Summary
Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro usando uma placa de microtismo de 96 poços. Bactérias planctônicas ou biofilmes são expostas a diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha. A viabilidade é avaliada pelo crescimento em placas de ágar.
Abstract
Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro. Bactérias são inoculadas nos poços de uma placa de microtismo de 96 poços. No caso do ensaio plantônico, diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas às suspensões bacterianas. No ensaio de biofilme, uma vez inoculado, as bactérias são deixadas para formar um biofilme durante um determinado período de tempo. Células nãoectadas são removidas dos poços, a mídia é reabastecida e diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas. Após a exposição ao agente antimicrobiano, as células planctônicas são avaliadas para o crescimento. Para o ensaio de biofilme, a mídia é atualizada com mídia fresca sem o agente antimicrobiano e as células de biofilm são deixadas para se recuperar. A viabilidade da célula biofilm é avaliada após o período de recuperação. O MBC-P para o agente antimicrobiano é definido como a menor concentração de droga que mata as células na cultura planctônica. Em contrapartida, o MBC-B para uma cepa é determinado expondo biofilmes pré-formados ao aumento das concentrações de agente antimicrobiano por 24 horas. O MBC-B é definido como a menor concentração de agente antimicrobiano que mata as células do biofilme.
Introduction
Ensaios de resistência a antibióticos foram inicialmente desenvolvidos para avaliar a resistência de culturas planctônicas (natação livre) de bactérias. Como muitas infecções bacterianas envolvem biofilmes (células ligadas à superfície), estávamos interessados em desenvolver um método para avaliar a resistência a antibióticos específicos do biofilme. No entanto, a maioria dos ensaios de resistência a antibióticos são pouco adequados para medir a resistência de biofilmes. Por exemplo, determinar a concentração inibitória mínima (MIC) é o padrão-ouro para determinar a resistência a antibióticos das culturas bacterianas planctônicas 1. Este ensaio implica misturar uma cultura plantiônica diluída com uma série de diluição de antibióticos. A concentração de antibiótico que inibe o crescimento visível das células planctônicas é o MIC. Uma vez que este ensaio se baseia na inibição do crescimento, por definição, ele não pode trabalhar com culturas de biofilme, o que requer examinar a sensibilidade antibiótico das células em um biofilme pré-cultivado. Em vez de medir a inibição do crescimento, o ensaio MBC-B descrito aqui determina a concentração de antibiótico que mata células já existentes em um biofilme. Assim, este ensaio visa imitar tratamentos antibióticos de infecções por biofilmes estabelecidas, e fornecer uma visão mais relevante da resistência a antibióticos bacterianos in vivo.
Uma vez que os biofilmes são geralmente mais resistentes a antibióticos do que as culturas planctônicas 2-4, foi necessário elaborar um método que relaciona diretamente a resistência a antibióticos de um biofilme com o de uma cultura planctônica. Assim, outro objetivo deste método é ser capaz de comparar diretamente o nível de resistência a antibióticos entre células planctônicas e biofilmes. Os ensaios MBC-P e MBC-B descritos aqui tornam isso possível porque as células são cultivadas em condições semelhantes. Utilizamos este método para estudar vários genes que são importantes para a resistência a antibióticos específicas de biofilme 5-8 .
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Protocol
1. MBC-B
-
Crescimento de um biofilme (adaptado de O'Toole9).
- Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.
- Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1). Este meio estimula a formação de um biofilme mais robusto.
- Adicione 100 μl da diluição por poço em um prato de microtiter de 96 poços (ver Tabela 1). Uma vez que esses ensaios são tipicamente realizados em triplicado para cada cepa, deve haver 24 poços de cada cepa.
- Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
-
Expondo o biofilme pré-formado a um gradiente de concentração de antibiótico
- Prepare uma série de diluição de 10x de antibiótico para 7 poços. Exemplo: para a tobramicina antibiótico, as concentrações finais nos poços são 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,006 mg/ml 5-8 . A partir de um estoque de 25 mg/ml, prepare diluições de 10x de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,06 mg/ml. Deixe no gelo.
- Remova o supernatante gasto (contendo células planctônicas) usando uma pipeta multicanal (ver Tabela 1).
- Adicione 90 μl M63 (Mg/Arg) a todos os poços.
- Adicione 10 μl de cada concentração de antibiótico de 10x para alcançar as concentrações finais desejadas. Adicione 10 μl de água (sem controle de antibióticos) ao poço final para cada réplica e tensão.
- Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
-
Refrescar a mídia e permitir o desprendimento de células vivas.
- Remova o supernatante gasto (contendo células planctônicas) usando uma pipeta multicanal.
- Adicione 115 μl M63 (Mg/Arg) a todos os poços.
- Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
-
Ensaio para células vivas.
- Rotule duas placas de ágar LB por placa de microtiter de 96 poços.
- Esterilize o dispositivo multifaceto (ver Tabela 1) mergulhando as pontas em 100% etanol e passando as pontas através da chama aberta de um queimador de Bunsen. repetir. Deixe as pontas esfriarem ligeiramente. Usando o dispositivo multifacetado, transfira ~3 μl (quantidade que normalmente é retida nas pontas das pontas) da cultura planctônica de cada poço da placa de microtítmetro para a superfície de uma placa de ágar LB.
- Incubar as placas de ágar LB por 16 horas a 37 °C.
- Determine a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando, por olho, o corte para o crescimento bacteriano(Figura 1).
2. MBC-P
-
Preparando cepas bacterianas
- Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.
- Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1).
- Adicione 90 μl da diluição por poço em um prato de microtiter de 96 poços (ver Tabela 1). Uma vez que esses ensaios são tipicamente realizados em triplicado para cada cepa, deve haver 24 poços de cada cepa.
-
Expondo células planctônicas a um gradiente de concentração de antibiótico
- Prepare a série de diluição de 10x de antibiótico para 7 poços. Exemplo: para a tobramicina antibiótico, as concentrações finais nos poços são 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 e 0,0005 mg/ml. A partir de um estoque de 25 mg/ml, prepare diluições de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 e 0,005 mg/ml. Deixe no gelo.
- Adicione 10 μl de cada concentração de antibiótico de 10x para alcançar as concentrações finais desejadas. Adicione 10 μl de água (sem controle de antibióticos) ao poço final para cada réplica e tensão.
- Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
-
Ensaio para células vivas.
- Rotule duas placas de ágar LB por placa de microtiter de 96 poços.
- Esterilize o dispositivo multifaceto (ver Tabela 1) mergulhando as pontas em 100% etanol e passando as pontas através da chama aberta de um queimador de Bunsen. repetir. Deixe as pontas esfriarem ligeiramente. Usando o dispositivo multifacetado, transfira ~3 μl (quantidade que normalmente é retida nas pontas das pontas) da cultura planctônica de cada poço da placa de microtítmetro para a superfície de uma placa de ágar LB.
- Incubar as placas de ágar LB por 16 horas a 37 °C.
- Determinar a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando, por olho, o corte para o crescimento bacteriano(Figura 2).
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Representative Results
Foram realizados ensaios MBC-P e MBC-B, comparando a sensibilidade do tipo selvagem PA14 com o PA14 ∆ndvB. A tobramicina foi usada como antibiótico. São apresentados resultados correspondentes à etapa 1.4.4 (Figura 1) e à etapa 2.3.4 (Figura 2). PA14 e ∆ndvB foram inoculados nos ensaios MBC-P e MBC-B em triplicado. Após a conclusão das etapas 1.0-1.4 do protocolo MBC-B e as etapas 2.0-2.3 do protocolo MBC-P, as células viáveis foram emplacar em uma placa de ágar LB. Concentrações de tobramicina(μg/ml) são indicadas à esquerda das células. O MBC-B para PA14 é de 100 μg/ml e o MBC-B para ∆ndvB é de 12,5 μg/ml. O MBC-P tanto para PA14 quanto para o mutante ∆ndvB é de 8 μg/ml.
Figura 1. Resultados representativos de um ensaio MBC-B com tipo selvagem PA14 vs. PA14 ∆ndvB e tobramicina. Os valores referem-se à concentração final de tobramicina (μg/ml).
Figura 2. Resultados representativos de um ensaio MBC-P com tipo selvagem PA14 vs. PA14 ∆ndvB e tobramycina. Os valores referem-se à concentração final de tobramicina(μg/ml).
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Discussion
A resistência a antibióticos em células planctônicas é definida como um aumento na concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico devido a uma mudança permanente nas células (por exemplo, uma mutação). Os mecanismos de resistência ou tolerância específicas de biofilmes que foram identificados até hoje são o resultado da expressão de genes do tipo selvagem dentro de biofilmes. Assim, a definição clássica de resistência não se aplica a biofilmes. No entanto, outro conjunto de definições foi apresentado: mecanismos de resistência impedem que o antibiótico acesse seu alvo, enquanto mecanismos de tolerância desligam as metas de antibióticos10. Os mecanismos de resistência a antibióticos específicos para biofilmes abrangem ambas as definições. O termo "resistência" tem sido usado ao longo deste protocolo, mas novas experiências devem ser realizadas para determinar se um gene está contribuindo para a resistência ou tolerância.
Os ensaios MBC-P e MBC-B podem ser adaptados para qualquer cepa bacteriana formadora de biofilmes e qualquer agente antimicrobiano bactericidal. Os dois critérios importantes para adaptar este ensaio a outras bactérias e outros agentes antimicrobianos são determinar condições que levem à formação de biofilmes e determinar a faixa apropriada de concentrações para o agente antimicrobiano usando a cepa de interesse do tipo selvagem. Condições adequadas de formação de biofilmes podem ser determinadas usando um protocolo de formação de biofilme JoVE publicado por George O'Toole9. Para determinar uma faixa de concentração adequada para o ensaio MBC-B, uma boa regra é usar 25 x MIC (concentração inibitória mínima11) como a concentração média da faixa e ajustar-se em conformidade. Para o ensaio MBC-P, utilize 1/10 dos valores identificados para o ensaio MBC-B. O objetivo é definir uma série de concentrações que permitirão uma clara diferença entre o MBC-B da cepa do tipo selvagem e uma cepa mutante sensível. Assim, a extremidade superior da faixa deve estar próxima do MBC-B da cepa tipo selvagem. Repetimos este experimento pelo menos três vezes, dando um mínimo de 9 pontos de dados por cepa.
O passo mais crítico desses ensaios é evitar a contaminação. Para evitar contaminação entre cepas, deve-se deixar uma coluna vazia entre as cepas. Outro passo crítico é dar tempo suficiente para que as pinças metálicas no dispositivo multifaceto esfriem o suficiente. Isso pode ser testado inflamando as pontas, cronometrando o período de resfriamento e tocando rapidamente as pontas com as mãos.
Se o descolamento das células do biofilme após a exposição a antibióticos for um problema, o método MBC-B pode ser modificado para incluir uma etapa de sônica. Pule a etapa 1.3.3 (incubação de 24 horas após a adição de mídia fresca). Em vez disso, cubra os poços da placa de microtíter de 96 poços depois de adicionar 115 μl de mídia fresca (passo 1.3.2) com selo de placa adesiva estéril e placa sônica para desalojar células de biofilme das paredes dos poços. Use um sonicator de banho de água. Condições específicas (tempo, intensidade) para a remoção eficiente das células biofilmes do plástico devem ser determinantes.
Uma variação do MBC-B foi usada para examinar uma biblioteca de 4.000 mutantes de inserção transposon de P. aeruginosa para mutantes de resistência a antibióticos específicos de biofilme. Foi escolhida uma concentração de tobramicina (50 μg/ml) que não mataria células de biofilm do tipo selvagem, mas permitiria a identificação de mutantes 3 vezes mais sensíveis do que o biofilme do tipo selvagem. Em vez de inocular colunas de poços com uma variedade específica de bactérias, cada poço foi inoculado com um mutante diferente. Os mutantes foram deixados para formar um biofilme, exposto a 50 μtobramicina g/ml, deixado para se recuperar da exposição à tobramicina e, em seguida, testado para viabilidade. Mutantes que não sobreviveram a 50 μexposição à tobramicina g/ml foram retestados sob as mesmas condições de triagem. Os protocolos MBC-P e MBC-B foram utilizados para confirmar os fenótipos sensíveis à tobramicina dos mutantes.
Existem outros métodos para avaliar a resistência a antibióticos em biofilmes, ou seja, biofilmes de colônias e biofilmes cultivados em bioreatores12,13. Esses métodos são consideravelmente mais trabalhosos e limitados no número de cepas que podem ser facilmente avaliadas. Assim, uma vantagem que o MBC-B tem sobre esses outros métodos é que ele é de alto rendimento, permitindo ao pesquisador realizar telas ou avaliar várias cepas, bem como várias concentrações diferentes de antibióticos ao mesmo tempo.
| Nome do reagente | companhia | Número do catálogo | Comentários (opcional) |
| 1x M63 | Prepare-se como um estoque 5x M63 dissolvendo 15 g KH2PO4, 35 g K2HPO4 e 10 g (NH4)2SO4 em 1 L de água. Este estoque não precisa ser autoclaved e pode ser armazenado à temperatura ambiente. Diluir 5x de estoque 1:5, autoclave, esfriar, em seguida, adicione os componentes desejados. | ||
| KH2PO4 | pescador | P285-500 | |
| K2HPO4 | pescador | P288-500 | |
| (NH4) 2 ENTÃO4 | sigma | A5132 | |
| Sulfato de magnésio | pescador | M63-500 | Adicione a 1 mM de concentração final. Prepare-se como um estoque de 1 M em água e autoclave. |
| Tobramicina | sigma | Prepare 50 mg/ml de estoque. Aliquot e armazenar a -20 °C. | |
| arginina | sigma | A5131 | Adicione a 0,4% de concentração final. Prepare-se como um estoque de 20% em água e o filtro esterilizar. Esta fonte alternativa de carbono/energia pode substituir glicose e casaminoácidos |
| Placas de microtétmetro de 96 poços | Corning | 3595 | Estéril, fundo plano, baixa evaporação |
| Tranferpette (pipeta multicanal) | BrandTech | 2703610 | 8 canais, 20-200 μl |
| Dispositivo multifaceto | Dan-Kar | MC48 | 48 pinos se encaixam em 1/2 de uma placa de microtiter de 96 poços |
Mesa 1.
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Disclosures
A autora declara que não tem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O autor gostaria de agradecer li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz, e Clayton Hall para ajuda editorial com este manuscrito. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido no laboratório de George O'Toole, Geisel School of Medicine em Dartmouth. A pesquisa no laboratório do Dr. Mah é apoiada por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e da Fibrose Cística do Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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