Summary
该协议允许使用 96 井微蒂板直接比较浮石和生物膜耐药性，以识别细菌菌株 ，从而在体外 形成生物膜。浮游生物或生物膜细菌暴露在首选抗菌剂的连续稀释中。活力被阿加板块的生长所测定。
Abstract
该协议允许浮石和生物膜耐药性之间的直接比较的细菌菌株，可以形成一个生物膜 体外。细菌被接种到96井微质板的井中。在浮游生物检测中，选择的抗菌剂的连续稀释被添加到细菌悬浮剂中。在生物膜检测中，一旦接种，细菌就会在一定的时间内形成生物膜。未连接的细胞从井中去除，媒体补充，并添加选择的抗菌剂的连续稀释。接触抗菌剂后，浮石细胞被检测为生长。对于生物膜检测，媒体刷新了缺乏抗菌剂的新鲜介质，生物膜细胞有留给恢复。生物膜细胞的生存能力在恢复期后被检测。抗菌剂的MBC-P被定义为杀死浮石培养细胞的药物浓度最低。 相比之下，菌株的 MBC-B 通过将预制生物膜暴露在 24 小时内抗菌剂浓度增加的程度来确定。MBC-B 被定义为杀死生物膜中细胞的抗菌剂的最低浓度。
Introduction
抗生素耐药性检测最初是为了检测浮游生物（自由游泳）细菌培养物的耐药性而开发的。由于许多细菌感染涉及生物膜（表面连接细胞），我们有兴趣开发一种检测生物膜特异性抗生素耐药性的方法。然而，大多数抗生素耐药性检测不适合测量生物膜的耐药性。例如，确定最低抑制浓度（MIC）是确定浮石细菌培养物 1抗生素耐药性的黄金标准。这种检测需要将稀释的浮石培养物与稀释系列抗生素混合。 抑制浮石细胞可见生长的抗生素浓度是MIC。由于这种检测依赖于对生长的抑制，根据定义，它不能与生物膜培养物配合使用，这需要检查预生生物膜中细胞的抗生素敏感性。此处描述的 MBC-B 检测结果不是测量生长抑制，而是确定杀死生物膜中已有细胞的抗生素浓度。因此，这种检测旨在模仿已建立的生物膜感染的抗生素治疗，并提供一个更相关的视野 中的细菌抗生素耐药性。
由于生物膜通常比浮石培养物2-4更具抗生素耐药性，因此有必要设计出一种将生物膜的抗生素耐药性与浮石培养物直接相关的方法。因此，这种方法的另一个目标是能够直接比较浮石细胞和生物膜细胞之间的抗生素耐药性水平。此处描述的 MBC-P 和 MBC-B 分析使这一点成为可能，因为细胞是在类似条件下培养的。我们利用这种方法研究了几个对生物膜特异性抗生素耐药性很重要的基因。
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Protocol
1. MBC-B
-
种植生物膜（改编自奥图尔9）。
- 在 37 °C 的丰富介质中种植野生型兴趣菌株和突变菌株，持续 16 小时。
- 将饱和的隔夜培养物 1：100 稀释到新的耐药性检测介质中。 P. aeruginosa 的标准介质是 M63 最小介质，辅以硫酸镁和精氨酸（见 表 1）。这种介质刺激形成更坚固的生物膜。
- 在 96 井微蒂特菜中加入每口井稀释 100μl（见 表 1）。由于这些检测通常以三份执行，因此每个菌株应有 24 口井。
- 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
-
将预制生物膜暴露在抗生素的浓度梯度下
- 为 7 口井准备 10 倍稀释系列抗生素。示例：对于抗生素托霉素，井中的最终浓度为 0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 和 0.006 毫克/毫升 5-8。 从25毫克/毫升的库存中，准备10倍稀释4，2，1，0.5，0.25，0.125和0.06毫克/毫升。留在冰上
- 使用多通道移液器取出已用的超自然（包含浮游生物细胞）（见表1）。
- 在所有油井中加入 90 微升 M63 （Mg/Arg）。
- 每10倍抗生素浓度中加入10微克，以达到所需的最终浓度。为每个复制品和菌株添加 10 μl 水（无抗生素控制）到最终井中。
- 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
-
刷新媒体，并允许活细胞分离。
- 使用多通道移除已用的超自然（包含浮游生物细胞）。
- 在所有油井中加入 115 微升 M63 （Mg/Arg）。
- 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
-
活细胞的检测。
- 标记每个 96 井微蒂特板的两个 LB agar 板。
- 通过将爪子浸入 100% 乙醇中并将爪子穿过 Bunsen 燃烧器的明火，对多管设备（见 表 1）进行消毒。重复。让爪子稍微冷却一下。使用多管齐下装置，将浮石培养物的~3 μl（通常保留在爪尖上的量）从微蒂特板的每口井转移到LB agar板的表面。
- 在37°C下孵化LB agar板16小时。
- 通过眼睛识别细菌生长的切口（图1），确定抗生素的杀菌浓度最低。
2. MBC-P
-
准备细菌菌株
- 在 37 °C 的丰富介质中种植野生型兴趣菌株和突变菌株，持续 16 小时。
- 将饱和的隔夜培养物 1：100 稀释到新的耐药性检测介质中。P. aeruginosa的标准介质是 M63 最小介质，辅以硫酸镁和精氨酸（见表 1）。
- 在 96 井微蒂菜中加入每口井稀释 90μl（见表 1）。由于这些检测通常以三份执行，因此每个菌株应有 24 口井。
-
将浮石细胞暴露在抗生素的浓度梯度上
- 为 7 口井准备 10 倍稀释系列抗生素。示例：对于抗生素托霉素，井中的最终浓度为 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 和 0.0005 毫克/毫升。从25毫克/毫升的库存中，准备稀释0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01和0.005毫克/毫升。留在冰上
- 每10倍抗生素浓度中加入10微克，以达到所需的最终浓度。为每个复制品和菌株添加 10 μl 水（无抗生素控制）到最终井中。
- 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
-
活细胞的检测。
- 标记每个 96 井微蒂特板的两个 LB agar 板。
- 通过将爪子浸入 100% 乙醇中并将爪子穿过 Bunsen 燃烧器的明火，对多管设备（见 表 1）进行消毒。重复。让爪子稍微冷却一下。使用多管齐下装置，将浮石培养物的~3 μl（通常保留在爪尖上的量）从微蒂特板的每口井转移到LB agar板的表面。
- 在37°C下孵化LB agar板16小时。
- 通过眼睛识别细菌生长的切断（图2），确定抗生素的细菌浓度最低。
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Representative Results
进行了 MBC-P 和 MBC-B 检测，比较了 PA14 野生类型的灵敏度与 PA14 ∆ndvB。托布拉霉素被用作抗生素。结果与步骤 1.4.4（图 1）和步骤 2.3.4（图 2）相对应。PA14 和∆ndvB 接种到 MBC-P 和 MBC-B 三方检测中。在完成 MBC-B 协议的第 1.0-1.4 步和 MBC-P 协议的步骤 2.0-2.3 后，可行单元被镀在 LB agar 板上。细胞左侧显示托布拉霉素（μ克/毫升）的浓度。PA14 的 MBC-B 为 100 μg/ml，∆ndvB 的 MBC-B 为 12.5 μg/ml。PA14 和∆ndvB 突变体的 MBC-P 为 8 μg/ml。
图1。具有代表性的结果来自 Mbc - b 检测与 Pa14 野生类型 vs. Pa14 ∆ndvb和托布拉霉素。值是指托布拉霉素（μg/ml）的最终浓度。
图2。具有代表性的结果来自 Mbc - p 检测与 Pa14 野生类型 vs. Pa14 ∆ndvb和托布拉霉素。值是指托布拉霉素的最终浓度（μ克/毫升）。
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Discussion
浮石细胞中的抗生素耐药性被定义为由于细胞的永久变化（如 突变）而增加抗生素的最低抑制浓度 （MIC）。迄今已查明的生物膜特异性抗性或耐受性机制是生物膜中野生类型基因表达的结果。因此，抗药性的经典定义不适用于生物膜。然而，另一组定义已经提出：耐药性机制阻止抗生素进入其目标，而耐受性机制关闭抗生素的目标10。生物膜特异性抗生素耐药性机制包括这两个定义。在整个协议中使用了"电阻"一词，但必须进行进一步实验，以确定基因是否有助于抵抗或耐受性。
MBC-P 和 MBC-B 检测可能适用于任何生物膜形成细菌菌株和任何杀菌抗菌剂。使这种检测适应其他细菌和其他抗菌剂的两个重要标准是确定导致生物膜形成的条件，并使用野生类型的感兴趣菌株确定抗菌剂的适当浓度范围。适当的生物膜形成条件可以确定使用乔夫生物膜形成协议公布的乔治奥图尔9。为了确定 MBC-B 测定合适的浓度范围，一个很好的经验法则是使用 25 x MIC（最小抑制浓度11）作为范围的中间浓度，并相应地进行调整。对于 MBC-P 检测，使用 MBC-B 测定所标识值的 1/10。目标是定义一系列浓度，使野生型菌株的 MBC-B 与敏感突变菌株之间有明显的差异。因此，该范围的高端应接近野生型菌株的 MBC-B。我们重复这个实验至少三次，每个菌株至少给出9个数据点。
这些检测中最关键的步骤是避免污染。为了防止菌株之间的污染，应在菌株之间留一个空柱。另一个关键步骤是留出足够的时间让多管设备上的金属爪冷却到足够。这可以通过燃烧爪子、定时冷却期和用手快速触摸爪子来测试。
如果接触抗生素后细胞从生物膜中分离是个问题，则可以修改 MBC-B 方法以包括声波步骤。跳过步骤 1.3.3（添加新介质后 24 小时孵化）。相反，在加入115 微量新介质（步骤1.3.2）后，用无菌胶板密封和声波板覆盖96井微晶板的井，将生物膜细胞从井壁中分离出来。使用水浴声波器。必须事先确定从塑料中有效去除生物膜细胞的具体条件（时间、强度）。
MBC-B的变种用于筛选一个库，该库由4，000个插入P.aeruginosa的转子插入突变体进行生物膜特异性抗生素耐药突变体。选择了一种浓度为托布拉霉素（50微克/毫升），不会杀死野生类型的生物膜细胞，但可以识别比野生生物膜敏感3倍的突变体。每口井没有用一种特定的细菌来接种井柱，而是接种了不同的突变体。突变体被留在形成一个生物膜，暴露在50 μ克/毫升的托布拉霉素，离开从布拉霉素暴露恢复，然后检测生存能力。在相同的筛查条件下，对未能存活50 μ克/毫升的抗霉素的突变体进行了重新测试。利用MBC-P和MBC-B协议来确认突变体的对肌霉素敏感表型。
还有其他方法来检测生物膜中的抗生素耐药性， 即 在生物反应器12，13中生长的殖民地生物膜和生物膜。这些方法要费力得多，而且菌株数量有限，很容易被检测。因此，MBC-B在这些其他方法上的优势是，它具有高通量，允许研究人员进行筛选或检测几个菌株，以及几个不同的抗生素浓度一次。
| 试剂的名称 | 公司 | 目录编号 | 评论（可选） |
| 1x M63 | 通过溶解 15 g KH2PO 4、35 g K2HPO4和 10 g （NH4）2SO4在 1 L 水中作为 5x M63 库存做好准备。此库存无需自动切割，可在室温下存储。 稀释 5x 库存 1：5，高压灭菌，冷却，然后添加所需的组件。 | ||
| KH2PO4 | 渔夫 | P285-500 | |
| K2HPO4 | 渔夫 | P288-500 | |
| （NH4）2SO4 | 西格马 | A5132 | |
| 硫酸镁 | 渔夫 | M63-500 | 添加到1mM最终浓度。 准备作为1M股票在水中和高压灭菌器。 |
| 托布拉米辛 | 西格马 | 准备50毫克/毫升库存。阿里报价和存储在-20°C。 | |
| 精氨酸 | 西格马 | A5131 | 增加 0.4% 的最终浓度。 准备作为20%的库存在水中和过滤器消毒。 这种替代碳/能源可以取代葡萄糖和木糖酸 |
| 96 井微蒂特板 | 康宁 | 3595 | 无菌，平底，低蒸发 |
| 特兰弗佩特（多通道移液器） | 品牌科技 | 2703610 | 8 通道， 20-200 μl |
| 多管设备 | 丹-卡尔 | MC48 | 48 个钳子适合 96 井微蒂板的 1/2 |
表1。
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Disclosures
提交人宣称她没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢李章、李贤志、阿龙·欣兹和克莱顿·霍尔对这份手稿的编辑帮助。这种检测最初是在达特茅斯盖塞尔医学院乔治·奥图尔的实验室中开发的。Mah博士实验室的研究得到了加拿大自然科学和工程研究理事会和加拿大囊性纤维化研究理事会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
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