く使用されているモデルとなっているが、マウスでのその使用は、低再現性の高い対人変動によって妨げられる。モデルのバリエーションは、生理的な条件を変更するさまざまな麻酔プロトコルによって引き起こされます。出血量は、血管反応性、血圧および凝固の違い12匹の動物の間で変化する。したがって、手順全体を通して生理的状態を監視するおよびVAを低減外科用および監視プロトコルを確立することが重要であるこのモデルのriability。
SAH後の血液分布は、種間で異なっていてもよい。ラットモデルの血液中に等しく両方の大脳半球6全体に分散しているように見える。人間の脳は皺脳のアーキテクチャを示しているように、血液は、主に脳の脳溝に沿ってではなく、主に血管に沿って配布する可能性が高い。一方、これらの脳溝で実行脳供給する動脈は、横方向の溝でMCAを例えば 。このように、血管の病変は、齧歯類動物モデルおよび人間の脳が似ているかもしれません。
外科麻酔のため、上記のよう私たちの研究室では、フェンタニル、メデトミジンとミダゾラムの組み合わせを使用します。この組み合わせは、血圧と血管反応性11に対して比較的小さな効果を有する。これとは対照的に、イソフルラン、SAH研究において広く使用されている麻酔薬は、末梢血管拡張につながる深刻な脳自動調節13、および低血圧、すぐ後方に障害ER SAH 12、定期的にヒトでのSAHの早期病態生理と関連していない調査結果。そのため、後の出血性病態生理を妨げない麻酔プロトコルの使用は、有効な実験的SAHモデルのための重要な前提条件である。
出血量は、血管病変に依存し、フィラメントのサイズ14で、したがって変化します。モデルの別の重要なステップは、血管穿孔後のフィラメントの撤退です。 ICAの血流がフィラメントによって破壊され、遅れて撤退は小さい出血する可能性があります。したがって、血管穿孔およびフィラメント離脱の間の時間を標準化することが重要である。血管穿孔の時点が高い時間精度で決定することができる場合、これは当然にのみ可能である。我々のセットアップでは、これは、ICPの連続測定することによって達成される。 ICPの急激な増加は、成功した血管の穿孔を示し、それによってstandardizatioを可能にするフィラメントの撤退、したがって、出血強度のN。また、ICP-制御血管穿孔、フィラメントが離れすぎて、それにより、脳組織の損傷を防止する前進することを防止する。したがって、継続的なICP測定は、マウスSAHモデルのばらつきを最小限にするための優れた手法である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
現在の研究はSolorz - ザック研究財団によって資金を供給される。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
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