Summary
Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico che può formare un biofilm in vitro utilizzando una piastra microtitere a 96 pozzoli. I batteri planctonici o biofilm sono esposti a diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. La vitalità è dimostrata dalla crescita sulle piastre di agar.
Abstract
Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico in grado di formare un biofilm in vitro. I batteri vengono inoculati nei pozzi di una piastra di microtitolo da 96 po '. Nel caso del saggio planctonico, alle sospensioni batteriche vengono aggiunte diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. Nel saggio del biofilm, una volta inoculato, i batteri vengono lasciati a formare un biofilm per un determinato periodo di tempo. Le cellule non attaccate vengono rimosse dai pozzi, il supporto viene rifornito e vengono aggiunte diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. Dopo l'esposizione all'agente antimicrobico, le cellule planctoniche vengono studiate per la crescita. Per il saggio del biofilm, il supporto viene rinfrescato con nuovi mezzi privi dell'agente antimicrobico e le cellule del biofilm vengono lasciate recuperare. La vitalità delle cellule biofilm viene saggiata dopo il periodo di recupero. L'MBC-P per l'agente antimicrobico è definito come la più bassa concentrazione di farmaco che uccide le cellule nella coltura planctonica. Al contrario, l'MBC-B per un ceppo è determinato esponendo biofilm preformati ad concentrazioni crescenti di agente antimicrobico per 24 ore. L'MBC-B è definito come la più bassa concentrazione di agente antimicrobico che uccide le cellule nel biofilm.
Introduction
I test di resistenza agli antibiotici sono stati inizialmente sviluppati per saggiare la resistenza delle colture planctoniche (a nuoto libero) dei batteri. Poiché molte infezioni batteriche coinvolgono biofilm (cellule attaccate alla superficie), eravamo interessati a sviluppare un metodo per saggiare la resistenza agli antibiotici specifica del biofilm. Tuttavia, la maggior parte dei test di resistenza agli antibiotici sono poco adatti per misurare la resistenza dei biofilm. Ad esempio, determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) è il gold standard per determinare la resistenza agli antibiotici delle colture batteriche planctoniche 1. Questo saggio comporta la miscelazione di una coltura planctonica diluita con una serie di diluizione di antibiotici. La concentrazione di antibiotico che inibisce la crescita visibile delle cellule planctoniche è il MIC. Poiché questo saggio si basa sull'inibizione della crescita, per definizione, non può funzionare con colture di biofilm, il che richiede l'esame della sensibilità antibiotica delle cellule in un biofilm precarato. Invece di misurare l'inibizione della crescita, il saggio MBC-B qui descritto determina la concentrazione di antibiotici che uccide le cellule già esistenti in un biofilm. Pertanto, questo test mira a imitare i trattamenti antibiotici delle infezioni da biofilm accertate e fornire una visione più pertinente della resistenza agli antibiotici batterici in vivo.
Poiché i biofilm sono generalmente più resistenti agli antibiotici rispetto alle colture planctoniche 2-4 , è stato necessario escogitare un metodo che mette direttamente in relazione la resistenza antibiotica di un biofilm a quella di una coltura planctonica. Quindi un altro obiettivo di questo metodo è quello di essere in grado di confrontare direttamente il livello di resistenza agli antibiotici tra cellule planctoniche e biofilm. I test MBC-P e MBC-B qui descritti lo rendono possibile perché le cellule sono coltivate in condizioni simili. Abbiamo utilizzato questo metodo per studiare diversi geni che sono importanti per la resistenza agli antibiotici specifica del biofilm 5-8 .
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Protocol
1. MBC-B
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Coltivare un biofilm (adattato da O'Toole9).
- Coltiva una cultura del ceppo di interesse di tipo selvaggio e del ceppo mutante per 16 ore in un mezzo ricco a 37 °C.
- Diluire le colture notturne sature 1:100 in mezzo fresco per i test di resistenza agli antibiotici. Un mezzo standard per P. aeruginosa è il mezzo minimo M63 integrato con solfato di magnesio e arginina (vedi tabella 1). Questo mezzo stimola la formazione di un biofilm più robusto.
- Aggiungere 100 μl di diluizione per pozzo in un piatto di microtitolo da 96 po' (vedi tabella 1). Poiché questi saggi vengono in genere eseguiti in triplice copia per ogni ceppo, dovrebbero esserci 24 pozzi di ogni ceppo.
- Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
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Esposizione del biofilm preformato a un gradiente di concentrazione di antibiotici
- Preparare una serie di diluizione 10x di antibiotico per 7 pozzi. Esempio: per la tobramicina antibiotica, le concentrazioni finali nei pozzi sono 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,006 mg/ml 5-8 . Da uno stock di 25 mg/ml, preparare 10 diluizioni di 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,06 mg/ml. Lascia sul ghiaccio.
- Rimuovere il supernatante speso (contenente celle planctoniche) utilizzando una pipetta multicanale (vedere tabella 1).
- Aggiungere 90 μl M63 (Mg/Arg) a tutti i pozzi.
- Aggiungere 10 μl di ogni concentrazione antibiotica 10x per ottenere le concentrazioni finali desiderate. Aggiungere 10 μl di acqua (nessun controllo antibiotico) al pozzo finale per ogni replica e ceppo.
- Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
-
Rinfrescare il supporto e consentire il distacco di cellule vive.
- Rimuovere il supernatante speso (contenente celle planctoniche) utilizzando una pipetta multicanale.
- Aggiungere 115 μl M63 (Mg/Arg) a tutti i pozzi.
- Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
-
Saggio per cellule vive.
- Etichettare due piastre di agar LB per piastra microtiter a 96 pozzo.
- Sterilizzare il dispositivo multiprong (vedi tabella 1) immergere i prong in etanolo al 100% e passare le sporgenze attraverso la fiamma aperta di un bruciatore Bunsen. ripetere. Lascia raffreddare leggermente le sporgenze. Utilizzando il dispositivo multiprong, trasferire ~3 μl (quantità che viene tipicamente trattenuta sulle punte delle punte) della coltura planctonica da ogni pozzo della piastra del microtitolo alla superficie di una piastra di agar LB.
- Incubare le piastre di agar LB per 16 ore a 37 °C.
- Determinare la concentrazione battericida minima dell'antibiotico identificando, a occhio, il taglio per la crescita batterica (Figura 1).
2. MBC-P
-
Preparazione di ceppi batterici
- Coltiva una cultura del ceppo di interesse di tipo selvaggio e del ceppo mutante per 16 ore in un mezzo ricco a 37 °C.
- Diluire le colture notturne sature 1:100 in mezzo fresco per i test di resistenza agli antibiotici. Un mezzo standard per P. aeruginosa è il mezzo minimo M63 integrato con solfato di magnesio e arginina (vedi tabella 1).
- Aggiungere 90 μl di diluizione per pozzo in un piatto di microtitolo da 96 po' (vedi tabella 1). Poiché questi saggi vengono in genere eseguiti in triplice copia per ogni ceppo, dovrebbero esserci 24 pozzi di ogni ceppo.
-
Esposizione delle cellule planctoniche a un gradiente di concentrazione di antibiotici
- Preparare una serie di diluizione 10x di antibiotico per 7 pozzi. Esempio: per la tobramicina antibiotica, le concentrazioni finali nei pozzi sono 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 e 0,0005 mg/ml. Da uno stock di 25 mg/ml, preparare diluizioni di 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 e 0,005 mg/ml. Lascia sul ghiaccio.
- Aggiungere 10 μl di ogni concentrazione antibiotica 10x per ottenere le concentrazioni finali desiderate. Aggiungere 10 μl di acqua (nessun controllo antibiotico) al pozzo finale per ogni replica e ceppo.
- Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
-
Saggio per cellule vive.
- Etichettare due piastre di agar LB per piastra microtiter a 96 pozzo.
- Sterilizzare il dispositivo multiprong (vedi tabella 1) immergere i prong in etanolo al 100% e passare le sporgenze attraverso la fiamma aperta di un bruciatore Bunsen. ripetere. Lascia raffreddare leggermente le sporgenze. Utilizzando il dispositivo multiprong, trasferire ~3 μl (quantità che viene tipicamente trattenuta sulle punte delle punte) della coltura planctonica da ogni pozzo della piastra del microtitolo alla superficie di una piastra di agar LB.
- Incubare le piastre di agar LB per 16 ore a 37 °C.
- Determinare la concentrazione battericida minima dell'antibiotico identificando, a occhio, il taglio per la crescita batterica (Figura 2).
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Representative Results
Sono stati eseguiti saggi MBC-P e MBC-B, confrontando la sensibilità del tipo selvaggio PA14 con PA14 ∆ndvB. La tobramicina è stata usata come antibiotico. Vengono presentati i risultati corrispondenti al passaggio 1.4.4 (Figura 1) e al passaggio 2.3.4 (Figura 2). PA14 e ∆ndvB sono stati inoculati nei saggi MBC-P e MBC-B in triplice copia. Dopo aver completato i passaggi 1.0-1.4 del protocollo MBC-B e i passaggi 2.0-2.3 del protocollo MBC-P, le celle vitali sono state placcate su una piastra di agar LB. Le concentrazioni di tobramicina(μg/ml) sono indicate a sinistra delle cellule. L'MBC-B per PA14 è di 100 μg/ml e l'MBC-B per ∆ndvB è di 12,5 μg/ml. L'MBC-P sia per PA14 che per il ∆mutante ndvB è di 8 μg/ml.
Figura 1. Risultati rappresentativi di un test MBC-B con tipo selvatico PA14 rispetto a PA14 ∆ndvB e tobramicina. I valori si riferiscono alla concentrazione finale di tobramicina (μg/ml).
Figura 2. Risultati rappresentativi di un test MBC-P con tipo selvaggio PA14 rispetto a PA14 ∆ndvB e tobramicina. I valori si riferiscono alla concentrazione finale di tobramicina(μg/ml).
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Discussion
La resistenza agli antibiotici nelle cellule planctoniche è definita come un aumento della concentrazione inibitoria minima (MIC) di un antibiotico a causa di un cambiamento permanente nelle cellule(ad esempio una mutazione). I meccanismi di resistenza o tolleranza specifici del biofilm che sono stati identificati fino ad oggi sono il risultato dell'espressione di geni di tipo selvatico all'interno dei biofilm. Pertanto, la definizione classica di resistenza non si applica ai biofilm. Tuttavia, è stata presentata un'altra serie di definizioni: i meccanismi di resistenza impediscono all'antibiotico di accedere al suo obiettivo, mentre i meccanismi di tolleranza chiudono gli obiettividegli antibiotici 10. I meccanismi di resistenza agli antibiotici specifici del biofilm comprendono entrambe queste definizioni. Il termine "resistenza" è stato usato in tutto questo protocollo, ma devono essere effettuate ulteriori sperimentazioni per determinare se un gene sta contribuendo alla resistenza o alla tolleranza.
I test MBC-P e MBC-B possono essere adattati per qualsiasi ceppo batterico biofilm-forming e qualsiasi agente antimicrobico battericida. I due importanti criteri per adattare questo saggio ad altri batteri e ad altri agenti antimicrobici sono la determinazione delle condizioni che portano alla formazione di biofilm e la determinazione dell'intervallo appropriato di concentrazioni per l'agente antimicrobico utilizzando il ceppo di tipo selvatico di interesse. Le corrette condizioni di formazione del biofilm possono essere determinate utilizzando un protocollo di formazione di biofilm JoVE pubblicato da George O'Toole9. Al fine di determinare un intervallo di concentrazione appropriato per il saggio MBC-B, una buona regola empirica è utilizzare 25 x MIC (concentrazione inibitoria minima11) come concentrazione centrale dell'intervallo e regolarsi di conseguenza. Per il saggio MBC-P, utilizzare 1/10 dei valori identificati per il saggio MBC-B. L'obiettivo è quello di definire una gamma di concentrazioni che consentano una chiara differenza tra l'MBC-B del ceppo di tipo selvaggio e un ceppo mutante sensibile. Pertanto, l'estremità superiore dell'intervallo dovrebbe essere vicina all'MBC-B della varietà di tipo selvaggio. Ripetiamo questo esperimento almeno tre volte, dando un minimo di 9 punti dati per deformazione.
Il passo più critico di questi test è evitare la contaminazione. Per evitare la contaminazione tra ceppi, una colonna vuota deve essere lasciata tra i ceppi. Un altro passo fondamentale è quello di concedere abbastanza tempo per i prong metallici sul dispositivo multiprong per raffreddare abbastanza. Questo può essere testato infiammando le sporgenze, cronometrando il periodo di raffreddamento e toccando rapidamente le sporgenze con le mani.
Se il distacco delle cellule dal biofilm dopo l'esposizione agli antibiotici è un problema, il metodo MBC-B può essere modificato per includere una fase di sonicazione. Saltare il passaggio 1.3.3 (incubazione di 24 ore dopo l'aggiunta di mezzi freschi). Coprire invece i pozzi della piastra microtitere a 96 po' di pozzo dopo aver aggiunto 115 μl di mezzi freschi (fase 1.3.2) con guarnizione sterile della piastra adesiva e piastra sonicata per spodestare le cellule del biofilm dalle pareti dei pozzi. Usa un sonicatore per bagni d'acqua. Le condizioni specifiche (tempo, intensità) per l'efficiente rimozione delle cellule del biofilm dalla plastica devono essere determinate in anticipo.
Una variante dell'MBC-B è stata utilizzata per migliorare una libreria di 4.000 mutanti di inserimento di transposon di P. aeruginosa per mutanti di resistenza agli antibiotici specifici del biofilm. È stata scelta una concentrazione di tobramicina (50 μg/ml) che non ucciderebbe le cellule del biofilm di tipo selvatico, ma consentirebbe l'identificazione di mutanti 3 volte più sensibili del biofilm di tipo selvatico. Invece di inoculare colonne di pozzi con uno specifico ceppo di batteri, ogni pozzo è stato inoculato con un mutante diverso. I mutanti sono stati lasciati a formare un biofilm, esposto a 50 μg/ml di tobramicina, lasciato per riprendersi dall'esposizione alla tobramicina e poi analizzato per la vitalità. I mutanti che non sopravvissero a 50 μ'esposizionealla tobramicina g/ml furono ritestati nelle stesse condizioni di screening. I protocolli MBC-P e MBC-B sono stati utilizzati per confermare i fenotipi sensibili alla tobramicina dei mutanti.
Esistono altri metodi per saggiare la resistenza agli antibiotici nei biofilm, cioè biofilm e biofilm di colonia coltivati in bioreattori12,13. Questi metodi sono considerevolmente più laboriosi e limitati nel numero di ceppi che possono essere facilmente saggiati. Pertanto, un vantaggio che l'MBC-B ha rispetto a questi altri metodi è che è ad alta produttività, consentendo al ricercatore di condurre schermi o di saggiare diversi ceppi, così come diverse concentrazioni di antibiotici contemporaneamente.
| Nome del reagente | società | Numero di catalogo | Commenti (facoltativo) |
| 1x M63 | Preparare come stock 5x M63 sciogliendo 15 g KH2PO4, 35 g K2HPO4 e 10 g (NH4)2SO4 in 1 L di acqua. Questo stock non ha bisogno di essere autoclavato e può essere conservato a temperatura ambiente. Diluire 5x stock 1:5, autoclave, raffreddare, quindi aggiungere i componenti desiderati. | ||
| KH2PO4 | pescatore | P285-500 | |
| K2HPO4 | pescatore | P288-500 | |
| (NH4) 2 la commissione per i SO4 | sigma | A5132 | |
| Solfato di magnesio | pescatore | M63-500 | Aggiungere a 1 mM di concentrazione finale. Preparare come magazzino da 1 M in acqua e autoclave. |
| Tobramicina | sigma | Preparare 50 mg/ml di stock. Aliquota e conservare a -20 °C. | |
| arginina | sigma | A5131 | Aggiungere allo 0,4% la concentrazione finale. Preparare come stock al 20% in acqua e filtrare sterilizzare. Questa fonte alternativa di carbonio/energia può sostituire glucosio e casaminoacidi |
| Piastre microtiter a 96 pozzi | Corning | 3595 | Sterile, a fondo piatto, bassa evaporazione |
| Tranferpette (pipetta multicanale) | BrandTech | 2703610 | 8 canali, 20-200 μl |
| Dispositivo multiprong | Dan-Kar | Mc48 | 48 prong si inseriscono in 1/2 di una piastra microtitere a 96 po |
La tabella 1.
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Disclosures
L'autrice dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
L'autore desidera ringraziare Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz e Clayton Hall per l'aiuto editoriale con questo manoscritto. Questo saggio è stato inizialmente sviluppato nel laboratorio di George O'Toole, Geisel School of Medicine al Dartmouth. La ricerca nel laboratorio del Dr. Mah è supportata da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e della Cistica Fibrosis Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
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