Summary
Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der mit einer 96-Well-Mikrotiterplatte einen Biofilm in vitro bilden kann. Planktonische oder Biofilmbakterien sind seriellen Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit wird durch das Wachstum auf Agarplatten geprüft.
Abstract
Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der in vitroeinen Biofilm bilden kann. Bakterien werden in die Brunnen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geimpft. Beim planktonischen Assay werden den bakteriellen Suspensionen serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl zugesetzt. Im Biofilm-Assay, einmal geimpft, werden die Bakterien über einen bestimmten Zeitraum zu einem Biofilm zurückgelassen. Nicht angeschlossene Zellen werden aus den Brunnen entfernt, das Medium aufgefüllt und serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl hinzugefügt. Nach der Exposition gegenüber dem antimikrobiellen Mittel werden die planktonischen Zellen auf Wachstum untersucht. Für den Biofilm-Assay werden die Medien mit frischen Medien ohne antimikrobielle Mittel aufgefrischt und die Biofilmzellen müssen sich erholen. Die Lebensfähigkeit von Biofilmzellen wird nach der Erholungsphase geprüft. Das MBC-P für das antimikrobielle Mittel ist definiert als die niedrigste Konzentration von Medikament, das die Zellen in der planktonischen Kultur abtötet. Im Gegensatz dazu wird das MBC-B für einen Stamm bestimmt, indem vorgeformte Biofilme für 24 Stunden erhöhten Konzentrationen antimikrobiellen Mittels aussetzen. Das MBC-B ist definiert als die niedrigste Konzentration an antimikrobiellen Mitteln, die die Zellen im Biofilm abtötet.
Introduction
Antibiotikaresistenz-Assays wurden ursprünglich entwickelt, um die Resistenz von planktonischen (freischwimmenden) Bakterienkulturen zu assayen. Da es sich bei vielen bakteriellen Infektionen um Biofilme (oberflächengebundene Zellen) handelt, waren wir an der Entwicklung einer Methode zum Assay biofilmspezifischer Antibiotikaresistenz interessiert. Die meisten Antibiotikaresistenztests sind jedoch schlecht geeignet, um die Resistenz von Biofilmen zu messen. Beispielsweise ist die Bestimmung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) der Goldstandard für die Bestimmung der Antibiotikaresistenz von planktonischen Bakterienkulturen 1. Dieser Test beinhaltet das Mischen einer verdünnten planktonischen Kultur mit einer Verdünnungsserie von Antibiotika. Die Konzentration von Antibiotika, die das sichtbare Wachstum der planktonischen Zellen hemmt, ist das MIC. Da dieser Test auf wachstumshemmungshzuhemmen ist, kann er per definitionem nicht mit Biofilmkulturen arbeiten, was die Untersuchung der antibiotika-Empfindlichkeit von Zellen in einem vorgewachsenen Biofilm erfordert. Anstatt die Wachstumshemmung zu messen, bestimmt der hier beschriebene MBC-B-Assay die Konzentration von Antibiotika, die bereits in einem Biofilm vorhandene Zellen abtötet. So zielt dieser Test darauf ab, antibiotika-Behandlungen etablierter Biofilminfektionen nachzuahmen und einen relevanteren Überblick über die bakterielle Antibiotikaresistenz in vivozu geben.
Da Biofilme im Allgemeinen antibiotikaresistenter sind als planktonische Kulturen 2-4 , war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die die Antibiotikaresistenz eines Biofilms direkt mit der einer planktonischen Kultur in Beziehung steht. Ein weiteres Ziel dieser Methode ist es, den Grad der Antibiotikaresistenz zwischen planktonischen und Biofilmzellen direkt vergleichen zu können. Die hier beschriebenen MBC-P- und MBC-B-Assays machen dies möglich, da Zellen unter ähnlichen Bedingungen kultiviert werden. Wir haben diese Methode verwendet, um mehrere Gene zu untersuchen, die für die biofilmspezifische Antibiotikaresistenz 5-8 wichtig sind.
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Protocol
1. MBC-B
-
Anbau eines Biofilms (angepasst an O'Toole9).
- Wachsen Sie eine Kultur der wilden Art Stamm von Interesse und mutierte Sorte für 16 Stunden in einem reichen Medium bei 37 °C.
- Verdünnen Sie die gesättigten Nachtkulturen 1:100 in ein frisches Medium für Antibiotikaresistenztests. Ein Standardmedium für P. aeruginosa ist M63 minimal medium ergänzt mit Magnesiumsulfat und Arginin (siehe Tabelle 1). Dieses Medium stimuliert die Bildung eines robusteren Biofilms.
- Fügen Sie 100 l der Verdünnung pro Brunnen in eine 96-Well-Mikrotiterschale ein (siehe Tabelle 1). Da diese Assays in der Regel in Dreifacharbeit für jede Sorte durchgeführt werden, sollte es 24 Brunnen jeder Sorte geben.
- Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
-
Den vorgeformten Biofilm einem Konzentrationsgradienten von Antibiotika aussetzen
- Bereiten Sie eine 10x Verdünnungsserie von Antibiotika für 7 Brunnen vor. Beispiel: Für das Antibiotikum Tobramycin sind die Endkonzentrationen in den Brunnen 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 und 0,006 mg/ml 5-8 . Aus einem Vorrat von 25 mg/ml 10x Verdünnungen von 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 und 0,06 mg/ml zubereiten. Lassen Sie auf Eis.
- Entfernen Sie den verbrauchten Überstand (enthält planktonische Zellen) mit einer Mehrkanalpipette (siehe Tabelle 1).
- Fügen Sie allen Brunnen 90 l M63 (Mg/Arg) hinzu.
- Fügen Sie 10 l jeder 10-fachen Antibiotikakonzentration hinzu, um die gewünschten Endkonzentrationen zu erreichen. Fügen Sie dem endkundierten Brunnen für jede Replikation und jeden Stamm 10 l Wasser (keine Antibiotikakontrolle) hinzu.
- Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
-
Erfrischen der Medien und Ermöglichen der Ablösung von lebenden Zellen.
- Entfernen Sie den verbrauchten Überstand (enthält planktonische Zellen) mit einer Mehrkanalpipette.
- Fügen Sie 115 'l M63 (Mg/Arg) zu allen Brunnen hinzu.
- Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
-
Assay für lebende Zellen.
- Beschriften Sie zwei LB Agarplatten pro 96-Well-Mikrotiterplatte.
- Sterilisieren Sie das Multiprong-Gerät (siehe Tabelle 1), indem Sie die Zinken in 100% Ethanol tauchen und die Zinken über die offene Flamme eines Bunsenbrenners leiten. Wiederholen. Lassen Sie die Zinken leicht abkühlen. Übertragen Sie mit dem Multiprong-Gerät 3 l (Menge, die typischerweise an den Spitzen der Zinken beibehalten wird) der planktonischen Kultur von jedem Brunnen der Mikrotiterplatte auf die Oberfläche einer LB-Agarplatte.
- Die LB-Agarplatten für 16 Stunden bei 37 °C inkubieren.
- Bestimmen Sie die minimale bakterizide Konzentration des Antibiotikums, indem Sie per Auge den Cut-off für das bakterienwachstum identifizieren (Abbildung 1).
2. MBC-P
-
Vorbereitung von Bakterienstämmen
- Wachsen Sie eine Kultur der wilden Art Stamm von Interesse und mutierte Sorte für 16 Stunden in einem reichen Medium bei 37 °C.
- Verdünnen Sie die gesättigten Nachtkulturen 1:100 in ein frisches Medium für Antibiotikaresistenztests. Ein Standardmedium für P. aeruginosa ist M63 minimal medium ergänzt mit Magnesiumsulfat und Arginin (siehe Tabelle 1).
- Fügen Sie 90 l der Verdünnung pro Brunnen in eine 96-Well-Mikrotiterschale ein (siehe Tabelle 1). Da diese Assays in der Regel in Dreifacharbeit für jede Sorte durchgeführt werden, sollte es 24 Brunnen jeder Sorte geben.
-
Planktonzellen einem Konzentrationsgradienten von Antibiotika aussetzen
- Bereiten Sie 10x Verdünnungsserie von Antibiotika für 7 Brunnen. Beispiel: Für das Antibiotikum Tobramycin betragen die Endkonzentrationen in den Brunnen 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 und 0,0005 mg/ml. Aus einem Vorrat von 25 mg/ml Verdünnungen von 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 und 0,005 mg/ml zubereiten. Lassen Sie auf Eis.
- Fügen Sie 10 l jeder 10-fachen Antibiotikakonzentration hinzu, um die gewünschten Endkonzentrationen zu erreichen. Fügen Sie dem endkundierten Brunnen für jede Replikation und jeden Stamm 10 l Wasser (keine Antibiotikakontrolle) hinzu.
- Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
-
Assay für lebende Zellen.
- Beschriften Sie zwei LB Agarplatten pro 96-Well-Mikrotiterplatte.
- Sterilisieren Sie das Multiprong-Gerät (siehe Tabelle 1), indem Sie die Zinken in 100% Ethanol tauchen und die Zinken über die offene Flamme eines Bunsenbrenners leiten. Wiederholen. Lassen Sie die Zinken leicht abkühlen. Übertragen Sie mit dem Multiprong-Gerät 3 l (Menge, die typischerweise an den Spitzen der Zinken beibehalten wird) der planktonischen Kultur von jedem Brunnen der Mikrotiterplatte auf die Oberfläche einer LB-Agarplatte.
- Die LB-Agarplatten für 16 Stunden bei 37 °C inkubieren.
- Bestimmen Sie die minimale bakterizide Konzentration des Antibiotikums, indem Sie per Auge den Schnitt für das Bakterienwachstum identifizieren (Abbildung 2).
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Representative Results
MBC-P- und MBC-B-Assays wurden durchgeführt, um die Empfindlichkeit des PA14-Wildtyps mit PA14 ∆ndvBzu vergleichen. Tobramycin wurde als Antibiotikum verwendet. Die Ergebnisse, die Schritt 1.4.4 (Abbildung 1) und Schritt 2.3.4 (Abbildung 2) entsprechen, werden dargestellt. PA14 und ∆ndvB wurden in die MBC-P- und MBC-B-Assays in dreifacher Ausfertigung geimpft. Nach Abschluss der Schritte 1.0-1.4 des MBC-B-Protokolls und der Schritte 2.0-2.3 des MBC-P-Protokolls wurden die lebensfähigen Zellen auf eine LB-Agarplatte plattiert. Die Konzentrationen von Tobramycin(μg/ml) werden links von den Zellen angezeigt. Der MBC-B für PA14 beträgt 100 μg/ml und der MBC-B für ∆ndvB 12,5 μg/ml. Der MBC-P für PA14 und die ∆ndvB Mutant beträgt 8 μg/ml.
Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse eines MBC-B-Assays mit PA14-Wildtyp vs. PA14 ∆ndvB und Tobramycin. Die Werte beziehen sich auf die Endkonzentration von Tobramycin (g/ml).
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse eines MBC-P-Assays mit PA14-Wildtyp vs. PA14 ∆ndvB und Tobramycin. Die Werte beziehen sich auf die Endkonzentration von Tobramycin(μg/ml).
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Discussion
Antibiotikaresistenz in planktonischen Zellen ist definiert als eine Erhöhung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) eines Antibiotikums aufgrund einer permanenten Veränderung der Zellen(z. B. eine Mutation). Die bisher identifizierten Mechanismen der biofilmspezifischen Resistenz oder Toleranz sind das Ergebnis der Expression wildartiger Gene in Biofilmen. Daher gilt die klassische Definition von Resistenz nicht für Biofilme. Es wurde jedoch eine weitere Reihe von Definitionen vorgelegt: Resistenzmechanismen verhindern, dass das Antibiotikum auf sein Ziel zugreift, während Toleranzmechanismen die Ziele von Antibiotika10abschalten. Biofilmspezifische Antibiotikaresistenzmechanismen umfassen beide Definitionen. Der Begriff "Widerstand" wurde während dieses Protokolls verwendet, aber weitere Experimente müssen durchgeführt werden, um festzustellen, ob ein Gen zu Resistenz oder Toleranz beiträgt.
Die MBC-P- und MBC-B-Assays können für jeden biofilmbildenden Bakterienstamm und jedes bakterizide antimikrobielle Mittel angepasst werden. Die beiden wichtigen Kriterien für die Anpassung dieses Assays an andere Bakterien und andere antimikrobielle Wirkstoffe sind die Bestimmung von Bedingungen, die zur Bildung von Biofilmen führen, und die Bestimmung des geeigneten Konzentrationsbereichs für das antimikrobielle Mittel unter Verwendung des wilden Interessensstamms. Die richtigen Biofilmbildungsbedingungen können mit einem von George O'Toole9veröffentlichten JoVE-Biofilmbildungsprotokoll bestimmt werden. Um einen geeigneten Konzentrationsbereich für den MBC-B-Test zu bestimmen, besteht eine gute Faustregel darin, 25 x MIC (minimale hemmende Konzentration11) als mittlere Konzentration des Bereichs zu verwenden und entsprechend anzupassen. Verwenden Sie für den MBC-P-Test 1/10 der für den MBC-B-Test identifizierten Werte. Das Ziel ist es, einen Bereich von Konzentrationen zu definieren, die einen deutlichen Unterschied zwischen dem MBC-B der Wild-Typ-Sorte und einer empfindlichen mutierten Sorte ermöglichen. Daher sollte das obere Ende des Bereichs in der Nähe des MBC-B der Wild-Typ-Sorte liegen. Wir wiederholen dieses Experiment mindestens dreimal und geben mindestens 9 Datenpunkte pro Dehnung an.
Der wichtigste Schritt dieser Tests ist die Vermeidung von Kontaminationen. Um eine Kontamination zwischen den Stämmen zu vermeiden, sollte eine leere Säule zwischen den Stämmen gelassen werden. Ein weiterer kritischer Schritt ist es, genügend Zeit für die Metallzangen auf dem Multiprong-Gerät zu lassen, um genug zu kühlen. Dies kann getestet werden, indem man die Zinken entflammt, die Kühlzeit timing und die Zinken schnell mit den Händen berührt.
Wenn die Ablösung der Zellen vom Biofilm nach der Exposition gegenüber Antibiotika ein Problem ist, kann die MBC-B-Methode modifiziert werden, um einen Beschallungsschritt einzuschließen. Schritt 1.3.3 überspringen (24 Std. Inkubation nach Zugabe von frischen Medien). Bedecken Sie stattdessen die Brunnen der 96-Well-Mikrotiterplatte, nachdem Sie 115 l Frischmedien (Schritt 1.3.2) mit steriler Klebeplattendichtung und Beschallungsplatte hinzugefügt haben, um Biofilmzellen von den Wänden der Brunnen zu entfernen. Verwenden Sie einen Wasserbad-Sonicator. Spezifische Bedingungen (Zeit, Intensität) für die effiziente Entfernung von Biofilmzellen aus dem Kunststoff müssen vorher bestimmt werden.
Eine Variante des MBC-B wurde verwendet, um eine Bibliothek mit 4.000 Transposon-Insertionmutanten von P. aeruginosa für biofilmspezifische Antibiotikaresistenzmutanten zu überprüfen. Es wurde eine Konzentration von Tobramycin (50 g/ml) gewählt, die keine Biofilmzellen vom Typ Wildtyp abtötet, sondern die Identifizierung von Mutanten ermöglicht, die 3-fach empfindlicher sind als der Wildtyp-Biofilm. Anstatt Brunnensäulen mit einem bestimmten Bakterienstamm zu impfen, wurde jeder Brunnen mit einer anderen Mutante geimpft. Die Mutanten wurden einem Biofilm ausgesetzt, der 50 μg/ml Tobramycin ausgesetzt war, um sich von der Tobramycin-Exposition zu erholen und dann auf Lebensfähigkeit geprüft. Mutanten, die 50 μg/ml Tobramycin-Exposition nicht überlebten, wurden unter den gleichen Screening-Bedingungen erneut getestet. Die Protokolle MBC-P und MBC-B wurden verwendet, um die Tobramycin-empfindlichen Phänotypen der Mutanten zu bestätigen.
Es gibt andere Methoden, um Antibiotikaresistenzen in Biofilmen zu untersuchen, d.h. Koloniebiofilme und Biofilme, die in Bioreaktoren angebaut werden12,13. Diese Methoden sind wesentlich mühsamer und begrenzt in der Anzahl der Stämme, die leicht zu prüfen sind. Ein Vorteil, den das MBC-B gegenüber diesen anderen Methoden hat, ist daher, dass es ein hoher Durchsatz ist, der es dem Forscher ermöglicht, Bildschirme durchzuführen oder mehrere Stämme sowie mehrere verschiedene Antibiotikakonzentrationen gleichzeitig zu assayen.
| Name des Reagenzes | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare (optional) |
| 1x M63 | Bereiten Sie sich als 5x M63 Vorrat vor, indem Sie 15 g KH2PO4,35 gK2HPO4 und 10 g (NH4)2SO4 in 1 L Wasser auflösen. Dieser Lagerbestand muss nicht autoklaviert werden und kann bei Raumtemperatur gelagert werden. 5x Lager 1:5 verdünnen, Autoklaven, abkühlen, dann die gewünschten Komponenten hinzufügen. | ||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| (NH4) 2 SO4 | Sigma | A5132 | |
| Magnesiumsulfat | Fisher | M63-500 | Auf 1 mM Endkonzentration anbringen. Bereiten Sie sich als 1 M Vorrat in Wasser und Autoklaven vor. |
| Tobramycin | Sigma | 50 mg/ml Vorrat zubereiten. Aliquot und lagern bei -20 °C. | |
| Arginin | Sigma | A5131 | Addieren Sie sich auf 0,4% Endkonzentration. Bereiten Sie als 20% Vorrat an Wasser und Filter sterilisieren. Diese alternative Kohlenstoff-/Energiequelle kann Glukose und Casaminosäuren ersetzen |
| 96-Well-Mikrotiterplatten | Corning | 3595 | Steril, flachboden, geringe Verdunstung |
| Tranferpette (Mehrkanalpipette) | BrandTech | 2703610 | 8-Kanal, 20-200 |
| Multiprong-Gerät | Dan-Kar | MC48 | 48 Zangen passen in 1/2 einer 96-Well-Mikrotiterplatte |
Tabelle 1.
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Disclosures
Die Autorin erklärt, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.
Acknowledgments
Der Autor dankt Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz und Clayton Hall für die redaktionelle Hilfe bei diesem Manuskript. Dieser Test wurde ursprünglich im Labor von George O'Toole, Geisel School of Medicine in Dartmouth, entwickelt. Die Forschung in Dr. Mahs Labor wird durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und Cystic Fibrosis Canada unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
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