Summary
Dit protocol maakt een directe vergelijking mogelijk tussen planktonische en biofilmresistentie voor een bacteriestam die een biofilm in vitro kan vormen met behulp van een 96-put microtiterplaat. Planktonische of biofilmbacteriën worden blootgesteld aan seriële verdunningen van het antimicrobiële middel naar keuze. De levensvatbaarheid wordt beoordeeld door de groei op agarplaten.
Abstract
Dit protocol maakt een directe vergelijking mogelijk tussen planktonische en biofilmresistentie voor een bacteriestam die in vitroeen biofilm kan vormen . Bacteriën worden ingeënt in de putten van een 96-wells microtiterplaat. In het geval van de planktonische assay worden seriële verdunningen van het antimicrobiële middel van keuze toegevoegd aan de bacteriële suspensuspensus. In de biofilmtest, eenmaal ingeënt, worden de bacteriën gedurende een bepaalde periode een biofilm laten vormen. Niet-gebonden cellen worden uit de putten verwijderd, de media worden aangevuld en seriële verdunningen van het antimicrobiële middel naar keuze worden toegevoegd. Na blootstelling aan het antimicrobiële middel worden de planktonische cellen voor groei afgetest. Voor de biofilmtest worden de media vernieuwd met verse media zonder antimicrobieel middel en worden de biofilmcellen achtergelaten om te herstellen. De levensvatbaarheid van biofilmcellen wordt na de herstelperiode beoordeeld. De MBC-P voor het antimicrobiële middel wordt gedefinieerd als de laagste concentratie van het medicijn dat de cellen in de planktonische cultuur doodt. De MBC-B voor een stam wordt daarentegen bepaald door voorgevormde biofilms gedurende 24 uur bloot te stellen aan toenemende concentraties antimicrobieel middel. De MBC-B wordt gedefinieerd als de laagste concentratie antimicrobieel middel dat de cellen in de biofilm doodt.
Introduction
Antibioticaresistentietesten werden aanvankelijk ontwikkeld om resistentie van planktonische (vrijzwemmende) bacterieculturen te testen. Omdat veel bacteriële infecties biofilms (aan het oppervlak gehechte cellen) omvatten, waren we geïnteresseerd in het ontwikkelen van een methode om biofilmspecifieke antibioticaresistentie te testen. De meeste antibioticaresistentietesten zijn echter slecht geschikt voor het meten van de resistentie van biofilms. Het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) is bijvoorbeeld de gouden standaard voor het bepalen van antibioticaresistentie van planktonische bacterieculturen 1. Deze test houdt in dat een verdunde planktonische cultuur wordt gemengd met een verdunningsreeks antibiotica. De concentratie antibioticum die de zichtbare groei van de planktonische cellen remt, is de MIC. Aangezien deze test afhankelijk is van remming van de groei, kan het per definitie niet werken met biofilmculturen, wat vereist dat de antibioticagevoeligheid van cellen in een voorgekweekte biofilm wordt onderzocht. In plaats van groeiremming te meten, bepaalt de hier beschreven MBC-B-test de concentratie antibioticum die cellen doodt die al in een biofilm bestaan. Deze test is dus bedoeld om antibioticabehandelingen van gevestigde biofilminfecties na te bootsen en een relevanter beeld te geven van de bacteriële antibioticaresistentie in vivo.
Aangezien biofilms over het algemeen antibioticaresistent zijn dan planktonische culturen 2-4, was het noodzakelijk om een methode te bedenken die de antibioticaresistentie van een biofilm rechtstreeks relateert aan die van een planktonische cultuur. Een ander doel van deze methode is dus om het niveau van antibioticaresistentie tussen planktonische en biofilmcellen direct te kunnen vergelijken. De hier beschreven MBC-P en MBC-B assays maken dit mogelijk omdat cellen onder vergelijkbare omstandigheden worden gekweekt. We hebben deze methode gebruikt om verschillende genen te bestuderen die belangrijk zijn voor biofilmspecifieke antibioticaresistentie 5-8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MBC-B
-
Het kweken van een biofilm (aangepast van O'Toole9).
- Kweek een cultuur van de wild-type soort van belang en mutante stam gedurende 16 uur in een rijk medium bij 37 °C.
- Verdun de verzadigde nachtculturen 1:100 tot vers medium voor antibioticaresistentietesten. Een standaardmedium voor P. aeruginosa is M63 minimaal medium aangevuld met magnesiumsulfaat en arginine (zie tabel 1). Dit medium stimuleert de vorming van een robuustere biofilm.
- Voeg 100 μl verdunning per put toe in een 96-wells microtiterschaal (zie tabel 1). Aangezien deze test meestal in drievoud voor elke stam wordt uitgevoerd, moeten er 24 putten van elke stam zijn.
- Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
-
De voorgevormde biofilm blootstellen aan een concentratiegradiënt van antibiotica
- Bereid een 10x verdunningsreeks antibiotica voor 7 putten. Voorbeeld: voor het antibioticum tobramycine zijn de uiteindelijke concentraties in de putten 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 en 0,006 mg/ml 5-8 . Bereid uit een bouillon van 25 mg/ml 10x verdunningen van 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 en 0,06 mg/ml. Laat op ijs.
- Verwijder het verbruikte supernatant (dat planktonische cellen bevat) met behulp van een meerkanaalspipet (zie tabel 1).
- Voeg 90 μl M63 (Mg/Arg) toe aan alle putten.
- Voeg 10 μl van elke 10x antibioticaconcentratie toe om de gewenste eindconcentraties te bereiken. Voeg 10 μl water (geen antibioticacontrole) toe aan de uiteindelijke put voor elke replicate en stam.
- Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
-
Het vernieuwen van de media en het mogelijk maken van het losmaken van levende cellen.
- Verwijder het verbruikte supernatant (dat planktonische cellen bevat) met behulp van een meerkanaals pipet.
- Voeg 115 μl M63 (Mg/Arg) toe aan alle putten.
- Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
-
Test voor levende cellen.
- Label twee LB agar platen per 96-well microtiter plaat.
- Steriliseer het multiprong-apparaat (zie tabel 1)door de tanden in 100% ethanol te dompelen en de tanden over de open vlam van een Bunsen-brander te laten gaan. herhalen. Laat de tanden iets afkoelen. Breng met behulp van het multiprong-apparaat ~ 3 μl (hoeveelheid die meestal op de uiteinden van de tanden wordt bewaard) van planktonische cultuur van elke put van de microtiterplaat naar het oppervlak van een LB-agarplaat.
- Incubeer de LB agar platen gedurende 16 uur bij 37 °C.
- Bepaal de minimale bacteriedodende concentratie van het antibioticum door met het oog de cut-off voor bacteriegroei te identificeren (figuur 1).
2. MBC-P
-
Bacteriële stammen voorbereiden
- Kweek een cultuur van de wild-type soort van belang en mutante stam gedurende 16 uur in een rijk medium bij 37 °C.
- Verdun de verzadigde nachtculturen 1:100 tot vers medium voor antibioticaresistentietesten. Een standaardmedium voor P. aeruginosa is M63 minimaal medium aangevuld met magnesiumsulfaat en arginine (zie tabel 1).
- Voeg 90 μl verdunning per put toe in een 96-wells microtiterschaal (zie tabel 1). Aangezien deze test meestal in drievoud voor elke stam wordt uitgevoerd, moeten er 24 putten van elke stam zijn.
-
Planktonische cellen blootstellen aan een concentratiegradiënt van antibiotica
- Bereid 10x verdunningsreeks antibioticum voor 7 putten. Voorbeeld: voor het antibioticum tobramycine zijn de uiteindelijke concentraties in de putten 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 en 0,0005 mg/ml. Bereid uit een bouillon van 25 mg/ml verdunningen van 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 en 0,005 mg/ml. Laat op ijs.
- Voeg 10 μl van elke 10x antibioticaconcentratie toe om de gewenste eindconcentraties te bereiken. Voeg 10 μl water (geen antibioticacontrole) toe aan de uiteindelijke put voor elke replicate en stam.
- Incubeer de microtiterplaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
-
Test voor levende cellen.
- Label twee LB agar platen per 96-well microtiter plaat.
- Steriliseer het multiprong-apparaat (zie tabel 1)door de tanden in 100% ethanol te dompelen en de tanden over de open vlam van een Bunsen-brander te laten gaan. herhalen. Laat de tanden iets afkoelen. Breng met behulp van het multiprong-apparaat ~ 3 μl (hoeveelheid die meestal op de uiteinden van de tanden wordt bewaard) van planktonische cultuur van elke put van de microtiterplaat naar het oppervlak van een LB-agarplaat.
