Summary
Этот протокол позволяет проконтриктное и биопленоконное сопротивление бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro с помощью 96-ну микротитрной пластины. Планктонные или биопленопленовиты подвергаются серийным разбавлениям противомикробного агента по выбору. Жизнеспособность можно посвястить росту на агарных пластинах.
Abstract
Этот протокол позволяет пропрямить сопротивление планктонного и биопленки бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro. Бактерии прививаются в колодцы 96-ну микротитр пластины. В случае планктонного анализа к бактериальным суспензиям добавляются серийные разбавления противомикробного агента по своему выбору. В анализе биопленки, после прививки, бактерии остаются для формирования биопленки в течение определенного периода времени. Из колодцев удаляются незакрепленные клетки, пополняются средства массовой информации и добавляются серийные разбавления антимикробного агента по выбору. После воздействия противомикробного агента, планктонные клетки проецированы для роста. Для анализа биопленки, средства массовой информации обновляется со свежими средствами массовой информации не хватает противомикробного агента и биопленки клетки остаются для восстановления. Жизнеспособность биопленоплено-клеток анализуется после периода восстановления. MBC-P для противомикробного агента определяется как самая низкая концентрация препарата, который убивает клетки в планктонной культуре. В отличие от этого, MBC-B для штамма определяется путем подвергая предварительной биопленки для увеличения концентрации противомикробного агента в течение 24 часов. MBC-B определяется как самая низкая концентрация противомикробного агента, который убивает клетки в биопленки.
Introduction
Анализ устойчивости к антибиотикам был первоначально разработан для анализа устойчивости планктонных (свободно плавающих) культур бактерий. Поскольку многие бактериальные инфекции связаны с биопленкой (поверхностными клетками), мы были заинтересованы в разработке метода анализа биопленки-специфической устойчивости к антибиотикам. Тем не менее, большинство анализов устойчивости к антибиотикам плохо подходят для измерения устойчивости биопленок. Например, определение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) является золотым стандартом для определения устойчивости к антибиотикам планктонных бактериальных культур 1. Этот анализ влечет за собой смешивание разбавленной планктонной культуры с разбавляя ряд антибиотиков. Концентрация антибиотика, который подавляет видимый рост планктонных клеток является MIC. Поскольку этот анализ опирается на ингибирование роста, по определению, он не может работать с культурами биопленки, что требует изучения чувствительности клеток к антибиотикам в предварительной биопленки. Вместо измерения ингибирования роста, анализ MBC-B, описанный здесь, определяет концентрацию антибиотика, который убивает клетки, уже существующие в биопленки. Таким образом, этот анализ направлен на имитацию лечения антибиотиками установленных биопленоплено инфекций, и обеспечить более релевантное представление о бактериальной устойчивости к антибиотикам in vivo.
Поскольку биопленки, как правило, более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные культуры 2-4, необходимо было разработать метод, который непосредственно связывает устойчивость к антибиотикам биопленки с планктонной культурой. Таким образом, еще одна цель этого метода заключается в том, чтобы иметь возможность напрямую сравнить уровень устойчивости к антибиотикам между планктонными и биопленочные клетки. Анализы MBC-P и MBC-B, описанные здесь, делают это возможным, потому что клетки культуризуются в аналогичных условиях. Мы использовали этот метод для изучения нескольких генов, которые имеют важное значение для биопленки конкретных устойчивости к антибиотикам 5-8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MBC-B
-
Выращивание биопленки (адаптировано от O'Toole9).
- Выращиваем культуру дикого типа штамма интереса и мутантного штамма в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия.
- Разбавить насыщенных ночных культур 1:100 в свежей среде для анализа устойчивости к антибиотикам. Стандартной средой для P. aeruginosa является минимальная среда M63, дополненная сульфатом магния и аргинином (см. таблицу 1). Эта среда стимулирует образование более надежной биопленки.
- Добавьте 100 мкл разбавления на колодец в блюде из микротитров 96-колодец (см. таблицу 1). Так как эти анализы, как правило, выполняются в три раза для каждого штамма, должно быть 24 скважин каждого штамма.
- Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
-
Воздействие предварительной биопленки на градиент концентрации антибиотиков
- Приготовьте 10-х разбавляя ряд антибиотиков для 7 скважин. Пример: для антибиотика тобрамицин, окончательные концентрации в скважинах 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, и 0,006 мг / мл 5-8 . Из бульона 25 мг/мл приготовьте 10x разбавления 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 и 0,06 мг/мл. Оставьте на льду.
- Удалите оттягченный супернатант (содержащий планктонные клетки) с помощью многоканальной пипетки (см. таблицу 1).
- Добавьте 90 хл M63 (Mg/Arg) ко всем скважинам.
- Добавьте 10 мкл из каждой 10-х концентрации антибиотиков для достижения желаемых окончательных концентраций. Добавьте 10 мл воды (без контроля антибиотиков) к окончательному хорошо для каждого репликации и деформации.
- Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
-
Обновление средств массовой информации и предоставление отряда живых клеток.
- Удалите оттяченный супернатант (содержащий планктонные клетки) с помощью многоканальной пипетки.
- Добавьте 115 мкл M63 (Mg/Arg) ко всем скважинам.
- Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
-
Анализ живых клеток.
- Этикетка две пластины LB агар на 96-ну микротитр пластины.
- Стерилизовать устройство с мультипронгом (см. таблицу 1),окунув зубцы в 100% этанола и пройдя зубцы через открытое пламя горелки Bunsen. повторять. Пусть зубцы немного остыть. Используя устройство с мультипронгом, перенесите 3 мкл (количество, которое обычно сохраняется на кончиках зубцов) планктонной культуры из каждой колодец пластины микротитров на поверхность пластины LB agar.
- Инкубировать пластины LB агар в течение 16 часов при 37 градусов по Цельсию.
- Определите минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определив, глаз, отрез для роста бактерий(рисунок 1).
2. MBC-P
-
Подготовка бактериальных штаммов
- Выращиваем культуру дикого типа штамма интереса и мутантного штамма в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия.
- Разбавить насыщенных ночных культур 1:100 в свежей среде для анализа устойчивости к антибиотикам. Стандартной средой для P. aeruginosa является минимальная среда M63, дополненная сульфатом магния и аргинином (см. таблицу 1).
- Добавьте 90 мкл разбавления на колодец в блюде из микротитров 96-колодец (см. таблицу 1). Так как эти анализы, как правило, выполняются в три раза для каждого штамма, должно быть 24 скважин каждого штамма.
-
Воздействие планктонных клеток на концентрационный градиент антибиотиков
- Подготовка 10x разбавления серии антибиотиков для 7 скважин. Пример: для антибиотика тобрамицин, окончательные концентрации в скважинах 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 и 0,0005 мг/мл. Из бульона 25 мг/мл, подготовить разбавления 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 и 0,005 мг/мл. Оставьте на льду.
- Добавьте 10 мкл из каждой 10-х концентрации антибиотиков для достижения желаемых окончательных концентраций. Добавьте 10 мл воды (без контроля антибиотиков) к окончательному хорошо для каждого репликации и деформации.
- Инкубировать пластину микротитр в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию.
-
Анализ живых клеток.
- Этикетка две пластины LB агар на 96-ну микротитр пластины.
- Стерилизовать устройство с мультипронгом (см. таблицу 1),окунув зубцы в 100% этанола и пройдя зубцы через открытое пламя горелки Bunsen. повторять. Пусть зубцы немного остыть. Используя устройство с мультипронгом, перенесите 3 мкл (количество, которое обычно сохраняется на кончиках зубцов) планктонной культуры из каждой колодец пластины микротитров на поверхность пластины LB agar.
- Инкубировать пластины LB агар в течение 16 часов при 37 градусов по Цельсию.
- Определите минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определив, глаз, отрезанный для роста бактерий(рисунок 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были проведены анализы MBC-P и MBC-B, сравнивая чувствительность дикого типа PA14 с PA14 ∆ndvB. Тобрамицин использовался в качестве антибиотика. Представлены результаты, соответствующие шагу 1.4.4(рисунок 1)и шагу 2.3.4(рисунок 2). PA14 и ∆ndvB были привиты в MBC-P и MBC-B анализы в три раза. После завершения шагов 1.0-1.4 протокола MBC-B и шагов 2.0-2.3 протокола MBC-P, жизнеспособные ячейки были поцарапывались на пластине Агара LB. Концентрации тобрамицина(μг/мл) показаны слева от клеток. MBC-B для PA14 составляет 100 г/мл μг/мл, а MBC-B для ∆ndvB составляет 12,5 г μг/мл. MBC-P как для PA14, так и для ∆ndvB-мутанта составляет 8 μг/мл.
Рисунок 1. Репрезентативные результаты анализа MBC-B с диким типом PA14 против PA14 ∆ndvB и тобрамицином. Значения относятся к окончательной концентрации тобрамицина (мкг/мл).
Рисунок 2. Репрезентативные результаты анализа MBC-P с диким типом PA14 против PA14 ∆ndvB и тобрамицином. Значения относятся к окончательной концентрации тобрамицина(μг/мл).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устойчивость к антибиотикам в планктонных клетках определяется как увеличение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) антибиотика из-за постоянного изменения клеток(например, мутации). Выявленные на сегодняшний день механизмы биопленки или толерантности являются результатом экспрессии генов дикого типа в биопленки. Таким образом, классическое определение резистентности не применяется к биопленки. Тем не менее, был представлен другой набор определений: механизмы устойчивости не позволяют антибиотику получить доступ к своей цели, в то время как механизмы толерантности закрывают целевые показателиантибиотиков 10. Механизмы устойчивости к антибиотикам, специфичные для биопленки, охватывают оба этих определения. Термин "сопротивление" используется на протяжении всего этого протокола, но дальнейшие эксперименты должны быть проведены для того, чтобы определить, если ген способствует устойчивости или терпимости.
Анализы MBC-P и MBC-B могут быть адаптированы для любого биопленообразующего бактериального штамма и любого бактерицидного противомикробного агента. Двумя важными критериями для адаптации этого анализа к другим бактериям и другим противомикробным препаратам являются определение условий, которые приводят к образованию биопленки, и определение соответствующего диапазона концентраций противомикробного агента с использованием штамма дикого типа, представляющих интерес. Правильные условия формирования биопленки могут быть определены с помощью протокола формирования биопленки JoVE, опубликованного Джорджем О'Тулом9. Для того, чтобы определить соответствующий диапазон концентрации для анализа MBC-B, хорошим правилом является использование 25 х MIC (минимальная ингибирующаяконцентрация 11) в качестве средней концентрации диапазона и соответствующим образом настроить. Для анализа MBC-P используйте 1/10 значений, идентифицированных для анализа MBC-B. Цель состоит в том, чтобы определить диапазон концентраций, которые позволят четкое различие между MBC-B штамма дикого типа и чувствительных мутант штаммов. Таким образом, верхний конец диапазона должен быть близок к MBC-B штамма дикого типа. Мы повторяем этот эксперимент по крайней мере три раза, давая как минимум 9 точек данных на штамм.
Наиболее важным шагом этих анализов является избежание загрязнения. Чтобы предотвратить загрязнение между штаммами, пустой столбец должен быть оставлен между штаммами. Другим важным шагом является, чтобы дать достаточно времени для металлических зубцов на многопронговом устройстве, чтобы охладиться достаточно. Это может быть проверено пылающими зубцами, периодом охлаждения синхронизации и быстро касанием зубцов руками.
Если отделение клеток от биопленки после воздействия антибиотиков является проблемой, метод MBC-B может быть изменен, чтобы включить звуковой шаг. Пропустить шаг 1.3.3 (24 часа инкубации после добавления свежих средств массовой информации). Вместо этого, покройте скважины 96-ну микротитр пластины после добавления 115 мкл свежих средств массовой информации (шаг 1.3.2) с стерильной клея пластины уплотнения и sonicate пластины выбить биопленочных клеток из стенок скважин. Используйте звуковую ванну для водяной ванны. Конкретные условия (время, интенсивность) для эффективного удаления биопленочные клетки из пластика должны быть определить заранее.
Вариация MBC-B была использована для проверки библиотеки из 4000 транспосон-вставки мутантов P. aeruginosa для биопленки конкретных антибиотиков устойчивость мутантов. Была выбрана концентрация тобрамицина (50 мкг/мл), который не будет убивать биопленочные клетки дикого типа, но позволит идентифицировать мутантов, которые в 3 раза более чувствительны, чем биопленка дикого типа. Вместо инокулирующих колонн колодцев с одним специфическим штаммом бактерий, каждая скважина была привита с другим мутантом. Мутанты были оставлены для формирования биопленки, подвергаются 50 μ г/ мл тобрамицина, осталось оправиться от воздействия тобрамицина, а затем анализ на жизнеспособность. Мутанты, не пережившие 50 μг/мл тобрамицина, были повторно протестированы в тех же условиях скрининга. Протоколы MBC-P и MBC-B были использованы для подтверждения фенотипов мутантов, чувствительных к тобрамицину.
Существуют и другие методы анализа устойчивости к антибиотикам в биопленки, т.е. колонии биопленки и биопленки, выращенные вбиореакторах 12,13. Эти методы значительно более трудоемким и ограниченным в количестве штаммов, которые могут быть легко анализированы. Таким образом, преимущество MBC-B имеет по сравнению с этими другими методами является то, что это высокая пропускная способность, что позволяет исследователю проводить экраны или провести анализ нескольких штаммов, а также несколько различных концентраций антибиотиков в одно время.
| Название реагента | компания | Номер каталога | Комментарии (необязательно) |
| 1x M63 | Подготовка в качестве 5x M63 бульон путем растворения 15 г KH2PO4, 35 г K2HPO4 и 10 г (NH4)2SO4 в 1 л воды. Этот запас не нуждается в автоклаве и может храниться при комнатной температуре. Разбавить 5x бульон 1:5, автоклав, охладить, затем добавить нужные компоненты. | ||
| KH2PO4 | рыбак | P285-500 | |
| K2HPO4 | рыбак | P288-500 | |
| (NH4) 2 М.В. ИТАК4 | сигма | A5132 | |
| Сульфат магния | рыбак | M63-500 | Добавьте к 1 мМ конечной концентрации. Подготовка в качестве 1 М запасов в воде и автоклаве. |
| Тобрамицин | сигма | Приготовить бульон 50 мг/мл. Aliquot и хранить при -20 градусов по Цельсию. | |
| аргинин | сигма | A5131 | Добавьте к 0,4% окончательную концентрацию. Подготовка в качестве 20% запасов в воде и фильтр стерилизовать. Этот альтернативный источник углерода/энергии может заменить глюкозу и кислоты казамино |
| 96-ну микротитр пластин | Корнин | 3595 | Стерильное, плоское дно, низкое испарение |
| Транферпетт (многоканальный пипетка) | БрандТех | 2703610 | 8-канал, 20-200 мкл |
| Устройство multiprong | Дэн-Кар | MC48 | 48 зубцов вписываются в 1/2 96-хорошо микротитр пластины |
Таблица 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет, что у нее нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Автор хотел бы поблагодарить Ли Чжан, Сянь-Чжи Ли, Аарона Хинца и Клейтона Холла за редакционную помощь в этой рукописи. Этот анализ был первоначально разработан в лаборатории Джорджа О'Тула, Гейзельской медицинской школы в Дартмуте. Исследования в лаборатории доктора Ма поддерживается грантами от Природных наук и Инженерных исследований Совета Канады и муковисцидоз Канады.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
