Summary
Skraldemanden har potentiale til at translokere smitsomme overførbar spongiform encephalopati prioner i deres afføring til sygdomsfrie områder. Vi detalje metoder, der anvendes til at afgøre, om muse-tilpassede scrapie prioner forblive infektiøse efter passage selvom fordøjelseskanalen af amerikanske krager (Corvus brachyrhynchos), en fælles forbruger af døde dyr.
Abstract
Smitsomme prion (PrP Res) materiale er sandsynligvis årsagen til dødelige, neurodegenerative overførbar spongiform encephalopati (TSE) sygdomme 1. Overførsel af TSE-sygdomme, såsom kronisk wasting disease (CWD), formodes at være fra dyr til dyr 2,3 samt fra miljømæssige kilder 4-6. Skraldemanden og kødædere har potentiale til at translokere PrP Res materiale gennem forbrug og udskillelse af CWD-forurenet ådsler. Nyligt arbejde har dokumenteret passage af PrP Res materiale gennem fordøjelsessystemet af amerikanske krager (Corvus brachyrhynchos), en fælles nordamerikansk ådselsæder 7.
Vi beskriver procedurer, der anvendes til at dokumentere passage af PrP Res materiale gennem amerikanske krager. Crows blev tvangsfodret med RML-stammen muse-tilpasset scrapie og deres afføring blev indsamlet 4 timer efter sondeernæring. Crow afføring blev derefter samlet og injiceret intraperitonealt iC57BL / 6 mus. Mus blev overvåget dagligt, indtil de udtrykte kliniske tegn på mus scrapie, og derefter blev aflivet. Asymptomatiske mus blev overvåget indtil 365 dage efter podning. Western blot-analyse blev udført for at bekræfte sygdomsstatus. Resultaterne viste, at prioner forblive infektiøse efter rejser gennem fordøjelsessystemet af krager og er til stede i fæces, der forårsager sygdom i test-mus.
Introduction
Overførbare spongiforme encephalopatier (TSE) er dødelige smitsomme neurodegenerative sygdomme, der påvirker dyrelivet, husdyr og mennesker. Den smitstof TSE-sygdomme synes at være fejlfoldede eller patogene isoformer (PrP Res) af prionproteiner 1. Animal TSE sygdomme omfatter chronic wasting disease (CWD) i mule deer (Odocoileus hemionus), hvid-tailed hjorte (Odocoileus virginianus), elg (Cervus elaphus) og elg (Alces alces), scrapie hos får og geder, BSE ( BSE) i indenlandske kvæg, overførbar minkencephalopati i mink, feline spongiform encephalopati hos katte, eksotiske hovdyr spongiform encephalopati i eksotisk zoo ruminates af familien Bovidae og spongiform encephalopati i ikke-humane primater 8. Den enkelt menneske TSE sygdom, variant Creutzfeldt-Jakobs sygdom, er sjælden og menes at være erhvervet ved at indtage PrP Res-contaminated mad 9. Ligeledes kan BSE smitte mennesker, hvis forurenet oksekød forbruges 10. Af alle de TSE-sygdomme, scrapie og CWD er de eneste to med selvopretholdende epidemier og kilder til infektion antages at være fra dyr til dyr 2,3,11 såvel som fra miljømæssige kilder 4-6. Forskning tyder på, at de fleste TSE-sygdomme kræver bemærkelsesværdige længere inkubationstid fra naturlige hændelser eksponering af PrP Res materiale manifestation af kliniske tegn 2-4,6,8 og tilsyneladende artsbarrierer minimere, men ikke udelukke muligheden for, interspecies transmission 12-14 .
Identifikation mekanismer for spredning af smitsomme prion (PrP Res) materiale er ekstremt vigtigt for at besvare spørgsmål om, hvordan TSE sygdomme bevæge sig hen over landskabet. Eksperimentelle undersøgelser har antydet, at insekter 15,16, fjerkræ og svin 17, og amerikanske krager (Corvus Brachyrhynchos) 7,18 er passive bærere eller dispergatorer af PrP Res materiale. Passage af PrP Res materiale gennem fordøjelsessystemet krager er for nylig blevet dokumenteret, viser den rolle, de kan spille i spredning af TSE-sygdomme 7. Disse resultater gør det plausibelt, at krager, en ådselsæder, kan støde på, forbruge og transportere infektiøst materiale via afføring deposition til sygdomsfrie områder.
De procedurer, vi demonstrerer her blev brugt til at dokumentere passage af PrP Res materiale gennem fordøjelsessystemet af krager og vil i høj grad lette anvendelsen af disse metoder til andre ådselsæder og kødædende arter-specifikke modeller i relaterede fremtidig forskning. I denne undersøgelse konventionelle metoder blev anvendt til at undersøge en utraditionel måde for menneskehandel PrP Res materiale, som vil kunne bidrage til udbredelsen og den samlede byrde af PrP Res materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vores protokol tilpasset fra en vi tidligere offentliggjorte 7. Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg det amerikanske landbrugsministerium (USDA), Dyresundhed og Plantesundhed Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).
1.. Crow Gavaging
- Vurdere passage tid af 'pseudo hjerne materiale «gennem fordøjelseskanalen af amerikanske krager.
- Bland 5 ml kogt og krypteret hele æg med blåt farvestof og sonde 1 krage anvendelse af en 2 i sonde nål (figur 1).
- Tjek krage hver 30 min, indtil blå / grønne-farvede afføring er ikke længere udskilles.
- Anskaf inficerede og uhelbredeligt syge RML (Chandler stamme)-inficerede C57BL / 6 mus hjerner.
- Generer en 20% vægt / vol normal og inficerede mus-hjernehomogenat i en blender kugle homogenisator med 1xphosphatbufret saltvand (PBS) og glasperler, centrifugeres ved 3.000 x g i 1 minut for at fjerne større partikler. Fjern supernatanten og fortyndes med et lige volumen af 1x PBS til at generere en 10% vægt / vol, i sterilt PBS. Fryse ved -80 ° C indtil brug.
- 17 hr før sondeernæring fjerne mad, men ikke vand, fra Crow penne.
- Tilfældigt tildele krager til behandlingsgrupper og mundtligt mavesonde hver krage med 5 ml enten normal eller inficeret musehjernehomogenat ved hjælp af en 2 i tvangsfodring nål.
- Overførsel krager til individuelle bure og indsamle og samle alle afføring inden for hvert bur til 4 timer efter sondeernæring (figur 2).
- Homogeniseres poolede afføring for hver krage i en blender kugle homogenisator med glasperler, indtil en ensartet konsistens er opnået. * Crow afføring er for det meste flydende og kan blandes nemt.
- For hver krage, fortyndes 500 pi fækal homogenat i 9,5 ml 1x PBS til et totalt volumen på 10 ml.
- Centrifugeres fækal homogenate i 15 min ved 1.400 xg og udtrække supernatanten.
- For at minimere risikoen for en sekundær mikrobiel infektion, behandle supernatanten med 1 ml af 100 enheder / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (Invitrogen, NY) per 100 ul homogenat derefter placere under UV-lys ved stuetemperatur i 20 min for at reducere risiko for viral og bakteriel kontaminering. Efter UV-eksponering, soniker prøver i et 3000 Mp sonicator ved indstilling 70 i 30 sek til at forstyrre membranen af de resterende mikrober.
2. Mus Podning
- Tilfældigt tildele mus på følgende behandlingsgrupper (tabel 1):
- Gruppe 1 - positiv behandling mus podet intraperitonealt (IP) med 1 ml fækal homogenat fra krager oralt sondetilføres 5ml inficeret mus hjerner.
- Gruppe 2 - Negativ behandling mus podet IP med 1 ml af fækal homogenat fra krager oralt sondetilføres 5ml normal mus hjerner.
- Fortyndet infected og normal musehjernehomogenat for gruppe 3 og 4 til 1:100 w / v i 1x PBS.
- Gruppe 3 - Positive kontrol mus podet IP med 1 ml af inficerede mus-hjernehomogenat.
- Gruppe 4 - Negativ kontrol mus podet IP med 1 ml normal mus-hjernehomogenat.
| Behandling Group | Antal dyr | |
| Gruppe 1 | Scrapie + Crow Afføring | 100 |
| Gruppe 2 | Scrapie - Crow Afføring | 25 |
| Gruppe 3 | Scrapie + Mouse Brain | 10 |
| Gruppe 4 | Scrapie - Mus Brain | 5. |
. Tabel 1 scrapie status inoculum (positiv + negativ -) og antallet af dyr, der anvendes 7.
- Intraperitonealt pode mus:
- Scruff musen ved dorsal hals pels med tommel-og pegefinger og forsigtigt dreje til at afsløre ventrale side.
- Elevate bageste ende af mus, så hovedet er lidt lavere.
- Indsæt 25 G nål 1 cm gennem hud, 1 cm lateral af midterlinjen og 1-2 cm anterior til bækkenet hjælp af en nål-låsning sprøjte.
- Injicer 1 ml pode langsomt i mus legemshulrum.
3. Mus Overvågning
- Overvåg mus dagligt indtil de udtrykker kliniske tegn på mus scrapie. Kliniske symptomer kan omfatte: kyphosis, ataksi, stiv hale, manglende pleje, afmagring, og sløvhed.
- Score mus for hver af de kliniske 6 tegn, når synlige tegn er indlysende, hvor 0 = ingen synlige, 1 = moderat, og 2 = svær.
- Aflive mus når samlede daglige scorer for hvert tegn nå ≥ 8 for 1 dag ≥ 6 uafbrudt i 3 dage, eller til 365 dage efter podning (dpi).
- Harvest hjerner umiddelbart efter euthanasien og opbevares ved -70 ° C.
- For at bekræfte en scrapie diagnose, fordøje hjerneprøver med 3 pi af en 50 mg / ml af proteinase-K-løsning (PK), fortyndet som følger: 3.1. pi PK, 12,5 pi 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 pi 1x PBS i 30 minutter ved 45 ° C, og derefter inaktivere PK ved tilsætning af 8 pi loading buffer og inkubere prøverne ved 95 ° C i 5 min. Load prøver onto en 12% SDS-PAGE-gel, elektroforese og overføres til Immobilon PVDF-membran og blokeret med 5% fedtfri mælk i 0,2% Tween 20 i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Derefter sonde med Bar224 anti-PrP monoklonalt antistof konjugeret til peberrodsperoxidase fortyndet i Superblock, i 1 time ved stuetemperatur. Skyl membranen i 1 time med PBS-0.2% Tween 20. At visualisere, inkuberes Western blot 5 min med kemiluminescerende substrat og billede på en G-box gel dokumentation system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De anvendte procedurer viser, at fordøjelsessystemet krager ikke eliminerer PrP Res infektivitet 4 timer efter oral tvangsfodring af scrapie hjemehomogenat 7. Alle tyve krager, der blev tvangsfodret med PrP Res materiale efterfølgende videregives PrP Res materiale via afføring til mus. Syge mus blev identificeret ved manifestation af kliniske muse-scrapie skilte og bekræftelse sygdom blev afsluttet ved Western blot-analyse.
Undersøgelse af retentionstiden for materiale indtages af krager afslørede passagetid gennem fordøjelseskanalen for en tvangsfodret krage 4 timer, baseret på tilstedeværelsen af farvestof i fæces (figur 1). Alle fæces blev opsamlet med engangspipetter og samles for hvert krage (figur 2). Akut toksicitet fra ubehandlede kragen afføring opstod, da rå fækal supernatant blev injiceret IP i pilottest mus. Ved at behandle fækal inoculate med penicillin og streptomycin, UV-lys, og lydbehandling vi afhjælpes dette problem.
Alle mus inokuleret med enten scrapie-positive musehjerne (9/9) eller afføring fra scrapierelaterede inokuleret krager (66 * / 84), udviklede kliniske tegn og testet positive ved Western blot-analyse (figur 3), hvilket viser, at scrapie let passeret gennem fordøjelsessystem krager og forårsagede sygdom. * Atten mus døde inden for 3 dage efter inokulering, sandsynligvis på grund af toksicitet. Alle undtagen én (1/23) scrapierelaterede negativ inokulerede mus var negative ved Western blot-analyse. Vi hypotesen, at denne mus uforvarende blev podet med scrapie-positive kragen afføring i stedet for afføring fra en scrapie-negative krage.
Figur 1. Crow manuelt behersket og oralt sondeernæret med 5 ml hele æg blandet med blåt farvestof (A) og blue / grøn-farvede afføring 4 timer efter sondeernæring (B). Klik her for at se større billede .
Figur 2. Crow afføring kollektion med pipette før homogenisering. Klik her for at se større billede .
Figur 3. . Repræsentant SDS-Side Western blot af musen hjernen fra bioassay NBH-normal musehjernehomogenat, scrapie-negative, TX bur 4 - hjernen fra en mus podet med afføring fra en scrapie-podet krage. Med (+) og without (-). PK (proteinase K) fordøjelse Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en procedure til at dokumentere passage af PrP Res materiale gennem fordøjelsessystemet af krager. Vi brugte konventionelle metoder til at afgøre, om krager har evnen til at translokere PrP Res materiale sygdomsfrie geografiske områder. Andre har vurderet modstand PrP Res til drøvtyggere 19-21 og gnavere 22,23 fordøjelsesvæsker, som begge har undladt at fjerne det. Fremtidig anvendelse af disse teknikker bør anvendes på andre rovdyr 24, da de også potentielt kunne støde PrP Res materiale i ådsler og transportere dette materiale over landskabet lette spredningen af prionsygdomme.
Vi har tilføjet blå frugtfarve til vores røræg 'pseudo hjerne' materiale, der giver en enkel måde at vurdere omtrentlige passage tid homogeniseret mus hjernen gennem fordøjelseskanalen af krager. Vi rådgiver andre, der overvejer denne teknik til første inspect eksisterende afføring farve af studie dyr og derefter bruge frugtfarve, der er mest kontrastfyldte. Dette vil give mulighed for nem identifikation af fødevarer farve farvede materiale, der har passeret gennem studie dyr. Vi valgte at bruge frugtfarve til at estimere passage tid, men andre har brugt fluorescerende pigment 25, jernoxid 26 farvede plastik markører 27, og farvede metalliske flager (dvs. glitter) 28.
Minimering truslen om en sekundær mikrobiel infektion fra Crow afføring og korrekt inokulering mus er centrale udgangspunkter for muse-prion undersøgelser, der kræver lang inkubationstid. Hvis en af disse overvejelser er blevet krænket, er sandsynligvis resultere tidlig mus dødelighed.
En anden mulig værktøj til undersøgelse er seriel protein misfoldning cyklisk forstærkning eller sPMCA at evaluere crow fækalprøver over tid for at fastslå, hvor lang tid efter oral sondeernæring krager passere infektiøst materiale, medbehovet for en musebioassay. Nylige fremskridt inden PMCA fækal analyse ved Pulford, indikerer et al. At opformering af minut niveauer af prioner kan påvises i pattedyr afføring 29, hvilket tyder PMCA kan også være et nyttigt redskab til at vurdere aviær afføring. Den musebioassay og sPMCA fremgangsmåde kan bruges til at vurdere resterende infektivitet i afføring fra krager sondetilføres CWD-inficerede materiale. En cervidized transgene mus linje vil være påkrævet, og intracerebral versus intraperitoneal podning ville give mere hurtige resultater.
Avian skraldemanden, såsom krager, gribbe og ørne, kunne spille en rolle i spredningen af TSE-sygdomme, nemlig CWD i Nordamerika. Disse arter kunne forbruge CWD-positive væv fra syge slagtekroppe eller indvolde (i tilfælde af jæger-dræbte hjortedyr) og translocate infektiøst materiale i deres afføring til CWD-frie områder eller populationer af hjortedyr. Som praksis med at fodre korn til hjortedyr, i vild eller fangenskabindstillinger, tiltrækker krager der kan defecate på fødekilde og utilsigtet forbruges af hjortedyr, er således en høj risiko praksis (Vercauteren personlig observation). Endvidere, selvom oddsene for CWD-fri dyr støder PrP Res materiale gennem tilfældige afføring deposition kan være lav, områder, hvor krager og dermed deres afføring er koncentreret, som nedenfor kommunale rastepladser, kunne blive af højrisiko-områder for overførsel af sygdomme, da prioner er så vedholdende i miljøet 30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke S. Werner for at levere de krager, der anvendes i denne undersøgelse, og USDA, APHIS, WS, NWRC dyrepleje personale til pasning af dyr og overvågning. Nævn eller brug af et produkt er ikke ensbetydende med USDA godkendelse. Finansieringen af denne undersøgelse blev leveret af USDA, APHIS, Veterinary Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RML Chandler strain mouse-adapted scrapie | Rocky Mountain Laboratories | ||
| RC57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals | ||
| American crows | wild captured | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | |
| Sonicator | Misonix | ||
| Proteinase-K solution | Roche | 3115887001 | |
| Loading buffer | Invitrogen | NP0007 and 0009 | |
| Bis-tris SDS PAGE 12% gel | Invitrogen | NP0342 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | 1SEQ00010 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Bullet blender homogenizer | Braintree Scientific | BBX24B | |
| 2.3 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079125Z | |
| Bar224 anti-PrP monoclonal antibody | Cayman Chemical | 10009035 | |
| Superblock | Thermo Scientific | 37517 | |
| chemiluminescent substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| G-box gel documentation system | Syngene |
References
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
- Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
- Sigurdson, C. J., Adriano, A. Chronic Wasting Disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).
- Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
- Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916 (2009).
- VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774 (2012).
- Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26 (2006).
- Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
- Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
- Collinge, J. The risk of prion zoonoses. Science. 335 (6067), 411-413 (2012).
- Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
- Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
- Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114 (1996).
- Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
- Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
- Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
- Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
- Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
- Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
- Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
- Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4 (2009).
- Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
- Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
- Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
- Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
- Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
- Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
- Aldous, S. E. Winter habits of crows in Oklahoma. Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).
