用于识别传染性朊病毒通过后通过一个鸟类的消化系统程序

Summary

清除剂具有潜在的易位感染传染性海绵状脑病朊病毒在其粪便到无病的区域。我们用来确定是否通路虽然美国乌鸦的消化道（ 乌鸦brachyrhynchos），死亡动物的共同消费后小鼠适应痒病朊病毒保持传染性细节的方法。

Abstract

传染性朊病毒（PrP的^住宅 ）的材料很可能是致命的，神经退行性传染性海绵状脑病（TSE）的疾病病因^1。谢性疾病，如慢性消耗性疾病（CWD）的传输，被假定为从动物到动物^2,3以及从环境来源^4-6。清除剂和食肉动物有潜力通过消费和CWD污染腐肉的排泄，转运的PrP ^住宅材料。最近的工作已经通过美国乌鸦的消化系统（ 乌鸦座brachyrhynchos），一个共同的北美清道夫⁷记载的PrP的^住宅的材料通过。

我们描述的程序用于通过美国乌鸦记录的PrP的^住宅的材料通过。乌鸦被灌服RML株小鼠适应痒病和他们的粪便收集4小时后灌服。乌鸦粪便，然后汇集和腹腔注射进C57BL / 6小鼠。小鼠每天监测，直到他们表示鼠标瘙痒病的临床症状，并随后实施安乐死。无症状的小鼠进行了监测，直到接种365天岗位。 Western blot分析进行确认疾病状态。结果表明，朊病毒通过乌鸦消化系统行驶后保持感染性和存在于粪便中，引起疾病中测试小鼠。

Introduction

传染性海绵状脑病（TSE）是致命的感染性神经退行性疾病，影响野生动物，家养动物和人类。谢疾病的传染性病原体似乎是朊蛋白¹的错误折叠或致病亚型（PRP ^住宅 ）。动物TSE疾病包括慢性消耗性疾病（CWD）的黑尾鹿（ 白尾野驴 ），白尾鹿（ 白尾virginianus）来说 ，麋鹿（ 马鹿 ），和驼鹿（ 驼鹿 ）;痒病的绵羊和山羊，牛海绵状脑病（ BSE）在国内的牛，在养殖水貂传染性水貂脑病;猫猫海绵状脑病，在异国情调的异国情调的动物园有蹄类动物海绵状脑病反刍的牛科家族;及海绵状脑病在非人灵长类动物^8。单人谢氏病，变异型克雅氏病，是罕见的，认为通过消耗PrP的^住宅 -康泰明收购ATED食物^9。同样，疯牛病可以感染人类，如果被污染的牛肉消耗^10。所有TSE疾病，痒病和CWD是仅有的两个具有自我维持的流行病和源感染被假定为从动物到动物^2,3,11以及从环境源^4-6。研究表明，大多数TSE疾病需要从PrP的^住宅的材料自然暴露事件显着延长潜伏期的临床症状表现^2-4,6,8和表观物种界限减少，但不排除对，种间传播^12-14的潜力。

识别机制传染性朊病毒（PrP的^住宅 ）物质的扩散是回答有关TSE疾病在景观是如何移动的问题极为重要。实验研究表明，昆虫^15,16，家禽和猪^17日 ，美国和乌鸦（ 乌鸦座曼布拉克^{hyrhynchos）7,18}是PrP的^住宅材料的被动载体或传播者。通过乌鸦的消化系统通道的PrP的^住宅的材料最近被记录在案，这表明他们在谢病⁷分散可能发挥的作用。这些结果使得合理的，乌鸦，一个清道夫，可能会遇到，消费，并通过粪便沉积运输传染性物质，对无病的地区。

我们在这里展示的程序是用来通过乌鸦的消解系统记录的PrP的^住宅的材料通道，将极大地促进这些方法应用到其他净化剂和食肉动物物种特异性的车型在今后的相关研究。在这项研究中传统的方法被用来研究人口贩运的PrP ^住宅材料，这可能有助于PrP的^住宅材料的扩散和总体负担的非常规手段。

Protocol

我们的协议是改编自一个大家此前公布的^7。所有涉及动物的程序已获农业部美国农业部（USDA），动植物健康检验局（APHIS），野生动物服务（WS），国家野生动物研究中心（NWRC）的机构动物护理和使用委员会。

1。乌鸦Gavaging

1. 通过美国乌鸦的消化道估计的“伪大脑物质”通过时间。
   1. 将5毫升煮和炒鸡蛋全用蓝色染料和灌胃1乌鸦用灌胃针2（ 图1）。
   2. 检查乌鸦每隔30分钟，直至蓝色/绿色染色的粪便不再被排出体外。
2. 获得感染和患绝症的RML（钱德勒株）感染的C57BL / 6小鼠的大脑。
3. 产生20％的重量/体积正常和受感染的小鼠脑匀浆中的子弹搅拌器匀浆用1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）和玻璃珠，然后离心以3,000×g离心1分钟，以除去较大的颗粒物质。除去上清，用1×PBS等体积的稀释以产生10％重量/体积的无菌PBS中。直到需要冻结在-80°C。
4. 17前灌胃小时取出食物，但不能积水，从乌鸦笔。
5. 随机分配乌鸦到治疗组和在管饲针以2口服灌胃各乌鸦用5ml正常或感染的小鼠脑匀浆。
6. 乌鸦转移到单独的笼子，并收集和集中每个笼子内的所有粪便4小时后灌服（ 图2）。
7. 均质粪便汇集每个乌鸦在子弹搅拌器匀浆与玻璃珠直至均匀质地的实现。 *乌鸦粪便大多是液体，并且可以很容易被混淆。
8. 对于每个乌鸦，稀500μl的粪便匀浆成9.5毫升的1×PBS的10毫升的总体积。
9. 离心粪便homogenaTE 15分钟，1400×g离心并提取上清液。
10. 为了尽量减少二次微生物感染的威胁，治疗上清液用1微升100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素（Invitrogen公司，NY）中，每100微升匀浆，然后在UV光下放置在室温下20分钟，以减少病毒和细菌污染的风险。紫外线照射后，在3000万像素超声波仪在设置70下30秒以破坏任何剩余微生物膜的声处理样品。

2。小鼠接种

1. 随机分配小鼠到以下治疗组（ 表1）：
   1. 第1组 - 积极的治疗的小鼠腹腔接种（IP）用1毫升粪便匀浆从乌鸦喂饲用5ml感染小鼠的大脑。
   2. 第2组 - 负治疗小鼠知识产权接种1毫升粪便匀浆从乌鸦喂饲用5ml正常小鼠的大脑。
   3. 稀infecteD与正常小鼠脑匀浆组3和4至1:100 w / v的在1X PBS。
   4. 组3 - 正对照小鼠接种IP用1ml的感染的小鼠脑匀浆。
   5. 第4组 - 阴性对照小鼠接种IP用1毫升的正常小鼠脑匀浆。

	治疗组	动物的数目
第1组	痒病+乌鸦屎	100
第2组	痒病 - 乌鸦屎	25
第3组	痒病+小鼠脑	10
第4组	痒病 - 小鼠脑	5

。 接种表1痒病状态（阳性+，负- ）和动物的使用数量^7。

2. 腹腔接种小鼠：
   1. 颈背通过鼠标背部颈部的皮毛用拇指和食指轻轻转动，露出腹侧。
   2. 提升鼠标后端所以头略低。
   3. 将25号针头1厘米通过皮肤，中线为1厘米的横向，和1-2厘米用针锁式注射器前到骶髂关节。
   4. 注入1毫升慢慢接种到小鼠体腔。

3。鼠标监测

1. 每天监测小鼠，直到他们表达小鼠瘙痒病的​​临床症状。临床症状包括：驼背，走路不稳，僵硬的尾巴，缺乏疏导，形体消瘦，嗜睡。
2. 得分老鼠各6临床体征时明显迹象是明显的，其中0 =没有可见的，1 =温和，2 =严重。
3. 安乐死在小鼠每日总成绩为每个符号1天达到≥8≥6连续3天，或在365天后接种（DPI）。
4. 收获的大脑紧随euthan亚洲并储存于-70℃。
5. 以确认诊断痒病，消化脑样品用3微升的蛋白酶K溶液（PK）50微克/毫升稀释如下：3.1。微升PK，12.5微升的500mM EDTA，pH为8，109.39微升1×PBS中的30分钟，在45℃，然后通过添加8微升加样缓冲液，并温育的样品在95℃下5分钟灭活的PK。负载样品到12％SDS-PAGE凝胶，electrophorese和转移到Immobilon PVDF膜，并用5％脱脂牛奶块中的0.2％吐温20的PBS溶液1小时，在室温下进行。然后探测与Bar224抗PrP的单克隆抗体缀合到辣根过氧化物酶，稀释于Superblock中，1小时在室温下。漂洗膜1小时，用PBS-0.2％吐温20。为了形象化，培养印迹5分钟，化学发光底物和图像上的G-box凝胶成像系统。

Representative Results

所使用的程序表明，乌鸦的消化系统并不之后的痒病脑匀浆⁷口灌胃消除朊病毒^住宅感染4小时。这是灌服PrP的^住宅的材料全部20只乌鸦随后通过粪便传播的PrP ^住宅材料老鼠。病鼠均经临床鼠标痒病体征和疾病的确认通过Western blot分析完成的体现。

