Summary
Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro à l’aide d’une plaque de microtitre de 96 puits. Les bactéries planctoniques ou biofilms sont exposées à des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix. La viabilité est dosée par croissance sur des plaques de gélose.
Abstract
Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro. Les bactéries sont inoculées dans les puits d’une plaque de microtitre de 96 puits. Dans le cas du test planctonique, des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées aux suspensions bactériennes. Dans le test du biofilm, une fois inoculées, les bactéries sont laissées pour former un biofilm sur une période de temps définie. Les cellules non attachées sont retirées des puits, le milieu est reconstitué et des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées. Après l’exposition à l’agent antimicrobien, les cellules planctoniques sont analysées pour la croissance. Pour le dosage du biofilm, le milieu est rafraîchi avec des milieux frais dépourvus de l’agent antimicrobien et les cellules du biofilm sont laissées à récupérer. La viabilité des cellules du biofilm est analysée après la période de récupération. Le MBC-P pour l’agent antimicrobien est défini comme la plus faible concentration de médicament qui tue les cellules dans la culture planctonique. En revanche, le MBC-B d’une souche est déterminé en exposant des biofilms préformés à des concentrations croissantes d’agent antimicrobien pendant 24 heures. Le MBC-B est défini comme la plus faible concentration d’agent antimicrobien qui tue les cellules du biofilm.
Introduction
Des tests de résistance aux antibiotiques ont été initialement développés pour tester la résistance des cultures planctoniques (nageant librement) de bactéries. Étant donné que de nombreuses infections bactériennes impliquent des biofilms (cellules attachées en surface), nous étions intéressés à développer une méthode pour analyser la résistance aux antibiotiques spécifique au biofilm. Cependant, la plupart des tests de résistance aux antibiotiques sont mal adaptés pour mesurer la résistance des biofilms. Par exemple, la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est la norme de référence pour déterminer la résistance aux antibiotiques des cultures bactériennes planctoniques 1. Ce dosage consiste à mélanger une culture planctonique diluée avec une série de dilutions d’antibiotiques. La concentration d’antibiotique qui inhibe la croissance visible des cellules planctoniques est le MIC. Étant donné que ce test repose sur l’inhibition de la croissance, par définition, il ne peut pas fonctionner avec des cultures de biofilm, ce qui nécessite d’examiner la sensibilité aux antibiotiques des cellules d’un biofilm précroissé. Au lieu de mesurer l’inhibition de la croissance, le test MBC-B décrit ici détermine la concentration d’antibiotique qui tue les cellules déjà existantes dans un biofilm. Ainsi, ce test vise à imiter les traitements antibiotiques des infections à biofilm établies, et à fournir une vue plus pertinente de la résistance bactérienne aux antibiotiques in vivo.
Étant donné que les biofilms sont généralement plus résistants aux antibiotiques que les cultures planctoniques 2-4, il a été nécessaire de concevoir une méthode qui relie directement la résistance aux antibiotiques d’un biofilm à celle d’une culture planctonique. Ainsi, un autre objectif de cette méthode est de pouvoir comparer directement le niveau de résistance aux antibiotiques entre les cellules planctoniques et biofilm. Les essais MBC-P et MBC-B décrits ici rendent cela possible parce que les cellules sont cultivées dans des conditions similaires. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier plusieurs gènes qui sont importants pour la résistance aux antibiotiques spécifiques au biofilm 5-8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MBC-B
-
Cultiver un biofilm (adapté de O’Toole9).
- Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C.
- Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir le tableau 1). Ce milieu stimule la formation d’un biofilm plus robuste.
- Ajouter 100 μl de dilution par puits dans une parabole de microtitre de 96 puits (voir tableau 1). Étant donné que ces essais sont généralement effectués en triple exemplaire pour chaque souche, il devrait y avoir 24 puits de chaque souche.
- Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
-
Exposition du biofilm préformé à un gradient de concentration d’antibiotique
- Préparez une série d’antibiotiques à dilution 10x pour 7 puits. Exemple : pour l’antibiotique tobramycine, les concentrations finales dans les puits sont de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 et 0,006 mg/ml 5-8 . À partir d’un stock de 25 mg/ml, préparer 10x dilutions de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 et 0,06 mg/ml. Laisser sur la glace.
- Retirer le surnageant usé (contenant des cellules planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanal (voir le tableau 1).
- Ajouter 90 μl de M63 (Mg/Arg) à tous les puits.
- Ajouter 10 μl de chaque concentration 10x d’antibiotique afin d’atteindre les concentrations finales souhaitées. Ajouter 10 μl d’eau (sans antibiotique) au puits final pour chaque répétition et souche.
- Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
-
Rafraîchir les médias et permettre le détachement des cellules vivantes.
- Retirez le surnageant usé (contenant des cellules planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanal.
- Ajouter 115 μl de M63 (Mg/Arg) à tous les puits.
- Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
-
Dosage pour les cellules vivantes.
- Étiqueter deux plaques de gélose LB par plaque de microtitration de 96 puits.
- Stériliser le dispositif à plusieurs broches (voir tableau 1)en trempant les broches dans de l’éthanol à 100% et en passant les broches à travers la flamme nue d’un brûleur Bunsen. répéter. Laissez les broches refroidir légèrement. À l’aide du dispositif multiprong, transférer ~3 μl (quantité qui est généralement retenue sur les extrémités des broches) de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitre à la surface d’une plaque de gélose LB.
- Incuber les plaques de gélose LB pendant 16 heures à 37 °C.
- Déterminer la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant, par voie oculaire, le seuil de croissance bactérienne (Figure 1).
2. MBC-P
-
Préparation de souches bactériennes
- Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C.
- Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir le tableau 1).
- Ajouter 90 μl de dilution par puits dans une parabole de microtitre de 96 puits (voir tableau 1). Étant donné que ces essais sont généralement effectués en triple exemplaire pour chaque souche, il devrait y avoir 24 puits de chaque souche.
-
Exposition de cellules planctoniques à un gradient de concentration d’antibiotique
- Préparer une série d’antibiotiques 10x dilution pour 7 puits. Exemple : pour l’antibiotique tobramycine, les concentrations finales dans les puits sont de 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 et 0,0005 mg/ml. À partir d’un stock de 25 mg/ml, préparer des dilutions de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 et 0,005 mg/ml. Laisser sur la glace.
- Ajouter 10 μl de chaque concentration 10x d’antibiotique afin d’atteindre les concentrations finales souhaitées. Ajouter 10 μl d’eau (sans antibiotique) au puits final pour chaque répétition et souche.
- Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
-
Dosage pour les cellules vivantes.
- Étiqueter deux plaques de gélose LB par plaque de microtitration de 96 puits.
- Stériliser le dispositif à plusieurs broches (voir tableau 1)en trempant les broches dans de l’éthanol à 100% et en passant les broches à travers la flamme nue d’un brûleur Bunsen. répéter. Laissez les broches refroidir légèrement. À l’aide du dispositif multiprong, transférer ~3 μl (quantité qui est généralement retenue sur les extrémités des broches) de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitre à la surface d’une plaque de gélose LB.
- Incuber les plaques de gélose LB pendant 16 heures à 37 °C.
- Déterminer la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant, par voie oculaire, la coupure pour la croissance bactérienne (Figure 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Des essais MBC-P et MBC-B ont été effectués, comparant la sensibilité du type sauvage PA14 avec PA14 ∆ndvB. La tobramycine a été utilisée comme antibiotique. Les résultats correspondant à l’étape 1.4.4(figure 1)et à l’étape 2.3.4(figure 2)sont présentés. PA14 et ∆ndvB ont été inoculés dans les essais MBC-P et MBC-B en triple exemplaire. Après avoir terminé les étapes 1.0-1.4 du protocole MBC-B et les étapes 2.0-2.3 du protocole MBC-P, les cellules viables ont été plaquées sur une plaque de gélose LB. Les concentrations de tobramycine (μg/ml) sont indiquées à gauche des cellules. Le MBC-B pour pa14 est de 100 μg/ml et le MBC-B pour ∆ndvB est de 12,5 μg/ml. Le MBC-P pour pa14 et le mutant ∆ndvB est 8 μg/ml.
Figure 1. Résultats représentatifs d’un essai MBC-B avec le type sauvage PA14 contre PA14 ∆ndvB et tobramycine. Les valeurs se réfèrent à la concentration finale de tobramycine (μg/ml).
Figure 2. Résultats représentatifs d’un essai MBC-P avec le type sauvage PA14 contre PA14 ∆ndvB et tobramycine. Les valeurs se réfèrent à la concentration finale de tobramycine (μg/ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La résistance aux antibiotiques dans les cellules planctoniques est définie comme une augmentation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique due à un changement permanent dans les cellules(par exemple, une mutation). Les mécanismes de résistance ou de tolérance spécifiques au biofilm qui ont été identifiés à ce jour sont le résultat de l’expression de gènes de type sauvage dans les biofilms. Ainsi, la définition classique de la résistance ne s’applique pas aux biofilms. Cependant, un autre ensemble de définitions a été présenté: les mécanismes de résistance empêchent l’antibiotique d’accéder à sa cible, tandis que les mécanismes de tolérance arrêtent les cibles des antibiotiques10. Les mécanismes de résistance aux antibiotiques spécifiques au biofilm englobent ces deux définitions. Le terme « résistance » a été utilisé tout au long de ce protocole, mais d’autres expériences doivent être effectuées afin de déterminer si un gène contribue à la résistance ou à la tolérance.
Les essais MBC-P et MBC-B peuvent être adaptés à toute souche bactérienne formant un biofilm et à tout agent antimicrobien bactéricide. Les deux critères importants pour adapter ce test à d’autres bactéries et à d’autres agents antimicrobiens sont la détermination des conditions qui mènent à la formation de biofilm et la détermination de la plage appropriée de concentrations pour l’agent antimicrobien à l’aide de la souche d’intérêt de type sauvage. Les conditions appropriées de formation de biofilm peuvent être déterminées à l’aide d’un protocole de formation de biofilm JoVE publié par George O’Toole9. Afin de déterminer une plage de concentration appropriée pour le test MBC-B, une bonne règle empirique consiste à utiliser 25 x MIC (concentration inhibitrice minimale11)comme concentration moyenne de la gamme et à ajuster en conséquence. Pour le test MBC-P, utilisez 1/10 des valeurs identifiées pour le test MBC-B. L’objectif est de définir une gamme de concentrations qui permettra une nette différence entre le MBC-B de la souche de type sauvage et une souche mutante sensible. Ainsi, l’extrémité supérieure de la gamme doit être proche du MBC-B de la souche de type sauvage. Nous répétons cette expérience au moins trois fois, ce qui donne un minimum de 9 points de données par souche.
L’étape la plus critique de ces tests est d’éviter la contamination. Pour éviter la contamination entre les souches, une colonne vide doit être laissée entre les souches. Une autre étape critique consiste à laisser suffisamment de temps pour que les broches métalliques du dispositif à plusieurs broches refroidissent suffisamment. Cela peut être testé en enflammant les broches, en chronométrant la période de refroidissement et en touchant rapidement les broches avec ses mains.
Si le détachement des cellules du biofilm après une exposition aux antibiotiques est un problème, la méthode MBC-B peut être modifiée pour inclure une étape de sonication. Sauter l’étape 1.3.3 (incubation de 24 heures après l’ajout de milieux frais). Au lieu de cela, couvrez les puits de la plaque de microtitre de 96 puits après avoir ajouté 115 μl de milieux frais (étape 1.3.2) avec un joint de plaque adhésive stérile et une plaque sonique pour déloger les cellules de biofilm des parois des puits. Utilisez un sonicateur de bain-marie. Les conditions spécifiques (temps, intensité) pour l’élimination efficace des cellules de biofilm du plastique doivent être déterminés au préalable.
Une variante du MBC-B a été utilisée pour examiner une bibliothèque de 4 000 mutants transposon-insertion de P. aeruginosa pour les mutants de résistance aux antibiotiques spécifiques au biofilm. On a choisi une concentration de tobramycine (50 μg/ml) qui ne tuerait pas les cellules de biofilm de type sauvage, mais qui permettrait d’identifier des mutants 3 fois plus sensibles que le biofilm de type sauvage. Au lieu d’inoculer des colonnes de puits avec une souche spécifique de bactéries, chaque puits a été inoculé avec un mutant différent. Les mutants ont été laissés pour former un biofilm, exposés à 50 μg/ml de tobramycine, laissés pour récupérer de l’exposition à la tobramycine et ensuite analysés pour la viabilité. Les mutants qui n’ont pas survécu à 50 μexposition g/ml à la tobramycine ont été testés de nouveau dans les mêmes conditions de dépistage. Les protocoles MBC-P et MBC-B ont été utilisés pour confirmer les phénotypes tobramycine-sensibles des mutants.
Il existe d’autres méthodes pour analyser la résistance aux antibiotiques dans les biofilms, c’est-à-dire les biofilms de colonies et les biofilms cultivés dans des bioréacteurs12,13. Ces méthodes sont considérablement plus laborieuses et limitées dans le nombre de souches qui peuvent facilement être analysées. Ainsi, un avantage du MBC-B par rapport à ces autres méthodes est qu’il est à haut débit, permettant au chercheur de mener des dépistages ou de doser plusieurs souches, ainsi que plusieurs concentrations d’antibiotiques différentes à la fois.
| Nom du réactif | compagnie | N° de catalogue | Commentaires (facultatif) |
| 1x M63 | Préparer comme un stock 5x M63 en dissolvant 15 gKH2PO4,35 gK2HPO4 et 10 g (NH4)2SO4dans 1 L d’eau. Ce stock n’a pas besoin d’être autoclavé et peut être stocké à température ambiante. Diluer 5x stock 1:5, autoclave, refroidir, puis ajouter les composants souhaités. | ||
| KH2PO4 | pêcheur | P285-500 | |
| K2HPO4 | pêcheur | P288-500 | |
| (NH4) 2 SO4 | sigma | A5132 | |
| Sulfate de magnésium | pêcheur | M63-500 | Ajouter à 1 mM la concentration finale. Préparez-vous comme un stock de 1 M dans l’eau et l’autoclave. |
| Tobramycine | sigma | Préparer 50 mg/ml de stock. Aliquote et conserver à -20 °C. | |
| arginine | sigma | A5131 | Ajouter à 0,4 % de concentration finale. Préparer comme un stock de 20% dans l’eau et filtrer stériliser. Cette source alternative de carbone/énergie peut remplacer le glucose et les casaminoacides |
| Plaques de microtitration à 96 puits | Corning | 3595 | Stérile, à fond plat, à faible évaporation |
| Tranferpette (pipette multicanal) | BrandTech | 2703610 | 8 canaux, 20-200 μl |
| Dispositif multiprong | Dan-Kar | MC48 | 48 broches s’intègrent dans 1/2 d’une plaque de microtitre de 96 puits |
Tableau 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L’auteur déclare qu’elle n’a pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
L’auteur tient à remercier Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz et Clayton Hall pour leur aide éditoriale dans le cas de ce manuscrit. Ce test a été initialement développé dans le laboratoire de George O’Toole, Geisel School of Medicine à Dartmouth. La recherche dans le laboratoire du Dr Mah est financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et de Fibrose kystique Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
