Etablering af minimal baktericidkoncentration af et antimikrobielt middel til planktoniske celler (MBC-P) og biofilmceller (MBC-B)

Summary

Denne protokol giver mulighed for en direkte sammenligning mellem planktonisk og biofilmresistens for en bakteriestamme, der kan danne en biofilm in vitro ved hjælp af en 96-brønds mikrotiterplade. Planktoniske eller biofilmbakterier udsættes for serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel. Levedygtigheden dæmpes af vækst på agarplader.

Abstract

Denne protokol giver mulighed for en direkte sammenligning mellem planktonisk og biofilmresistens for en bakteriestamme, der kan danne en biofilm in vitro. Bakterier er podet ind i brøndene i en 96-godt mikrotiter plade. I tilfælde af planktonisk analyse tilsættes serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel til bakterieophængene. I biofilmanalysen, når de er podet, overlades bakterierne til at danne en biofilm over en bestemt periode. Ikke-vedhæftede celler fjernes fra brøndene, mediet genopfyldes, og der tilsættes serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel. Efter udsættelse for antimikrobielt middel analyseres planktoncellerne for vækst. For biofilmanalysen opdateres medierne med friske medier, der mangler antimikrobielt middel, og biofilmcellerne er overladt til at komme sig. Biofilmcelles levedygtighed analyseres efter genfindingsperioden. MBC-P for antimikrobielt middel er defineret som den laveste koncentration af stof, der dræber cellerne i planktonkulturen.  I modsætning hertil bestemmes MBC-B for en stamme ved at udsætte præformerede biofilm for stigende koncentrationer af antimikrobielt middel i 24 timer. MBC-B defineres som den laveste koncentration af antimikrobielt middel, der dræber cellerne i biofilmen.

Introduction

Antibiotikaresistens assays blev oprindeligt udviklet til at analysere resistens planktoniske (fri-svømning) kulturer af bakterier. Da mange bakterielle infektioner involverer biofilm (overflade-vedhæftede celler), var vi interesseret i at udvikle en metode til at analysere biofilm-specifikke antibiotikaresistens. Men de fleste antibiotikaresistens assays er dårligt egnet til måling af resistens af biofilm. For eksempel er bestemmelse af den minimale hæmmende koncentration (MIC) guldstandarden til bestemmelse af antibiotikaresistens af planktoniske bakteriekulturer ¹. Denne analyse indebærer blanding af en fortyndet planktonisk kultur med en fortynding serie af antibiotika.  Koncentrationen af antibiotika, der hæmmer den synlige vækst af planktoniske celler er MIC. Da denne analyse er afhængig af hæmning af vækst, kan den pr. definition ikke fungere med biofilmkulturer, hvilket kræver undersøgelse af cellernes antibiotikafølsomhed i en forgroet biofilm. I stedet for at måle væksthæmmende, MBC-B assay beskrevet her bestemmer koncentrationen af antibiotika, der dræber celler, der allerede findes i en biofilm. Således har denne analyse til formål at efterligne antibiotikabehandlinger af etablerede biofilminfektioner og give et mere relevant billede af bakteriel antibiotikaresistens in vivo.

Da biofilm generelt er mere antibiotikaresistente end planktoniske kulturer ^2-4 , var det nødvendigt at udtænke en metode, der direkte relaterer antibiotikaresistensen af en biofilm til en planktonisk kultur. Et andet mål med denne metode er således at være i stand til direkte at sammenligne niveauet af antibiotikaresistens mellem planktoniske og biofilmceller. De MBC-P og MBC-B assays, der er beskrevet her, gør dette muligt, fordi celler dyrkes under lignende forhold. Vi har brugt denne metode til at studere flere gener, der er vigtige for biofilmspecifik antibiotikaresistens ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B

1. Dyrkning af en biofilm (tilpasset fra O'Toole⁹).
   1. Der dyrkes en kultur af den vilde stamme af interesse og mutantstamme i 16 timer i et rigt medium ved 37 °C.
   2. Fortynd den mættede natten kulturer 1:100 i frisk medium for antibiotikaresistens assays. Et standardmedium til P. aeruginosa er M63 minimalt medium suppleret med magnesiumsulfat og arginin (se tabel 1). Dette medium stimulerer dannelsen af en mere robust biofilm.
   3. Der tilsættes 100 μl af fortyndingen pr. brønd i en mikrotynding med 96 brønde (se tabel 1). Da disse assays typisk udføres i tre eksemplarer for hver stamme, bør der være 24 brønde af hver stamme.
   4. Mikrotiterpladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
2. Udsætte den præformerede biofilm for en koncentrationsgradient af antibiotika
   1. Forbered en 10x fortynding serie af antibiotika til 7 brønde. Eksempel: For antibiotika tobramycin er de endelige koncentrationer i brøndene 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 og 0,006 mg/ml ^5-8 . Af en bestand på 25 mg/ml fremstilles 10x fortyndinger på 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 og 0,06 mg/ml. Lad det stå på is.
   2. Den brugte supernatant (indeholdende planktoniske celler) fjernes ved hjælp af en flerkanalpipette (se tabel 1).
   3. Der tilsættes 90 μl M63 (Mg/Arg) til alle brøndene.
   4. Der tilsættes 10 μl af hver 10x antibiotikakoncentration for at opnå de ønskede endelige koncentrationer. Der tilsættes 10 μl vand (ingen antibiotikakontrol) til den endelige brønd for hver replikat og stamme.
   5. Mikrotiterpladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
3. Forfriskende medierne og giver mulighed for løsrivelse af levende celler.
   1. Fjern den brugte supernatant (indeholdende planktoniske celler) ved hjælp af en multikanalpipette.
   2. Der tilsættes 115 μl M63 (Mg/Arg) til alle brøndene.
   3. Mikrotiterpladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
4. Analyse for levende celler.
   1. Mærke to LB agar plader pr 96-godt microtiter plade.
   2. Multiprong-enheden steriliseres (se tabel 1)ved at dyppe benene i 100% ethanol og passere benene over en Bunsen-brænders åbne ild. gentage. Lad benene køle lidt af. Ved hjælp af multiprong-enheden overføres ~ 3 μl (beløb, der typisk tilbageholdes på spidsen af grenen) af planktonisk kultur fra hver brønd af mikrotiterpladen til overfladen af en LB agarplade.
   3. LB-agarpladerne inkuberes i 16 timer ved 37 °C.
   4. Den minimale bakteriekoncentration af antibiotika bestemmes ved med øjet at identificere afskæringen for bakterievækst (figur 1).

2. MBC-P

1. Forberedelse af bakteriestammer
   1. Der dyrkes en kultur af den vilde stamme af interesse og mutantstamme i 16 timer i et rigt medium ved 37 °C.
   2. Fortynd den mættede natten kulturer 1:100 i frisk medium for antibiotikaresistens assays. Et standardmedium til P. aeruginosa er M63 minimalt medium suppleret med magnesiumsulfat og arginin (se tabel 1).
   3. Der tilsættes 90 μl af fortyndingen pr. brønd i en mikrotynderret med 96 brønde (se tabel 1). Da disse assays typisk udføres i tre eksemplarer for hver stamme, bør der være 24 brønde af hver stamme.
2. Udsætte planktoniske celler for en koncentration gradient af antibiotika
   1. Forbered 10x fortynding serie af antibiotika til 7 brønde. Eksempel: For antibiotika tobramycin er de endelige koncentrationer i brøndene 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 og 0,0005 mg/ml. Fra en bestand på 25 mg/ml fremstilles fortyndinger på 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 og 0,005 mg/ml. Lad det stå på is.
   2. Der tilsættes 10 μl af hver 10x antibiotikakoncentration for at opnå de ønskede endelige koncentrationer. Der tilsættes 10 μl vand (ingen antibiotikakontrol) til den endelige brønd for hver replikat og stamme.
   3. Mikrotiterpladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
3. Analyse for levende celler.
   1. Mærke to LB agar plader pr 96-godt microtiter plade.
   2. Multiprong-enheden steriliseres (se tabel 1)ved at dyppe benene i 100% ethanol og passere benene over en Bunsen-brænders åbne ild. gentage. Lad benene køle lidt af. Ved hjælp af multiprong-enheden overføres ~ 3 μl (beløb, der typisk tilbageholdes på spidsen af grenen) af planktonisk kultur fra hver brønd af mikrotiterpladen til overfladen af en LB agarplade.
   3. LB-agarpladerne inkuberes i 16 timer ved 37 °C.
   4. Den minimale baktericide koncentration af antibiotika bestemmes ved med øjet at identificere afskæringen for bakterievækst (figur 2).

Representative Results

MBC-P og MBC-B assays blev udført, sammenligne følsomhed PA14 vilde type med PA14 ∆ndvB. Tobramycin blev brugt som antibiotikum. Der præsenteres resultater svarende til trin 1.4.4 (figur 1) og trin 2.3.4 (figur 2). PA14 og ∆ndvB blev podet ind i MBC-P og MBC-B assays i tre eksemplarer. Efter at have fuldført trin 1.0-1.4 i MBC-B-protokollen og trin 2.0-2.3 i MBC-P-protokollen blev de levedygtige celler belagt på en LB agarplade. Koncentrationer af tobramycin (μg/ml) er angivet til venstre for cellerne. MBC-B for PA14 er 100 μg/ml, og MBC-B for ∆ndvB er 12,5 μg/ml. MBC-P for både PA14 og ∆ndvB mutant er 8 μg/ml.

Figur 1. Repræsentative resultater fra en MBC-B analyse med PA14 vilde type vs PA14 ∆ndvB og tobramycin. Værdierne henviser til den endelige koncentration af tobramycin (μg/ml).

Figur 2. Repræsentative resultater fra en MBC-P analyse med PA14 vilde type vs PA14 ∆ndvB og tobramycin. Værdierne henviser til den endelige koncentration af tobramycin (μg/ml).

Discussion

Antibiotikaresistens i planktoniske celler defineres som en stigning i den minimale hæmmende koncentration (MIC) af et antibiotikum på grund af en permanent ændring i cellerne(f.eks. en mutation). Mekanismerne for biofilmspecifik resistens eller tolerance, der er blevet identificeret til dato, er resultatet af ekspressionen af vilde typegener i biofilm. Den klassiske definition af resistens gælder således ikke for biofilm. Der er imidlertid blevet fremlagt et andet sæt definitioner: Resistensmekanismer forhindrer antibiotikaet i at få adgang til sit mål, mens tolerancemekanismer lukker målene for antibiotika¹⁰. Biofilmspecifikke antibiotikaresistensmekanismer omfatter begge disse definitioner. Udtrykket "resistens" er blevet anvendt i hele denne protokol, men der skal udføres yderligere forsøg for at afgøre, om et gen bidrager til resistens eller tolerance.

MBC-P- og MBC-B-assays kan tilpasses enhver biofilmdannende bakteriestamme og ethvert bakteriemiddel modmikrobielt middel. De to vigtige kriterier for tilpasning af denne analyse til andre bakterier og andre antimikrobielle stoffer er fastsættelsen af forhold, der fører til biofilmdannelse, og bestemmelse af et passende interval af koncentrationer for antimikrobielt middel ved hjælp af den vilde type stamme af interesse. Korrekt biofilm-dannelse betingelser kan bestemmes ved hjælp af en JoVE biofilm dannelse protokol udgivet af George O'Toole⁹. For at bestemme et passende koncentrationsområde for MBC-B-analysen er en god tommelfingerregel at anvende 25 x MIC (minimal hæmmende koncentration¹¹) som mellemkoncentrationen i området og justere i overensstemmelse hermed. For MBC-P assay, brug 1 / 10 af de værdier, der er identificeret for MBC-B assay. Målet er at definere en række koncentrationer, der giver mulighed for en klar forskel mellem MBC-B af den vilde type stamme og en følsom mutant stamme. Således bør den øverste ende af området være tæt på MBC-B af den vilde type stamme. Vi gentager dette eksperiment mindst tre gange, hvilket giver mindst 9 datapunkter pr. stamme.

