Summary
O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.
Abstract
Células satélites musculares são uma população de células-tronco necessárias para o desenvolvimento muscular esquelética pós-natal e da regeneração, sendo responsável por 2-5% dos núcleos sublaminal nas fibras musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso. Após lesão, no entanto, as células satélites iniciar a proliferação celular para produzir os mioblastos, as suas progênies, para mediar a regeneração dos músculos. O transplante de mioblastos derivados de células-satélite tem sido amplamente estudada como uma possível terapia para várias doenças regenerativas incluindo distrofia muscular, insuficiência cardíaca e disfunção urológica. O transplante de mioblastos em Latossolo músculo esquelético, coração infartado, e disfuncionamento ductos urinários mostrou que mioblastos enxertados podem se diferenciar em fibras musculares nos tecidos do hospedeiro e apresentar melhora funcional parcial nestas doenças. Portanto, o desenvolvimento de métodos de purificação eficiente de células satélites quiescentes de muscl esqueléticoe, assim como o estabelecimento de culturas de células derivadas de mioblastos de satélite e métodos de transplante de mioblastos, são essenciais para a compreensão dos mecanismos moleculares por trás de células auto-renovação satélite, ativação e diferenciação. Além disso, o desenvolvimento de terapias à base de células para a distrofia muscular e outras doenças regenerativos são também dependentes desses factores.
No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem o uso de caras activada por fluorescência (FACS) de células máquinas. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético por dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Estes recém-isoladascélulas satélites quiescentes ou ex vivo mioblastos expandidas podem ser transplantadas em cardiotoxina (CTX) induzida por rato em regeneração do músculo esquelético para examinar a contribuição de células derivadas do dador para a regeneração das fibras musculares, bem como para compartimentos celulares por satélite para o exame da auto-renovação actividades.
Introduction
Células satélites musculares são uma pequena população de células-tronco miogênicas localizadas abaixo da lâmina basal das fibras musculares esqueléticas. Eles são caracterizados pela expressão de Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina de 1-3. Células satélites têm provado ser responsável para a regeneração muscular, as células-tronco musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso 4-8. Após lesão, as células satélites são ativadas, iniciar expressão de MyoD e entrar no ciclo celular para expandir a sua descendência, chamadas de células precursoras miogênicas ou mioblastos 3. Depois de vários ciclos de divisão celular, mioblastos sair do ciclo celular e fusível para o outro, a fim de sofrerem diferenciação em miotubos multi-nucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Mioblastos isolados de músculo adulto pode facilmente ser expandidas ex vivo. A capacidade para mioblastos para tornar as fibras musculares na regeneração muscular eformar fibras musculares ectópica em tecidos nonmuscle é explorada por transplante de mioblastos, uma aproximação terapêutica potencial para a distrofia muscular de Duchenne (DMD), 4, disfunção urológica 9, e a insuficiência cardíaca 10. Com efeito, os mioblastos foram transplantadas com sucesso no músculo de ambos mdx (modelo DMD) e ratos doentes DMD 11-14. Os mioblastos normais injectados fundir com as fibras musculares de acolhimento para melhorar a histologia e função do músculo doente. Trabalhos anteriores demonstraram que subpopulações de mioblastos são mais células-tronco semelhantes e permanecem em um estado indiferenciado mais no músculo durante a regeneração muscular 5. Trabalhos recentes mostraram que as células satélites recém-isoladas de músculo adulto conter uma população de células-tronco como que exibe o enxerto mais eficiente e atividade auto-renovação na regeneração muscular 5-8. Portanto, a purificação de uma população pura de células satélites quiescentes de mu esquelético adultoesclerose é essencial para compreender a biologia de células satélites, mioblastos e regeneração muscular, e para o desenvolvimento de terapias baseadas em células.
No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem a utilização de um activado por fluorescência celular separação caro (FACS) da máquina 1,2,6-8. Além disso, a exposição ao laser FACS tende a induzir a morte celular durante a separação, o que faz com que o rendimento mais baixo de células quiescentes de satélite 15. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético. Este método utiliza dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Mostramos também que a injeção intramuscular dessas células satélites quiescentes recém-isoladas ou ex vimioblastos vo expandidos podem ser transplantadas para cardiotoxina (CTX) induzida regeneração do músculo esquelético do rato para examinar a contribuição de células derivadas de doadores para regenerar as fibras musculares, bem como para os compartimentos de células satélites para o exame de atividades de auto-renovação.
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Protocol
Os animais foram alojados em um ambiente SPF e foram monitorados pela pesquisa Recursos Animais (RAR), da Universidade de Minnesota. . Os animais foram sacrificados através de meios adequados (CO 2 inalação ou injecção de KCl, após ter sido anestesiados com injecção IP de Avertin (250 mg / kg) Todos os protocolos foram aprovados pelo Animal Care and Use Committee 'da Institucional (IACUC, Número Código: 1304-30.492 ) da Universidade de Minnesota.
1. Isolamento de células mononucleares de Rato Músculo Esquelético
- Devidamente sacrificar um ou dois ratos adultos jovens (3-8 semanas).
- Aperte e cortou a pele do abdômen com uma tesoura afiada. Retire a pele para mostrar completamente tríceps e musculatura dos membros posteriores (puxar a pele em direções opostas).
- Remova todos os músculos das pernas esqueléticas (tibial anterior, gastrocnêmio e quadríceps) e tríceps ao longo dos ossos com uma tesoura. Em seguida, transferir os músculos para gelado, PBS estéril numa placa de 10 centímetros.
- Lave sangue de músculos em PBS e músculos de transferência para um novo 6 centímetros estéril placa: 1 placa de 1-2 ratos.
- Remover o tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, feixes nervosos e tecido adipogênica sob um microscópio de dissecação.
- Com uma tesoura para oftalmologia, cortar e picar o tecido em uma pasta lisa (Figuras 1A e 1B). Tente não deixar pedaços grandes, já que não será dividida prontamente pela solução enzimática.
- Transferir músculos picados para um tubo Falcon de 50 mL, e adicionam-se 5 ml de solução de colagenase (0,2% de colagenase do Tipo 2 em 10% de FBS em DMEM). Incubar a 37 ° C durante 60 min.
- Triturar (para cima e para baixo com uma agulha 18 G) para homogeneizar a mistura (Figura 1C). Em seguida incubar ainda mais a mistura a 37 ° C durante 15 min.
- Triturar novamente para homogeneizar mistura para dissociar-se em suspensão única célula. Adicionar 2% de FBS em DMEM até 50 ml para a suspensão de células individuais e misturábem.
- Coloque um filtro celular (70 mM) em um tubo Falcon de 50 ml (Figura 1D). Transferir o sobrenadante contendo as células dissociadas em um coador de células, e a suspensão celular pipetar para cima e para baixo no filtro até que ela passe através.
- Contar o número de células em hemocitômetro. Centrifugar os tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; aspirado e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender com 10 ml de 2% de FBS em DMEM. Centrifugar os tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; aspirado e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender com 200 mL de 2% FBS em DMEM e suspensão de células transferência para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Normalmente, cerca de 2 x 10 6 células devem ser colhidas a partir de músculos de um rato. As células vão ser diluídas para uma concentração de 1 x 10 6 células em 100 ul de 2% de FBS em meio DMEM.
2. Anticorpo Coloração e separação com MACS
Durante o seguinte procedures, manter condições estéreis utilizando tampões estéreis. Cada volume de anticorpos adicionados e meio de suspensão de célula é calculada para as células dos músculos inteiros de um rato. Se as células são colhidas a partir de duas ou mais ratos, a quantidade de reagentes deve ser optimizado.
- Adicionar 1 ml de cada um CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e Integrina anticorpo α7 em 200 ul de suspensão de células. Incubar em gelo durante 30 min.
- Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de 2% de FBS em DMEM na suspensão de células no tubo de 1,5 ml e centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita esta etapa duas vezes.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 200 mL de 2% FBS em DMEM, e adicionar 10 ml de Anti-PE esferas magnéticas. Incubar em gelo durante 30 min.
- Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão de MACS para a suspensão de células no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e, em seguida, centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este passo twgelo. Note-se que as células deverão ser lavadas pelo tampão MACS antes de ser separada por coluna magnética.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células com 1,0 ml de tampão de MACS.
- Configure coluna LD em uma placa magnética, e lavar a coluna com 2,0 ml de tampão MACS (Figura 1E).
- Transferência da suspensão de células para dentro da coluna de LD, e recolher a fracção de escoamento num tubo de 1,5 ml. Esta fracção contém células PE-negativo.
- Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos, aspirado e desprezar o sobrenadante.
- Suspenda as células com 200 ul de 2% de FBS em DMEM, e adicionar 10 ul de IgG anti-ratinho esferas magnéticas. Incubar em gelo durante 30 min.
- Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão de MACS para a suspensão de células em 1,5 ml de tubo e, em seguida, centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as células com 500 ul de tampão de MACS.
- Configure coluna MS em uma placa magnética, e lavar a coluna com 500 mL de tampão MACS (Figura 1F).
- Transferência suspensa solução de células na coluna MS, e descartar a fração de fluxo (células α7 negativo integrinas).
- Enxágüe com 1 ml de tampão MACS, e repita esta etapa duas vezes.
- Depois de enxaguar, remover a coluna a partir do campo magnético do separador. Aplicar 1,0 ml de tampão de MACS para a coluna, e eluir as células magneticamente marcadas (células α7-positivo Integrina) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, empurrando o êmbolo da seringa a partir do topo da coluna. Recolhe-se o fluxo de passagem para um tubo de 1,5 ml. Repete-se a eluição com 1,5 ml de tampão de MACS e recolher o fluxo de passagem.
- Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos, aspirado e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células purificadas com 1 ml de meio de mioblasto (FBS a 20% continha Hams F-10 com bFGF), e células da placa em Matrigel-revestidas 10 centímetrosplaca com 8 ml de mioblasto Médio (5 ml em seis centímetros placa) (Figura 1G). Note-se que de 1-2 x 10 5 células pode, potencialmente, ser isolado a partir de um músculo intacto do rato.
3. Manutenção
- Alimentar as células a cada dois dias com meio mioblasto. O aparecimento de mioblastos em crescimento é de uma pequena e rodada expressando MyoD (Figura 2) e Pax7 (dados não mostrados) no seu núcleo.
- Mioblastos devem ser passadas antes dos 50% de confluência ou quando iniciar a fusão celular. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células com uma solução de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 3 minutos em uma incubadora de CO 2 e recolher células dissociadas com meio mioblasto. Após centrifugar células (1.000 rpm por 5 min), suspender com meio mioblasto e replate células em novas placas Matrigel-revestidos. Placas revestidas com colagénio pode ser usado após a passagem 3. Uma placa pode ser geralmente dividida em 3-5 placas.
4. Diferentiation
- Alimente novamente com Diferenciação Médio em dias alternados.
- Por volta do dia 1 de Diferenciação Médio, mioblastos sair do ciclo celular e sofrem diferenciação em cadeia pesada da miosina (MHC) positivo miócitos. Estes myoctyes começar a fusão das células com o outro para gerar miotubos multinucleados. Tipicamente, a maioria dos mioblastos tornar miócitos MHC-positivos mononucleares de diferenciação ou miotubos (Figura 2) por dia 3-5 na Diferenciação Médio.
5. Mioblasto Transplante em mouse para Skeletal regeneração muscular
- Anestesiar o rato com Avertin (250 mg / kg) por via intraperitoneal (IP) de injecção.
- Raspar o cabelo da pele em torno do músculo tibial anterior (TA). Vinte e quatro horas antes do transplante de mioblastos, 10 uM CTX (50 ul) é injectada por via intramuscular para o Node / músculo de ratinho SCID TA para induzir a regeneração do músculo através de uma seringa de 31 L de insulina através da pele raspada (Figura60, 3).
- Mioblastos em proliferação são dissociados com uma solução de tripsina a 0,25% e centrifugadas a 1.000 rpm durante 5 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Ressuspender 1 x 10 6 células, com 50 ul de 2% de FBS em DMEM. Transferir as células em suspensão com uma seringa de insulina de 31 L.
- Os ratinhos receptores serão anestesiados com Avertin (250 mg / kg) por injecção IP, e os 1 x 10 6 mioblastos (Figura 2) são injectadas por via intramuscular em regeneração muscular TA.
- Colheita TA muscular por 1-4 semanas após a injecção das células para análise histológica (Figura 3).
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Representative Results
Células satélites quiescentes recentemente isoladas exibir uma forma pequena e redonda (Figura 1G) e Pax7 expressa como um marcador definitivo para as células satélites quiescentes. Mais de 90% das células recentemente isoladas expressam Pax7 (Figura 1H e 1I). A maioria das células contaminadas são a partir de células de sangue que não crescem de forma eficiente in vitro seguintes condições de cultura de mioblastos. Assim, mioblastos derivados de células satélite dominar na cultura. Opcionalmente, pode-se repetir os passos de purificação em coluna de MS (passos 2,11-2,14) para aumentar a pureza das células satélites isoladas. Estas células satélites quiescentes vai entrar no ciclo celular dentro de 24 horas após o isolamento se submeter células precursoras miogênicas ou mioblastos. Estas células podem ser passadas por tripsinização a cada 4 dias até que a taxa de proliferação das células é reduzida. Normalmente, essas células podem ser mantidas até que a passagem 10. Estes mioblastos em proliferação expressam MyoD (
Figura 1. Preparação de células satélites musculares de rato músculo esquelético. A:. Mincing tríceps dissecados e músculos dos membros posteriores por tesouras B:. Visualização ampliada do painel A C: trituração picados pedaços de músculo tratado com colagenase por 18 G agulha D:. Filtrantes dissociada preparação muscular, filtro de células E:. MACS separação de dissociada Eu células satélites recém-isoladas Pax7 positivo:: coloração DAPI para o painel G células musculares por coluna LD F:. MACS separação das células musculares dissociadas por coluna MS G:.. células satélites recentemente isoladas H..
Figura 2. Cultura de células satélites isoladas. A, B, C: mioblastos de anticorpos positivos anti-MyoD derivadas de células isoladas de fresco de satélite D, E, F:. Cadeia anti-miosina pesada (MHC)-positivo diferenciação miotubos multi-nucleadas.
Figura 3. Injeção intramuscular de mioblastos expandidas em rato músculo esquelético. A: X-gal coloração de mioblastos isolados de camundongos Myf5 + / nLacZ B, C:. Injeção intramuscular de Myf5 + / nLacZ mioblastos no músculo TA.
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Discussion
Neste protocolo, as células satélites quiescentes podem ser facilmente purificadas a partir de músculo esquelético de ratinhos adultos por digestão com colagenase e de separação MACS mediada por anticorpos da superfície. Este método leva cerca de 6 horas e não precisa de nenhum equipamento caro, como uma máquina de FACS. Além disso, este método é relativamente barato em comparação com a superfície mediada por anticorpo de separação FACS. Uma maior produção de células quiescentes de satélite também é esperado em comparação com FACS para este método uma vez que a exposição ao laser FACS tende a induzir a morte celular durante a separação 15. Outros métodos de isolamento, tais como preplating ou cultura fibra muscular único requerem poucos dias de cultura, e, assim, estes métodos são bons para as células activadas por satélite ou isolamento de mioblastos. No entanto, as células satélites quiescentes não pode ser purificado por estes métodos. Métodos Preplating excluir contaminação de fibroblastos, com base em sua diferença adesão entre as células satélites ativadas e mioblastoss 21. Células satélites ativado ou mioblastos conseqüência ocorre durante a cultura da fibra muscular única 22. Observamos também que os ratos jovens (1-2 meses de idade) mostram um rendimento mais elevado de células satélites quiescentes (1-5 x 10 5 / ratinho) purificados por este método de separação MACS, em comparação com ratinhos mais velhos. No entanto, a pureza das células satélites quiescentes de músculo danificado é reduzido após esta purificação MACS mediada por anticorpos de superfície uma vez que o músculo danificado contém células sanguíneas mais infiltradas. Para a separação MACS das células satélites quiescentes, utilizamos CD45, CD31, e Sca-1 como marcadores de superfície celular para a seleção negativa. CD45 é um fabricante de células pan-hematopoiéticas; CD31 é um marcador de células endoteliais; Sca-1 é um marcador para ambas as células endoteliais e as células intersticiais 23. Para a selecção positiva, que utilizou um anticorpo monoclonal anti-α7 integrina, que cora as células satélites quiescentes, bem como algumas células nonmuscle no músculo esquelético. Vários grupostambém utilizado um anticorpo anti-integrina α7 por FACS baseada em purificação de células satélite quiescente, em combinação com outra selecção positiva e negativa marcadores de 7,24. Em adição, outros grupos utilizados anticorpos contra CXCR4 25, CD34 7, Syndecan-3 26, ou 27 Syndecan-4 como marcadores de selecção positiva para baseada em FACS purificação de células satélite quiescente. Um anticorpo monoclonal SM/C-2.6 foi também utilizado para a selecção positiva, enquanto o epitopo para o anticorpo monoclonal não foi ainda identificado um. Nenhum destes marcadores de selecção positivos são específicos de células satélite quiescente. Portanto, a eliminação completa de tais células que expressam nonsatellite estes marcadores de selecção positiva é essencial para a obtenção de elevada pureza de células satélites quiescentes após separação. Pode ser mais útil usar células específicas marcadores da superfície celular via satélite, como M-caderina como marcador de seleção positiva.
Fcélulas satélites quiescentes reshly isoladas pode ser usado para perfis expressão gênica e protéica, experimentos de cultura para obtenção de mioblastos e transplante de células para experimentos de células satélites de auto-renovação, e terapias celulares. Trabalhos anteriores demonstraram que os perfis de expressão de genes são significativamente diferentes das células activadas por satélite, o que pode explicar algumas das diferenças biológicas entre estes dois tipos de células (tais como células na fase dormente vs divisão. Activo célula) 1, 28. Um trabalho recente demonstrou que as células satélites quiescentes recentemente isolados possuem significativamente maior do enxerto e a actividade de auto-renovação em comparação com as células activadas por satélite ou mioblastos, quando transplantadas para regenerar o músculo 6-7. Por exemplo, a menos de 100 células satélites quiescentes mostrar contribuição robusta para regenerar as fibras musculares, bem como para as células satélites auto-renovação 5,7. Portanto, as células satélites quiescentes pode ser isolado umd testados quanto à sua potencial para enxertar eficiente no músculo danificado, a sua contribuição para a regeneração da fibra muscular, e sua melhora da função muscular em pacientes com DMD.
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Disclosures
Não há conflito de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Shahragim Tajbakhsh para a prestação de camundongos Myf5 + / nLacZ. Agradecemos também a Alexander Hron e Michael Baumrucker para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações da Associação de Distrofia Muscular (MDA) e Gregory Marzolf Jr. MD Centro Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18 G needle with 12 ml Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm Tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm Tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31 G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | Recipe | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C. | ||
| Myoblast medium | 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. | ||
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