- Incubeer de LB agar platen gedurende 16 uur bij 37 °C.
- Bepaal de minimale bacteriedodende concentratie van het antibioticum door met het oog de afgesneden bacteriële groei te identificeren (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBC-P- en MBC-B-assays werden uitgevoerd, waarbij de gevoeligheid van het wilde PA14-type werd vergeleken met PA14 ∆ndvB. Tobramycine werd gebruikt als antibioticum. Resultaten die overeenkomen met stap 1.4.4 (figuur 1) en stap 2.3.4 (figuur 2) worden gepresenteerd. PA14 en ∆ndvB werden in drievoud ingeënt in de MBC-P- en MBC-B-assays. Na het voltooien van stap 1.0-1.4 van het MBC-B protocol en stap 2.0-2.3 van het MBC-P protocol werden de levensvatbare cellen op een LB agar plaat geplateerd. Concentraties tobramycine(μg/ml) zijn links van de cellen aangegeven. De MBC-B voor PA14 is 100 μg/ml en de MBC-B voor ∆ndvB is 12,5 μg/ml. De MBC-P voor zowel PA14 als de ∆ndvB mutant is 8 μg/ml.
Figuur 1. Representatieve resultaten van een MBC-B-test met PA14 wild type vs. PA14 ∆ndvB en tobramycine. Waarden hebben betrekking op de uiteindelijke concentratie tobramycine (μg/ml).
Figuur 2. Representatieve resultaten van een MBC-P test met PA14 wild type vs. PA14 ∆ndvB en tobramycine. Waarden hebben betrekking op de uiteindelijke concentratie tobramycine(μg/ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antibioticaresistentie in planktonische cellen wordt gedefinieerd als een toename van de minimale remmende concentratie (MIC) van een antibioticum als gevolg van een permanente verandering in de cellen(bijv. een mutatie). De mechanismen van biofilmspecifieke resistentie of tolerantie die tot nu toe zijn geïdentificeerd, zijn het resultaat van de expressie van wilde genen in biofilms. De klassieke definitie van resistentie is dus niet van toepassing op biofilms. Er is echter een andere reeks definities gepresenteerd: resistentiemechanismen verhinderen dat het antibioticum toegang krijgt tot zijn doel, terwijl tolerantiemechanismen de doelstellingen van antibiotica afsluiten10. Biofilmspecifieke antibioticaresistentiemechanismen omvatten beide definities. De term "resistentie" is in dit protocol gebruikt, maar er moet verder worden geëxperimenteerd om te bepalen of een gen bijdraagt aan resistentie of tolerantie.
De MBC-P- en MBC-B-assays kunnen worden aangepast voor elke biofilmvormende bacteriestam en elk bacteriedodend antimicrobieel middel. De twee belangrijke criteria voor de aanpassing van deze test aan andere bacteriën en andere antimicrobiële agentia zijn het bepalen van omstandigheden die leiden tot biofilmvorming en het bepalen van het juiste concentratiebereik voor het antimicrobiële middel met behulp van de wilde type stam van belang. De juiste biofilmvormingsomstandigheden kunnen worden bepaald met behulp van een JoVE-protocol voor biofilmvorming gepubliceerd door George O'Toole9. Om een geschikt concentratiebereik voor de MBC-B-test te bepalen, is een goede vuistregel om 25 x MIC (minimale remmende concentratie11) als middelste concentratie van het bereik te gebruiken en dienovereenkomstig aan te passen. Gebruik voor de MBC-P-test 1/10 van de waarden die zijn geïdentificeerd voor de MBC-B-test. Het doel is om een reeks concentraties te definiëren die een duidelijk verschil mogelijk maken tussen de MBC-B van de wild-type stam en een gevoelige mutant stam. De bovenkant van het bereik moet dus dicht bij de MBC-B van de wild-type soort liggen. We herhalen dit experiment minstens drie keer, met een minimum van 9 datapunten per stam.
De meest kritische stap van deze test is het voorkomen van besmetting. Om besmetting tussen stammen te voorkomen, moet een lege kolom tussen stammen worden achtergelaten. Een andere cruciale stap is om voldoende tijd te geven voor de metalen tanden op het multiprong-apparaat om voldoende af te koelen. Dit kan worden getest door de tanden te vlammen, de afkoelperiode te timen en de tanden snel met de handen aan te raken.
Als het loskoppelen van de cellen uit de biofilm na blootstelling aan antibiotica een probleem is, kan de MBC-B-methode worden gewijzigd om een sonicatiestap op te nemen. Sla stap 1.3.3 (24 uur incubatie na toevoeging van verse media) over. Bedek in plaats daarvan de putten van de 96-wells microtiterplaat na toevoeging van 115 μl verse media (stap 1.3.2) met steriele plakplaatafdichting en sonicaatplaat om biofilmcellen van de wanden van de putten te scheiden. Gebruik een waterbad sonicator. Specifieke voorwaarden (tijd, intensiteit) voor de efficiënte verwijdering van biofilmcellen uit het plastic moeten vooraf worden bepaald.
Een variant van de MBC-B werd gebruikt om een bibliotheek van 4.000 transposon-insertion mutanten van P. aeruginosa te screenen op biofilm-specifieke antibioticaresistentie mutanten. Er werd gekozen voor een concentratie tobramycine (50 μg/ml) die geen biofilmcellen van het wilde type zou doden, maar de identificatie mogelijk zou maken van mutanten die drie keer gevoeliger waren dan de biofilm van het wilde type. In plaats van kolommen van putten met één specifieke bacteriestam te enten, werd elke put ingeënt met een andere mutant. De mutanten werden achtergelaten om een biofilm te vormen, blootgesteld aan 50 μg/ml tobramycine, achtergelaten om te herstellen van blootstelling aan tobramycine en vervolgens onderzocht op levensvatbaarheid. Mutanten die 50 μblootstelling aan tobramycine niet overleefden, werden opnieuw getest onder dezelfde screeningsomstandigheden. De MBC-P en MBC-B protocollen werden gebruikt om de tobramycine-gevoelige fenotypes van de mutanten te bevestigen.
Er zijn andere methoden om antibioticaresistentie in biofilms te testen, d.w.z. koloniebiofilms en biofilms gekweekt in bioreactoren12,13. Deze methoden zijn aanzienlijk bewerkelijker en beperkter in het aantal stammen dat gemakkelijk kan worden afgekeurd. Een voordeel dat de MBC-B heeft ten opzichte van deze andere methoden is dus dat het een hoge doorvoersnelheid heeft, waardoor de onderzoeker schermen kan uitvoeren of verschillende stammen kan testen, evenals verschillende antibioticaconcentraties tegelijk.
| Naam van het reagens | bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| 1x M63 | Bereid als een 5x M63 voorraad door het oplossen van 15 g KH2PO4,35 g K2HPO4 en 10 g (NH4)2SO4 in 1 L water. Deze voorraad hoeft niet automatisch te worden geclaveerd en kan bij kamertemperatuur worden bewaard. Verdun 5x voorraad 1:5, autoclaaf, koel en voeg vervolgens de gewenste componenten toe. | ||
| KH2PO4 | visser | P285-500 | |
| K2HPO4 | visser | P288-500 | |
| (NH4) 2 ZO4 | sigma | A5132 | |
| Magnesiumsulfaat | visser | M63-500 | Voeg toe aan 1 mM eindconcentratie. Bereid je voor als een voorraad van 1 M in water en autoclaaf. |
| Tobramycine | sigma | Bereid 50 mg/ml bouillon. Aliquot en bewaren bij -20 °C. | |
| arginine | sigma | A5131 | Voeg toe aan 0,4% eindconcentratie. Bereid als een voorraad van 20% in water en filter steriliseren. Deze alternatieve koolstof/energiebron kan glucose- en casaminozuren vervangen |
| 96-well microtiter platen | Corning | 3595 | Steriel, platbodem, lage verdamping |
| Tranferpette (meerkanaals pipet) | BrandTech | 2703610 | 8-kanaals, 20-200 μl |
| Multiprong-apparaat | Dan-Kar | MC48 | 48 tanden passen in 1/2 van een 96-well microtiter plaat |
Tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart dat ze geen concurrerende financiële belangen heeft.
Acknowledgments
De auteur wil Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz en Clayton Hall bedanken voor redactionele hulp bij dit manuscript. Deze test werd oorspronkelijk ontwikkeld in het lab van George O'Toole, Geisel School of Medicine in Dartmouth. Onderzoek in het lab van Dr. Mah wordt ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en Cystic Fibrosis Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
