Summary
En standardisert mus modell av subaraknoidalblødning ved intraluminal Circle of Willis perforering er beskrevet. Vessel perforering og subaraknoidal blødning overvåkes av intrakranielle trykkovervåking. I tillegg er en rekke viktige parametere registreres og kontrolleres for å opprettholde fysiologiske betingelser.
Abstract
I denne videoen publikasjonen en standardisert musemodell for subaraknoidalblødning (SAH) er presentert. Blødninger er indusert av endovaskulær Circle of Willis perforasjon (CWP) og utprøvd av intrakranielt trykk (ICP) overvåking. Derved en homogen fordeling blod i subaraknoidal mellomrom omgir den arterielle sirkulasjon og cerebellare sprekker er oppnådd. Animal fysiologi blir vedlikeholdt av intubasjon, mekanisk ventilasjon, og kontinuerlig on-line overvåking av ulike fysiologiske og kardiovaskulære parametere: kroppstemperatur, systemisk blodtrykk, puls, og hemoglobinmetning. Derved cerebral perfusjon trykket kan overvåkes tett som resulterer i en mindre variabel volum av extravasated blod. Dette gir en bedre standardisering av endovaskulær filament perforasjon i mus og gjør hele modellen reproduserbar. Det er derfor lett tilgjengelig for farmakologiske og patofysiologiske studier i villtype-og genetiskly endret mus.
Introduction
SAH er slaget subtype med minst gunstig utfall for pasienter: 40% av pasientene dør innen en måned etter at blødningen en og overlevende sjelden har en klinisk gunstig utfall.
Det store flertallet av spontane SAHS (80%) er forårsaket av ruptur av intrakranielle aneurismer som stort sett ligger langs fremre og bakre kommunisere arterie, den basilaris arterien, og midten cerebral arterie (MCA) 2.
Slike aneurismer er vanskelige å modellere i dyr og derfor dyremodeller av SAH er enten utført ved injeksjon av blod inn i de subaraknoidal plass / cerebral ventrikkel eller ved endovaskulær perforering av en subarachnoid fartøy.
Autolog blod injeksjon i cisterna magna er enkel å utføre og reproduserbar som blodvolum kan være direkte styrt 3.. Dessverre er det noen aspekter ved SAH patofysiologi, f.eks denskade fartøyet, kan modelleres ved denne fremgangsmåten. En annen teknisk tilnærming for induksjon av SAH er åpningen av en intracisternal vene fire.
Imidlertid intraluminal CWP ved MCA grenen synes å være den fremgangsmåte som modellerer patofysiologi hos mennesker tettest 5. Metoden ble utviklet og først beskrevet i rotter ved Bederson og kolleger, og på samme tid ved Veelken og kolleger 6,7. Senere intraluminale perforering modellen ble tilpasset mus 8,9. En glødetråd settes inn i den eksterne carotisar (ECA), og avanserte til skallebasis via den interne carotisar (ICA). Ved forgreningspunktet av MCA filamentet perforerer beholderen og induserer en blødning inn i den subarachnoid plass ved skallebasis. Blodet deretter distribueres inn i den gjenværende subaraknoidal plass langs sprekker og blodkar. Blødninger er stoppet av dannelse av blodpropper på stedet av perforasjon, men rebleedings, which ofte er skadelig for pasienter 10 kan oppstå. Følgelig ble den endovaskulære filament modellen en mye brukt SAH modell i løpet av de siste årene. Den hyppigst nevnte ulempe av filamentet perforering modellen er at blødning volum ikke direkte kan kontrolleres og kan derfor være variabel. Denne variasjonen kan betydelig reduseres med streng kontroll av dyrefysiologi og post-hemoragisk ICP.
Mus har den store fordel at et stort antall genetisk modifiserte stammer er tilgjengelige. Imidlertid, på grunn av deres lille størrelse kirurgiske prosedyrer en tendens til å være mer komplisert enn i større arter, f.eks rotter eller kaniner. Derfor nedskalering av teknikker utviklet for rotter til mus ofte ikke fører til de ønskede resultater, for eksempel som mus har en svært begrenset kroppsvekt og blodvolum-invasiv teknikker for blodtrykket og blodgassanalyse samt for hemoglobin metning og pulsmålingmå brukes når det er mulig. Følgelig er formålet med den aktuelle publikasjon å beskrive fila perforering modell for SAH i mus, og for å vise hvordan denne modellen kan bli utført på en standardisert og reproduserbar måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske prosedyrer ble utsatt for etisk vurdering og godkjent av regjeringen i Øvre Bayern (referansenummer: 55.2-1-54-2532.3-13-13 og -2532-136-11). Dyr er mannlige C57BL / 6 mus med en kroppsvekt på ca 25 g.
En. Animal Forberedelse
- Indusere anestesi ved å plassere musen i et kammer. Skyll kammer med 5% isofluran inntil dyret mister bevisstheten.
- Injiser forhåndsblandede anestetika intraperitonealt: fentanyl (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) og medetomidin (0,5 mg / kg). Sjekk reflekser før og jevnlig under prosedyren. Reinjisere en tredjedel av den opprinnelige mengde hver time for å opprettholde anestesi.
- Intubere orotracheally med et rør laget av en 20 G venekateter 11.. For intubasjon fikse dyret på en skråstilt plattform (30 °), dra inn tungen med bøyde tang, visualisere stemmebåndene under en operasjon mikroskop og sett slangen inn i luftrøretunder inspirasjon.
- Plasser musen i en utsatt posisjon og kontroller riktig plassering av røret med et stykke av bomull eller en microcapnograph.
- Koble intubasjon røret til respirator. Ventiler musen med romluft supplert med 25% oksygen med en frekvens på 180-220 åndedrag / min og et slagvolum på 200-250 mL.
- Koble intubasjon røret til microcapnograph. Opprettholde ende-ekspiratorisk pCO 2 på 30 mmHg ved å justere ventilasjonen frekvens.
- Sett i en rektal temperaturprobe og plasserer dyret i en varmepute for å opprettholde 37 ° C kjernetemperatur.
- Påfør den ringformede pulsoximeter sensoren på høyre bakpote.
- Åpne huden over skallen med en saks. Snittet bør være omtrent 0,5 cm lang og mellom øre og øye.
- Dissekere venstre tinningmuskelen med en skalpell fra tinningbenet.
- Lim laser Doppler strømningsmåler (LDF) sonde påvenstre tinningbenet. Hold sonden i en fast stilling inntil limet herdner.
- Bor et hull på ca 1,5 mm diameter med en tannlege drill inn i venstre tinningbenet. Avkjøl benet med saltvann for å unngå varmeskader.
- Sett ICP sonde i kraniet. Presse frem som dorsally som mulig for å hindre hjernevevet skader og blødninger.
- Dersom sonden er på rett plass, fikse, og forsegle den med sement. La sementen tørke i 5 min.
- Snu musen nøye til en liggende stilling.
- For kontinuerlig blodtrykksmåling, kateter venstre lårarterie.
- Koble femoral kateter til blodtrykksmåling enhet.
2. SAH Induksjon
- Åpne huden med en saks fra sternum til haken (2 cm). Dissekere bindevev rett ut og presse spyttkjertlene til side.
- Utsett venstre halspulsåren (CCA) og mobilisere det. Bevarvagal nerve, som går i samme bindevev slire som CCA. Flytt kranie og avsløre og mobilisere ICA og ECA bruker samme teknikk.
- Ligere ECA så langt kranialt som mulig.
- Prearrange to flere ligations for glødetråden rundt ECA.
- Okkluderer CCA og ICA midlertidig med microclips. Plasser microclips med en microclip applikator. Pass på at klippene er brukt riktig ved å forsiktig trekke dem tilbake.
- Skjær et hull for filament innsetting i ECA med et fartøy saks.
- Sett inn en prolene 5-0 filament med 12 mm lengde inn i ECA.
- Lukk innstikkstedet med en avtalt ligation.
- Fjern microclips med en microclip applikatoren fra CCA og ICA.
- Advance filament med en tang inn i ICA til ICP stiger. En plutselig økning av ICP indikerer blødning induksjon.
- Trekk filament umiddelbart og ligate ECA ved å lukke både prearranged ligations fortløpende. Dette hindrer uttrengning av innsettingsstedet.
- Sutur huden sår.
- Overvåk de fysiologiske parametere av dyret i et annet 20 min.
- Fjern ICP og LDF prober og sy huden sår.
Tre. End of Experiment
- Perfuse dyret transcardially med 20 ml saltløsning (romtemperatur) etterfulgt av 20 ml 4% PFA i PBS (4 ° C).
- Dissekere hjernen ut av skallen. Skjær skallen i midtlinjen og mellom orbital hulrom. Deretter skrelle benet fra hjernen.
- Vurdere fordelingen blod i subaraknoidalrommet.
4. Hensyn i Case of Survival Surgery (ikke vist i videoen)
- Injisere Carprofen (4 mg / kg subkutant) for postoperativ smertelindring direkte etter anestesi induksjon. I løpet av den postoperative observasjonsperioden carprofen (4 mg / kg subkutant) blir injisert hver 24. time. I stedet for invasiv blodtrykksmåling gjøre bruk av en ikke-invasiv blodtrykksmåling system.
- For avslutning av anestesi injisere antagonisering midler subkutant: nalokson (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) og atipamezol (2,5 mg / kg).
- Extubate dyret.
- Etter gjenvinne av reflekser sette dyret inn i en forvarmet kammer. Hold dyret ved ca 32 ° C i 24 timer.
- Dyr blir sjekket jevnlig for spontan pusting og deres generelle tilstand i løpet av de første timene etter operasjonen. Hvis hjernestammen påvirkes dyr har pusteproblemer og bør avlives.
- Dyrene kontrolleres daglig for deres generelle tilstand og kroppsvekt, så vel som for nevrologiske og sensoriske mangler 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dødelighet
Når operasjonen teknikken er mestret prosedyren ikke framprovosere noen intraoperativ mortalitet. Også blødning kan oppnås i praktisk talt alle dyr. Postoperativ dødelighet er 30-40% med de fleste dyr dør på dag 1 etter operasjonen (figur 5).
ICP verdier etter SAH
ICP før blødning er rundt 4 mmHg. Blødning resultater i en kraftig økning av ICP opp til 120 mmHg. ICP-verdier og deretter stabilisere seg i løpet av 5 minutter ved omtrent 30 mmHg (figur 1). På 24 timer etter blødning ICP er fortsatt litt forhøyet til 10 mmHg fem.
Blodtrykk etter SAH
Blodtrykket stiger umiddelbart etter blødning induksjon (figur 2). Dette er på grunn av Cushing refleks, som er initiert ved forhøyet ICP.
Cerebral perfusjon etter SAH
After blødning induksjon en dramatisk reduksjon av cerebral perfusjon kan overvåkes. Reperfusjon til et individuelt forskjellig nivå forekommer innen 5 minutter etter at fornærmelse (figur 3).
Blood distribuerer sammen hjerne forsyne arterier og lillehjernen sprekker
Vi perfundert dyr 3 hr etter SAH transcardially med 20 ml saltoppløsning, etterfulgt av 20 ml kald 4% PFA. Hjernen ble forsiktig fjernet og distribusjon blod i subarachnoid mellomrom ble observert. Blood distribuerer langs perivascular plass av hjerne forsyne arterier mot rygg cortex. I alle tilfeller skal ekstravasert blod dekket MCA opp til den andre forgrening. Den siden ipsilaterale til blødning var dekket med mer blod enn den kontralaterale hemisfære (figur 4).
Blood distribusjon ikke korrelerer med ICP stige
I fem dyr undersøkte vi om fremveksten av ICP d uring SAH har en innvirkning på fordelingen blod i subaraknoidalrommet. En hypotese var at dyr som viser bare en moderat ICP stige i løpet av SAH kan vise mindre extravasated blod, som deretter ikke distribuerer til dorsal deler av hjernebarken. Vi har funnet at kun størrelsen av hematom på skallebasis synes å korrelere med ICP økningen. Blood fordeling langs hjernen forsyne arteriene var ikke forskjellig mellom dyr med ulike ICP toppverdier.
Figur 1. ICP verdi etter subaraknoidalblødning. Representant ICP verdier på 5 dyr etter subaraknoidalblødning. Klikk her for å se større bilde .
pload/50845/50845fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Blodtrykk etter subaraknoidalblødning. Representative blodtrykk verdier av fem dyr etter subaraknoidalblødning. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Cerebral perfusjon etter subaraknoidalblødning. Representative laser Doppler strømningsmålerverdier av fem dyr etter subaraknoidalblødning. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Blood fordeling langs hjerne forsyne arterier. Representant blod distribution av fem dyr etter subaraknoidalblødning. Røde linjene indikerer blod fordeling langs hjerne forsyne arterier. Klikk her for å se større bilde .
Figur 5. Survival kurve etter subaraknoidalblødning. Survival kurve etter SAH i 49 mannlige C57BL / 6 mus. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandlingstilbud etter subaraknoidalblødning er knappe og det meste inefficacious. Derfor patofysiologien ved post-hemoragisk hjerneskade må videre forstås for å identifisere nye terapeutiske mål og utvikle nye terapeutiske tilnærminger. Standardisert og godt reproduserbare dyremodeller i genmodifiserte dyr, dvs. mus, er avgjørende for slike undersøkelser. Den CWP-modellen har blitt en mye brukt modell for SAH som den ligner patofysiologien hos mennesker tett, men er dens bruk i mus hemmet av lav reproduserbarhet og en høy menneskelig variabilitet. Variasjoner av modellen er forårsaket av forskjellige bedøvelsesprotokoller, som endrer fysiologiske betingelser. Mengden av blødning varierer mellom dyr på grunn av fartøyets reaktivitet, blodtrykk og koagulasjon forskjeller 12. Således er det viktig å overvåke fysiologiske betingelser gjennom hele fremgangsmåten, og for å etablere kirurgiske og overvåknings protokoller som reduserer variability av denne modellen.
Blood fordeling etter subaraknoidalblødning kan være forskjellig mellom artene. I rottemodellen blod ser ut til å være likt fordelt på begge cerebrale hemisfærer seks. Som menneskehjerner viser en gyrencephalic arkitektur blodet er sannsynlig å distribuere hovedsakelig langs hjernen sulci og ikke først og fremst langs fartøy. På den annen side, hjerne forsyne arterier løper i de sulci f.eks MCA i lateral sulcus. Dermed fartøy patologi kan være lik i gnager dyremodeller og den menneskelige hjerne.
I vårt laboratorium benyttes en kombinasjon av fentanyl, medetomidin og midazolam som beskrevet ovenfor for kirurgisk anestesi. Denne kombinasjonen har en relativt liten effekt på blodtrykket og fartøy 11. reaktivitet. I kontrast, isofluran, et mye brukt bedøvelse i SAH forskning, fører til perifer vasodilatasjon, alvorlig nedsatt cerebral autoregulation 13, og lavt blodtrykk umiddelbart aktereh SAH 12 funn som ikke er regelmessig forbundet med tidlig patofysiologien av SAH i mennesker. Derfor er bruken av en bedøvelse protokoll som ikke forstyrrer etter hemoragisk patofysiologien en viktig forutsetning for en gyldig SAH eksperimentell modell.
Mengden av blødning er avhengig av fartøyets lesjon og varierer derfor med filamentstørrelse 14.. Et annet viktig skritt i modellen er tilbaketrekking av glødetråden etter fartøy perforering. Blodstrømmen i ICA blir forstyrret av filament og en forsinket utbetaling kan resultere i mindre blødninger. Følgelig er det viktig å standardisere tiden mellom fartøyet perforering og filamenttrekning. Dette er naturligvis bare mulig når tidspunktet for fartøy perforering kan bestemmes med høy tidsmessig presisjon. I vårt oppsett dette oppnås ved kontinuerlig måling av ICP. En kraftig økning i ICP indikerer vellykket fartøy perforering og tillater dermed standardization av filament trekning og dermed blødning intensitet. I tillegg hindrer ICP-styrt fartøy perforering at filamentet er avansert for langt og dermed hindre hjernevev skade. Følgelig er kontinuerlig måling ICP en utmerket metode for å minimalisere variasjonen av det murine SAH-modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Den aktuelle forskningen er finansiert av Solorz-Zak Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