Det mest kritiske trin i disse assays er at undgå forurening. For at undgå kontaminering mellem stammer skal der være en tom kolonne mellem stammerne. Et andet kritisk skridt er at give nok tid til, at metalstængerne på multiprong-enheden kan køle nok af. Dette kan testes ved at flamme benene, timingkølingsperioden og hurtigt røre benene med hænderne.

Hvis løsrivelse af cellerne fra biofilmen efter udsættelse for antibiotika er et problem, kan MBC-B-metoden ændres til at omfatte et sonikeringstrin. Spring trin 1.3.3 over (24 timers inkubation efter tilsætning af friske medier). I stedet dække brøndene på 96-brønds mikrotiterpladen efter tilsætning af 115 μl frisk media (trin 1.3.2) med steril klæbepladeforsegling og sonisk plade for at løsne biofilmceller fra brøndenes vægge. Brug en vandbad sonicator. Specifikke betingelser (tid, intensitet) for effektiv fjernelse af biofilmceller fra plasten skal fastlægges på forhånd.

En variation af MBC-B blev brugt til at screene et bibliotek med 4.000 transposon-indsættelse mutanter af P. aeruginosa for biofilm-specifikke antibiotikaresistens mutanter. Der blev valgt en koncentration af tobramycin (50 μg/ml), som ikke ville dræbe biofilmceller af vild type, men som ville gøre det muligt at identificere mutanter, der var 3 gange mere følsomme end biofilm af vild type. I stedet for at vaccinere kolonner af brønde med en bestemt stamme af bakterier, blev hver brønd podet med en anden mutant. Mutanterne blev overladt til at danne en biofilm, udsat for 50 μg / ml tobramycin, overladt til at komme sig efter tobramycin eksponering og derefter analyseret for levedygtighed. Mutanter, der ikke overlevede 50 μg/ml tobramycineksponering, blev testet igen under de samme screeningsbetingelser. MBC-P- og MBC-B-protokollerne blev brugt til at bekræfte mutanternes tobramycinfølsomme fænotyper.

Der findes andre metoder til at analysere antibiotikaresistens i biofilm, dvs. Disse metoder er betydeligt mere besværlige og begrænsede i antallet af stammer, der let kan analyseres. Således er en fordel, at MBC-B har over disse andre metoder er, at det er høj-gennemløb, så forskeren til at foretage skærme eller til at analysere flere stammer, samt flere forskellige antibiotika koncentrationer på én gang.

Reagensets navn	firma	Katalognummer	Kommentarer (valgfrit)
1x M63			Forbered som en 5x M63 bestand ved at opløse 15 g KH2PO4,35 g K2HPO4 og 10 g (NH4)2SO4 i 1 L vand. Denne bestand behøver ikke at være autoklaveret og kan opbevares ved stuetemperatur.  Fortynd 5x lager 1:5, autoklave, cool, tilsæt derefter de ønskede komponenter.
KH2PO4	fisker	P285-500
K2HPO4	fisker	P288-500
(NH4) 2 1 1 1 SÅ4	Sigma	A5132
Magnesiumsulfat	fisker	M63-500	Tillægges 1 mM endelig koncentration.  Forbered dig som en 1 M bestand i vand og autoklave.
Tobramycin	Sigma		Der fremstilles 50 mg/ml lager. Aliquot og opbevares ved -20 °C.
Arginin	Sigma	A5131	Der tilsættes en endelig koncentration på 0,4 %.  Forbered dig som en 20% bestand i vand og filter steriliseres.  Denne alternative kulstof-/energikilde kan erstatte glukose- og casaminosyrer
96-brønds mikrotiter plader	Corning	3595	Steril, fladbundet, lav fordampning
Tranferpette (flerkanalpipette)	BrandTech	2703610	8-kanals, 20-200 μl
Enhed med flere ben	Dan-Kar	MC48	48 ben passer ind i 1/2 af en 96-brønds mikrotiter plade

Tabel 1. 

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate