Summary
Åtseletere har potensial til å translocate smittsomme overførbare spongiforme encefalopati prioner i deres avføring til sykdomsfrie områder. Vi detalj metoder som brukes for å avgjøre om mus-tilpasset skrapesyke prioner forbli smittsomme etter passering om fordøyelseskanalen av amerikanske kråker (Corvus brachyrhynchos), en vanlig forbruker av døde dyr.
Abstract
Infeksiøs prion (PrP Res) materialet er sannsynligvis årsaken til dødelig, nevrodegenerativ overførbar spongiform encefalopati (TSE) sykdommer en. Overføring av TSE-sykdommer, slik som kronisk wasting sykdom (CWD), er antatt å være fra dyr til dyr 2,3, så vel som fra miljøkilder 4-6. Åtseletere og rovdyr har potensial til å translocate PrP Res materiale gjennom forbruk og utskillelse av CWD-forurenset åtsler. Nyere arbeider har dokumentert passering av PrP Res materiale gjennom fordøyelsessystemet av amerikanske kråker (Corvus brachyrhynchos), en felles nordamerikanske gatefeier 7.
Vi beskriver prosedyrer som brukes til å dokumentere passering av PrP Res materiale gjennom amerikanske kråker. Crows ble gavaged med RML-belastning mus-tilpasset skrapesyke og deres avføring ble samlet 4 hr innlegg sonde. Kråke avføring ble deretter samlet og injisert intraperitonealt innC57BL / 6 mus. Musene ble overvåket daglig inntil de uttrykte kliniske tegn på muse skrapesyke og ble deretter avlives. Asymptomatiske mus ble fulgt til 365 dager etter vaksinasjonen. Western blot-analyse ble utført for å bekrefte sykdomsstatus. Resultatene viste at prioner forbli smittefarlig etter reiser gjennom fordøyelsessystemet til kråker og er til stede i avføringen, forårsaker sykdom hos test mus.
Introduction
Overførbare spongiforme encefalopatier (TSE) er dødelige smittsomme nevrodegenerative lidelser som påvirker dyreliv, husdyr og mennesker. Smittestoffet av TSE sykdommer ser ut til å være misfolded eller patogene isoformer (PrP Res) av prionproteiner en. Animal TSE sykdommer inkluderer chronic wasting disease (CWD) i hjort (Odocoileus hemionus), white-tailed deer (Odocoileus virginianus), elg (Cervus elaphus), og elg (Alces alces), skrapesyke hos sau og geit, bovin spongiform encefalopati ( BSE) i husdyr; overfør mink encefalopati hos oppdretts mink; feline spongiform encefalopati hos katter; eksotisk hovdyr spongiform encefalopati i eksotiske dyrehagen ruminates av familien Bovidae, og spongiform encefalopati hos ikke-menneskelige primater åtte. Den eneste menneske TSE sykdom, variant Creutzfeldt-Jakobs sykdom, er sjeldne og tenkte å bli kjøpt opp av forbruker PrP Res-contaminrerte mat ni. På samme måte kan BSE smitte mennesker hvis forurenset biff er fortært 10. Av alle TSE sykdommer, skrapesyke og CWD er de to eneste med selvbærende epidemier og kilder for smitte antas å være fra dyr til dyr 2,3,11 samt fra miljø kilder 4-6. Forskning tyder på at de fleste TSE sykdommer krever bemerkelsesverdige lengre inkubasjonsperioder fra naturlige eksponerings hendelser av PrP Res materialet til manifestasjon av kliniske tegn 2-4,6,8 og åpenbare arter barrierer minimere, men ikke eliminere muligheten for, uspesifikt overføring 12-14 .
Identifisere mekanismer for spredning av smittsomme prion (PrP Res) materialet er ekstremt viktig for å svare på spørsmål om hvordan TSE sykdommer beveger seg over landskapet. Eksperimentelle undersøkelser har antydet at insekter 15,16, fjørfe og svin 17, og amerikanske kråker (Corvus Brachyrhynchos) 7,18 er passive bærere eller dispersers av PrP Res materiale. Passering av PrP Res materiale gjennom fordøyelsessystemet til kråker har nylig blitt dokumentert, viser hvilken rolle de kan spille i spredning av TSE sykdommer 7. Disse resultatene gjør det plausibelt at kråker, en gatefeier, kan støte på, forbruke, og transportere infeksiøst materiale via avføring deponering, til sykdomsfrie områder.
Prosedyrene vi viser her ble brukt til å dokumentere passering av PrP Res materiale gjennom fordøyelsessystemet hos kråker, og vil i stor grad lette anvendelsen av disse metodene til andre åtseldyr og rovdyr-spesifikke modeller i relatert fremtidig forskning. I denne studien konvensjonelle metoder ble brukt for å undersøke en ukonvensjonelle midler for menneskehandel PrP Res materiale, som kan bidra til spredning og totale byrden av PrP Res materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vår protokollen er tilpasset fra en vi tidligere utgitt syv. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of the United States Department of Agriculture (USDA), dyre-og plantehelse Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).
En. Crow Gavaging
- Anslå passasjen tid av pseudohjernemateriale "gjennom fordøyelseskanalen av amerikanske kråker.
- Bland 5 ml tilberedt og egge hele egg med blått fargestoff og gavage en kråke ved hjelp av en sonde 2 i nålen (figur 1).
- Sjekk kråke hver 30 min til blå / grønn-farget avføring ikke lenger blir utskilt.
- Skaffe friske og dødssyke RML (Chandler stamme)-infiserte C57BL / 6 mus hjerner.
- Generere en 20% vekt / volum normal og infiserte mus-hjerne homogenate i en bullet blender homogenisator med 1xfosfatbufret saltvann (PBS), og glassperler, og sentrifuger ved 3000 xg i 1 min for å fjerne større partikler. Fjern supernatant og fortynnet med et likt volum av 1 x PBS for å generere en 10% vekt / volum i sterilt PBS. Fryse ved -80 ° C inntil nødvendig.
- 17 timer før sonde fjerne mat, men ikke vann, fra kråke penner.
- Tilfeldig fordele galer til behandlingsgrupper og oralt magerør hver galer med 5 ml av enten normal eller infisert musehjerne homogenat ved hjelp av en 2 i gavage nål.
- Transfer galer til enkeltmerder og samle og basseng alle avføring innenfor hvert bur for fire timers innlegget gavage (figur 2).
- Homogen sammenslåtte avføring for hver kråke i en bullet blender homogenizer med glassperler til en homogen konsistens er oppnådd. * Crow avføring er for det meste væske og kan blandes lett.
- For hver kråke, fortynne 500 mL av fekal homogenate inn 9,5 ml 1x PBS for et totalt volum på 10 ml.
- Sentrifuger fekal homogenate i 15 minutter ved 1400 xg og ekstraher supernatanten.
- For å minimalisere faren for en sekundær mikrobiell infeksjon, behandling av supernatanten med 1 pl av 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (Invitrogen, NY) per 100 ul av homogenatet deretter plassere under UV-lys ved romtemperatur i 20 min for å redusere Risikoen for viral og bakteriell forurensning. Etter UV-eksponeringen, sonicate prøver i et 3000 Mp sonicator ved innstilling 70 i 30 sekunder for å bryte membranen av eventuelle gjenværende mikrober.
2. Mus Pode
- Tilfeldig fordele mus til følgende behandlingsgrupper (Tabell 1):
- Gruppe 1 - Positive behandlings mus inokulert intraperitonealt (IP) med en ml av fekal homogenate fra kråker muntlig gavaged med 5ml infisert mus hjerner.
- Gruppe 2 - Negativ behandling mus inokulert IP med en ml av fekal homogenate fra kråker muntlig gavaged med 5ml normale mus hjerner.
- Fortynne infected og normal mus hjernen homogenate for grupper 3 og 4 til 1:100 w / v i 1x PBS.
- Gruppe 3 - Positiv kontroll mus inokulert IP med 1 ml av infiserte mus-hjerne-homogenat.
- Gruppe 4 - Negativ kontroll mus inokulert IP med en ml vanlig mus-hjerne homogenate.
| Behandling Gruppen | Antall dyr | |
| Gruppe 1 | Skrapesyke + Crow Avføring | 100 |
| Gruppe 2 | Skrapesyke - Crow Avføring | 25 |
| Gruppe 3 | Skrapesyke + Mouse Brain | 10 |
| Gruppe 4 | Skrapesyke - Mus Brain | 5 |
. Tabell 1 skrapesyke status inoculum (positivt +, negativ -) og antall dyr benyttet 7..
- Intraperitonealt vaksinere mus:
- Scruff mus ved rygg halsen pels med tommelen og pekefingeren og forsiktig rotere for å eksponere ventral side.
- Hev bakre enden av mus slik at hodet er litt lavere.
- Sett 25 G nål 1 cm gjennom huden, en cm lateralt for midtlinjen, og 1-2 cm anterior til sacroiliac felles ved hjelp av en nål-låsing sprøyte.
- Sprøyt en ml vaksinere sakte inn muse kroppens hulrom.
Tre. Mus Monitoring
- Monitor mus daglig inntil de uttrykker kliniske tegn på muse skrapesyke. Kliniske tegn kan inkludere: kyfose, ataksi, stiv hale, mangel på stell, avmagring, og apati.
- Resultat mus for hver av de seks kliniske tegn når synlige tegn er tydelig, der 0 = ingen synlig, 1 = moderat, og 2 = alvorlig.
- Avlive mus når totale daglige score for hvert tegn nå ≥ 8 for en dag, ≥ 6 sammenhengende i tre dager, eller på 365 dager etter vaksinasjonen (dpi).
- Slakte hjerner umiddelbart etter euthanasia og oppbevar ved -70 ° C.
- For å bekrefte en diagnose skrapesyke, fordøye hjerneprøver med 3 ul av en 50 ug / ml proteinase-K-løsning (PK) fortynnet på følgende måte: 3.1. pl PK, 12,5 mL av 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 pl av 1 x PBS i 30 min ved 45 ° C, og deretter inaktivere PK ved tilsetning av 8 pl loading buffer og inkubere prøvene ved 95 ° C i 5 min. Belastningsprøver bort på en 12% SDS-PAGE gel, electrophorese og overføring til Immobilon PVDF membran og blokken med 5% fettfri melk i 0,2% Tween 20 i PBS i 1 time ved romtemperatur. Deretter sonde med Bar224 anti-PrP monoklonalt antistoff konjugert til pepperrot peroksydase, fortynnet med Superblock, i 1 time ved romtemperatur. Skyll membran i 1 time med PBS 0,2% Tween 20. For å visualisere, ruge Western blot 5 min med chemiluminescent underlaget og bilde på en G-box gel dokumentasjonssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåtene som benyttes demonstrere at fordøyelsessystemet kråke ikke eliminere PrP Res infectivity 4 timer etter oral gavage med skrapesyke hjerne homogenat 7.. Alle tjue kråker som ble gavaged med PrP Res materialet senere overført PrP Res materialet via avføring til mus. Syke mus ble identifisert av manifestasjon av kliniske mus-skrapesyke tegn og sykdom bekreftelse ble fullført av Western blot analyse.
Undersøkelse av retensjonstiden for materialet inntas av galer viste passasje tid gjennom fordøyelseskanalen etter en gavaged kråke å være 4 timer, basert på tilstedeværelsen av fargestoff i feces (figur 1). Alle avføring ble samlet inn med engangs pipetter og samlet for hver kråke (figur 2). Akutt toksisitet fra ubehandlede kråke avføring skjedde da rå fecal supernatant ble injisert IP inn i pilottest mus. Ved å behandle fekal inokulere med penicillin og streptomycin, UV-lys, og lydbehandling vi lette dette problemet.
Alle mus inokulert med enten skrapesyke-positive musehjerne (9/9) eller avføring fra skrapesyke-inokulert galer (66 * / 84) som er utviklet kliniske tegn og testet positive ved Western blot-analyse (Figur 3), noe som illustrerer at skrapesyke lett føres gjennom Fordøyelsessystemet av kråker og forårsaket sykdom. * Atten mus døde innen tre dager etter vaksinasjonen, trolig på grunn av toksisitet. Alle bortsett fra ett (1/23) skrapesyke-negative inokulert mus var negativ med Western blot analyse. Vi hypotese at denne musen utilsiktet ble inokulert med skrapesyke-positive kråke avføring i stedet for avføring fra en skrapesyke-negative kråke.
Figur 1. Crow manuelt behersket og muntlig gavaged med 5 ml av hele egg blandet med blått fargestoff (A) og blue / grønn-farget avføring 4 hr innlegg gavage (B). Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Crow avføring samling med pipette før homogenisering. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. . Representant SDS-Page Western blot av mus hjernen fra bioassay NBH-normal mus hjernen homogenate, skrapesyke-negative, TX bur 4 - hjernen fra en mus inokulert med avføring fra en skrapesyke-inokulert kråke. Med (+) og uten å måttet (-). PK (proteinase K) fordøyelsen Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser en prosedyre for å dokumentere passering av PrP Res materiale gjennom fordøyelsessystemet til kråkene. Vi har benyttet konvensjonelle fremgangsmåter for å bestemme om galer har evnen til å translocate PrP Res materialet til sykdomsfrie geografiske områder. Andre har evaluert motstand av PrP Res til drøvtyggere 19-21 og gnager 22,23 fordøyelsesvæsker, som begge klarte å eliminere den. Fremtidig bruk av disse teknikkene skal brukes til andre rovdyr 24 som de kunne også potensielt støte PrP Res materiale i åtsel og transportere dette materialet over landskapet til rette for spredning av prionsykdommer.
Vi har lagt blå konditorfarge til vår scrambled egg 'pseudo hjernen "materiale, som gir en enkel måte å vurdere omtrentlig passasje tiden av homogenisert mus hjernen gjennom fordøyelseskanalen av kråker. Vi anbefaler andre som vurderer denne teknikken til første insPECT eksisterende avføring farge av studie dyr og deretter bruke konditorfarge som er mest kontraster. Dette vil gi rom for enkel identifisering av mat farge farget materiale som har gått gjennom studie dyr. Vi valgte å bruke konditorfarge til å anslå passasjen tid, men andre har brukt fluoriserende pigment 25, jernoksid 26, fargede plastmarkører 27, og fargede metallflak (dvs. glitter) 28.
Minimere trusselen om en sekundær mikrobiell smitte fra kråke avføring og riktig å vaksinere mus er sentrale utgangspunkter for mus-prion studier som krever lange inkubasjonsperioder. Hvis en av disse hensynene blir krenket, er dødeligheten tidlig mus sannsynligvis føre.
En annen mulig verktøy for etterforskning er serie protein misfolding syklisk forsterkning eller sPMCA å evaluere kråke fecal prøver over tid for å etablere hvor lenge etter oral sonde kråker passere smittefarlig materiale, medut behovet for en mus bioassay. Nylige fremskritt i PMCA fekal analyse av Pulford, et al. Indikerer at forsterkning av minutt nivåer av prioner kan påvises i pattedyr avføring 29, noe som tyder PMCA kan også være et nyttig verktøy for å evaluere avian avføring. Musen bioassay og sPMCA tilnærming kan brukes til å evaluere gjenværende smitte i avføring av kråker gavaged med CWD-infisert materiale. En cervidized transgene mus linje ville være nødvendig, og intracerebral versus intraperitoneal inokulering vil gi raskere resultater.
Avian åtseletere, som kråker, gribber, og ørn, kan spille en rolle i spredningen av TSE sykdommer, nemlig CWD i Nord-Amerika. Disse artene kan konsumere CWD-positive vev fra syke skrotter eller innvoller (i tilfelle av jeger-drepte hjortevilt) og translocate smittefarlig materiale i deres avføring til CWD frie områder eller populasjoner av hjortevilt. Som praksisen med fôring korn til hjortevilt, i vill eller fangenskapinnstillinger, tiltrekker seg kråker som kan defekt på matkilde og være utilsiktet forbrukes av hjortevilt, er dermed en høy-risiko praksis (Vercauteren personlig observasjon). Videre, selv om oddsen for CWD-frie dyr opplever PrP Res materiale gjennom tilfeldig avføring deponering kan være lav, områder hvor kråker og dermed deres avføring er konsentrert, som under felles roosting områder, kunne bli av høyrisikoområder for smitteoverføring siden prioner er så vedvarende i miljøet 30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke S. Werner for å gi kråkene brukt i denne studien og USDA, APHIS, WS, NWRC dyr omsorg ansatte for dyr omsorg og oppfølging. Nevn eller bruk av et produkt innebærer ikke USDA påtegning. Finansiering for denne studien ble gitt av USDA, APHIS, Veterinary Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RML Chandler strain mouse-adapted scrapie | Rocky Mountain Laboratories | ||
| RC57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals | ||
| American crows | wild captured | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | |
| Sonicator | Misonix | ||
| Proteinase-K solution | Roche | 3115887001 | |
| Loading buffer | Invitrogen | NP0007 and 0009 | |
| Bis-tris SDS PAGE 12% gel | Invitrogen | NP0342 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | 1SEQ00010 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Bullet blender homogenizer | Braintree Scientific | BBX24B | |
| 2.3 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079125Z | |
| Bar224 anti-PrP monoclonal antibody | Cayman Chemical | 10009035 | |
| Superblock | Thermo Scientific | 37517 | |
| chemiluminescent substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| G-box gel documentation system | Syngene |
References
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
- Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
- Sigurdson, C. J., Adriano, A. Chronic Wasting Disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).
- Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
- Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916 (2009).
- VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774 (2012).
- Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26 (2006).
- Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
- Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
- Collinge, J. The risk of prion zoonoses. Science. 335 (6067), 411-413 (2012).
- Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
- Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
- Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114 (1996).
- Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
- Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
- Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
- Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
- Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
- Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
- Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
- Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4 (2009).
- Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
- Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
- Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
- Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
- Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
- Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
- Aldous, S. E. Winter habits of crows in Oklahoma. Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).