通过消化道的灌胃乌鸦为4小时，根据染料的粪便中存在（ 图1）的材料由乌鸦摄入的保留时间的调查显示流逝的时间。所有收集粪便用一次性移液管和汇集每个乌鸦（ 图2）。当原粪便上清液注入的IP为先导试验小鼠发生了未经处理的粪便乌鸦急性毒性。通过将粪便接种用青霉素和STREptomycin，紫外线，和超声处理我们缓解了这个问题。

接种或瘙痒病阳性的小鼠脑（9/9）或从痒病接种乌鸦屎所有小鼠（66 * / 84）开发的临床体征和测试通过Western印迹分析阳性（ 图3），说明痒病通过易通过乌鸦和引起疾病的消化系统。 * 18只在接种后3天死亡，可能是由于毒性。所有，但一（1/23）痒病阴性接种小鼠为阴性的Western blot分析。我们猜测，这款鼠标是无意中接种痒病阳性乌鸦粪便，而不是从痒病阴性乌鸦屎。

图1。乌鸦手动内敛而用5毫升全蛋的蓝色染料（a）和b混合喂饲吕/绿粪染后4小时灌胃（B） 点击此处查看大图 。

图2。乌鸦粪便收集与吸管之前的同质化。 点击这里查看大图 。

图3。 。小鼠大脑的生物测定代表性的SDS-PAGE电泳免疫印迹 NBH正常小鼠脑匀浆，痒病阴性，TX笼4 -大脑从小鼠接种从痒病接种乌鸦屎。用（+）和withou吨（ - ），PK（蛋白酶K）消化点击这里查看大图 。

Discussion

我们展示了一个过程，通过乌鸦的消化系统记录的PrP的^住宅的材料通过。我们所用的常规方法，以确定是否有乌鸦易位的PrP ^住宅材料到无病的地理区域的能力。他人已经评估的PrP ^分辨率的电阻给反刍^19-21和啮齿类^22,23消化液，两者不能消除它。这些技术未来的应用应该可以应用到其他食肉动物^24，因为他们也有可能遇到的PrP ^住宅材料腐肉和运输这种材料在景观促进朊病毒疾病的传播。

我们添加了蓝色的食用色素给我们炒鸡蛋“伪大脑的物质，提供了一个简单的方式，通过乌鸦的消化道评估匀浆小鼠大脑近似通行时间。我们奉劝别人考虑这种技术首先插件他们期望研究动物的粪便中存在的颜色，然后用食用色素是最鲜明的对比。这将允许以易于识别的，通过研究动物已通过食色染色材料。我们选择使用食用色素来估计通过时间，但其他已使用荧光颜料^25，氧化铁^26，有色塑料标记物^27，并涂上金属片状粉末（ 即闪耀^）28。

尽量减少乌鸦粪便二次微生物感染的威胁，正确接种小鼠是主要的出发点，需要很长的潜伏期小鼠朊病毒研究。如果这些因素受到侵犯时，小鼠早期死亡率可能会导致。

调查的另一个可能的工具是串行的蛋白质错误折叠循环扩增或sPMCA评估乌鸦粪便样品随着时间的推移，以确定如何经过长期口服灌胃乌鸦传递传染性物质，具有出需要进行小鼠生物。通过Pulford酒店中PMCA粪便分析的最新进展， 等。表明，朊病毒分钟级别的扩增可以在哺乳动物粪便²⁹被检测到，这表明PMCA也可能用于评估禽粪便中的有用工具。小鼠生物检测和sPMCA方法可用于评估残余感染的乌鸦喂饲CWD感染材料的粪便。一个cervidized转基因小鼠线须与脑内与腹腔接种将给予更快速的结果。

禽流清除剂，如乌鸦，秃鹫，和鹰，能够在谢疾病的传播起到一定的作用，即中华白海豚在北美。这些物种可能与患病屠体或内脏（在猎人杀死的鹿类的情况下）消耗CWD阳性的组织，并在其粪便转运感染性物质CWD自由区或鹿类种群。至于喂食谷物鹿类，在实践野生或圈养设置，吸引乌鸦可以排便的食物来源，并无意中鹿类消耗掉，因此是一个高风险的做法（VerCauteren个人观察）。此外，虽然CWD无动物通过随机粪便沉积遇到的PrP ^住宅材料的几率可能较低，乌鸦在那里，因而其粪便集中的地区，如下面公用夜栖地点，可能成为疾病传播的高风险领域，因为朊病毒如此执着于环境^30,31。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene